專利名稱：利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素廣泛存在于植物細(xì)胞中，是自然界中含量最多的有機(jī)可再生資源，在植物體內(nèi)，木質(zhì)素通過(guò)化學(xué)鍵與半纖維素連接然后包裹在纖維素之外，形成木質(zhì)纖維素，木質(zhì)素與纖維素一起構(gòu)成植物骨架的主要成分。木質(zhì)素由于具有各種生物學(xué)穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型而不易被微生物降解。要解決如何高效的利用木質(zhì)纖維素這個(gè)問(wèn)題，關(guān)鍵在于如何降解包裹在纖維素晶體外面的木質(zhì)素以及半纖維素，從而增加纖維素表面積、使纖維素易于降解和利用。傳統(tǒng)的理化方法大概可以去掉50%的木質(zhì)素，并使纖維成為非結(jié)晶態(tài)，但是成本較高，需要昂貴的專業(yè)設(shè)備并消耗大量的能源，而且容易造成二次污染，而生物預(yù)處理具有能耗低、操作簡(jiǎn)單以及不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視。人們發(fā)現(xiàn)的能降解木質(zhì)素的微生物主要是真菌，關(guān)于真菌能夠降解木質(zhì)素，大多認(rèn)為其能產(chǎn)生一些降解木質(zhì)素酶?，F(xiàn)有技術(shù)中研究較多，降解能力較強(qiáng)的酶主要有木質(zhì)素過(guò)氧化酶、錳依賴過(guò)氧化物酶和漆酶。除了上述3中重要的酶外，其他的如葡萄糖氧化酶、 過(guò)氧化氫酶及一些還原酶和蛋白酶等都參與或?qū)δ举|(zhì)素的降解有一定的影響?，F(xiàn)有技術(shù)中降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌種類(lèi)很多，放線菌是公認(rèn)的降解能力較強(qiáng)的一類(lèi)絲狀細(xì)菌，包括鏈霉菌、節(jié)桿菌、小單胞菌、諾卡氏菌等。綜上所述，目前人們主要集中在單個(gè)菌株的篩選，要么研究木質(zhì)素降解菌，要么研究纖維素降解菌，尚未發(fā)現(xiàn)效果較好的復(fù)合菌群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法。其技術(shù)方案為一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法，本發(fā)明篩選了復(fù)合菌群，另外也協(xié)同白腐菌，還篩選了青貯菌群，以實(shí)現(xiàn)棉稈青貯，解決南疆的粗飼料不足， 變廢為寶，實(shí)現(xiàn)種養(yǎng)結(jié)合的模式。包括以下步驟(1)降解棉稈木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的篩選1)將從新鮮牛糞為MGO、堆肥為MGl、棉花地耕作層土壤0 40cm為MG2和瘤胃液中取來(lái)的樣品為MG3，各取5g/mL加入到100ml PCS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，靜止，CO2培養(yǎng)箱
中培養(yǎng)。2)待纖維素崩解以后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的PCS培養(yǎng)液中，接種量為10% (ν/ν)，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物，留下分解能力強(qiáng)的培養(yǎng)物，
定期改變傳代方法每5代，取10mL，離心3500r .mirT1,棄上清液，加IOmL無(wú)菌生理鹽水，懸浮，接種到新鮮的PCS培養(yǎng)基上。待纖維素崩解時(shí)間穩(wěn)定以后，即初步篩選到纖維素分解混合菌群。最后得到降解棉稈木質(zhì)纖維素效果強(qiáng)、穩(wěn)定的復(fù)合菌系MGO，MGl, MG2 禾口 MG3。蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCQ改良培養(yǎng)基成分蛋白胨、纖維素(棉花秸稈)、酵母膏、NaCL 各 5g · Γ1，CaC032g · Λ K2HPO4、MgSO4 各 0. 5g · L—1，微量元素溶液 0. 5mL · Λ 土壤浸提液(土壤與去離子水以質(zhì)量比1 1攪拌混合，過(guò)濾，滅菌后備用)100mL ·Ι^。微量元素溶液成分(g · L—1)硫酸鋅0. 29,氯化鈣0. M，硫酸銅0. 25，硫酸鎂0. 17(2)青貯復(fù)合菌系的篩選利用MRS培養(yǎng)基對(duì)南疆青貯飼料、棉花秸稈與玉米秸稈混個(gè)青貯(質(zhì)量比例 1 1)和棉花秸稈進(jìn)行青貯，常溫，青貯40d。然后稱取5g青貯飼料，加入到95mL MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C，靜止，(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，篩選pH快速降到4. O以下的青貯復(fù)合系。然后將PH快速下降到4以下的復(fù)合系，進(jìn)行繼續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)。直到篩選出pH快速下降到4以下的穩(wěn)定的青貯復(fù)合系。MRS液體培養(yǎng)基(g/1):葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，吐溫_801mL，蒸餾水 IOOOmL, 121 °C滅菌 20min, pH 6. 2-6. 4。(3)白腐菌的培養(yǎng)白腐菌為黃孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng)。培養(yǎng)條件37°C，PDA平板電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6d，利用前制作成孢子懸浮液。PDA培養(yǎng)基組成·馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15 20g,自來(lái)水IOOOmL, pH自然。本發(fā)明步驟1)中所述的堆肥為牛糞、豬糞、雞糞的混合，比例2 1 1，37°C，發(fā)酵 15d。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為1、本發(fā)明具有能耗低、操作簡(jiǎn)單以及不污染環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。2、本發(fā)明的技術(shù)方案是多種微生物的協(xié)同作用。3、使用本發(fā)明方法降解效果好，棉稈微生物降解啟動(dòng)較快，在第5d就能達(dá)到酶活最高值，說(shuō)明經(jīng)稀酸預(yù)處理處理的棉稈有利于微生物的降解。


圖1是本發(fā)明方法的流程圖；圖2是降解棉稈的纖維素復(fù)合菌系篩選流程圖；圖3是青貯復(fù)合菌系的篩選流程圖；圖4是白腐菌，木質(zhì)纖維降解復(fù)合菌系與青貯復(fù)合菌系的復(fù)合及青貯效果評(píng)價(jià)圖；圖5是復(fù)合系纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果圖；圖6是分解酸預(yù)處理棉稈木質(zhì)纖維素復(fù)合系MGl三種酶活性動(dòng)態(tài)圖7是OD和pH動(dòng)態(tài)變化圖；圖8是不同氮源對(duì)纖維素酶活性的影響圖；圖9是不同氮源對(duì)纖維素酶降解效果圖；圖10是不同溫度對(duì)纖維素酶活性的影響圖；圖11是不同溫度對(duì)纖維素酶降解效果圖；圖12是PH對(duì)纖維素酶活性的影響圖；圖13是PH對(duì)纖維素酶降解效果圖；圖14是接種量對(duì)纖維素酶活性的影響圖；圖15是接種量對(duì)纖維素酶降解效果圖；圖16是不同培養(yǎng)代數(shù)的木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的DGGE ；圖17是不同培養(yǎng)代的青貯復(fù)合菌系的DGGE。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。參見(jiàn)圖1-圖3，一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法， 包括以下步驟(1)降解棉稈木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的篩選1)將從新鮮牛糞為MG0、堆肥(牛糞、豬糞、雞糞的混合，比例2 1 1，37°C，發(fā)酵15d)為MGl、棉花地耕作層土壤0 40cm為MG2和瘤胃液中取來(lái)的樣品為MG3，各取5g/ mL加入到100ml PCS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，靜止，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2)待纖維素崩解以后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的PCS培養(yǎng)液中，接種量為10% (ν/ν)，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物，留下分解能力強(qiáng)的培養(yǎng)物，定期改變傳代方法每5代，取10mL，離心3500r .mirT1,棄上清液，加IOmL無(wú)菌生理鹽水，懸浮，接種到新鮮的PCS培養(yǎng)基上。待纖維素崩解時(shí)間穩(wěn)定以后，即初步篩選到纖維素分解混合菌群。最后得到降解棉稈木質(zhì)纖維素效果強(qiáng)、穩(wěn)定的復(fù)合菌系MGO，MGl, MG2 禾口 MG3。PCS培養(yǎng)基成分蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCQ改良培養(yǎng)基成分蛋白胨、纖維素 (棉花秸稈)、酵母膏、NaCL 各 5g · ΙΛ CaC032g · Λ K2HPO4、MgSO4 各 0. 5g · 微量元素溶液Ο.δπιΙ^Γ1，土壤浸提液(土壤與去離子水以質(zhì)量比1 1攪拌混合，過(guò)濾，滅菌后備用)IOOmL · L—1。微量元素溶液成分(g · Γ1)硫酸鋅0. 29,氯化鈣0.對(duì)，硫酸銅0. 25，硫酸鎂 0. 17(2)青貯復(fù)合菌系的篩選利用MRS培養(yǎng)基對(duì)南疆青貯飼料、棉花秸稈與玉米秸稈混個(gè)青貯(質(zhì)量比例 1 1)和棉花秸稈進(jìn)行青貯，常溫，青貯40d。然后稱取5g青貯飼料，加入到95mL MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C，靜止，(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，篩選pH快速降到4. O以下的青貯復(fù)合系。然后將PH快速下降到4以下的復(fù)合系，進(jìn)行繼續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)。直到篩選出pH快速下降到4以下的穩(wěn)定的青貯復(fù)合系。MRS液體培養(yǎng)基(g/1):葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，吐溫_801mL，蒸餾水IOOOmL, 121°C滅菌 20min, pH 6. 2-6. 4。(3)白腐菌的培養(yǎng)白腐菌為黃孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng)。培養(yǎng)條件37°C，PDA平板電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6d，利用前制作成孢子懸浮液。PDA培養(yǎng)基組成·馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15 20g,自來(lái)水IOOOmL, pH自然。圖4為白腐菌，木質(zhì)纖維降解復(fù)合菌系與青貯復(fù)合菌系的復(fù)合及青貯效果評(píng)價(jià)圖。通過(guò)已經(jīng)獲得的木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系和青貯乳酸菌系與白腐菌進(jìn)行復(fù)合以及青貯效果評(píng)價(jià)，首先進(jìn)行拮抗測(cè)定，確定其無(wú)拮抗作用，然后進(jìn)行混合發(fā)酵，然后進(jìn)行測(cè)定相關(guān)的指標(biāo)(酶活性、降解率、體外發(fā)酵、瘤胃降解率等)，確定最好的組合。復(fù)合系纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，土壤的CMC酶活為18. 23U/mL, FPA酶活為 6. 74U/mL, β -葡萄糖苷酶 12. 67U/mL ；堆肥的 CMC 酶活 13. 91U/mL、FPA 酶活 6. 47U/mL、 β -葡萄糖苷酶11. 34U/mL ；牛糞的CMC酶活11. 95U/mL、FPA酶活8. 29U/mL、β -葡萄糖苷酶11. 03U/mL ；瘤胃液的CMC酶活12. 26U/mL, FPA酶活5. 95U/mL、β -葡萄糖苷酶酶活 11. 39U/mL。其中源自牛糞的纖維素復(fù)合系FPA酶活高于其他復(fù)合菌系，產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)。分解酸預(yù)處理棉稈木質(zhì)纖維素復(fù)合系MGl三種酶活性、OD和pH動(dòng)態(tài)變化，具體見(jiàn)圖6、圖7。從發(fā)酵第2d起，每天測(cè)定CMC、FPA和β -G酶活性，測(cè)定8d內(nèi)微生物降解酸預(yù)處理棉稈的酶活動(dòng)態(tài)變化，如圖1所示。木質(zhì)纖維素降解復(fù)合系MGl對(duì)酸預(yù)處理的棉稈的分解啟動(dòng)較快，而且酶活性變化幅度不大，而且保持較高的酶活性，可能是復(fù)合菌系MGl由多種微生物復(fù)合作用的結(jié)果，CMC和FPA酶活均于第5d出現(xiàn)峰值，之后酶活稍有下降，均維持在較平穩(wěn)的狀態(tài)，β -G酶活性在第5d酶活性較高，可能是微生物生長(zhǎng)消耗更多的糖，減少了糖對(duì)β -G酶的抑制作用，從酶活變化角度來(lái)看，可將酸預(yù)處理棉稈的微生物降解周期控制在5d左右。這樣快速啟動(dòng)產(chǎn)生糖，為乳酸菌進(jìn)行半干青貯提供充足的碳源。另外，也測(cè)定了在棉稈發(fā)酵過(guò)程中的OD和pH值的變化，見(jiàn)圖7，在第5d，OD值達(dá)到最大，PH快速下降，有助于纖維素酶的活性發(fā)揮，也有利棉稈半干青貯。單因素試驗(yàn)結(jié)果四種氮源對(duì)稀酸預(yù)處理棉稈木質(zhì)纖維素MGl降解效果的影響采用四種不同氮源的硫酸銨、硝酸銨、尿素、和蛋白胨對(duì)酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl 降解效果的影響，結(jié)果如圖8、9所示。以尿素作為氮源，能保持最高的01^ 々和0-6酶活性，且糖化率和纖維素降解率均高于其他的氮源，說(shuō)明尿素能有效地促進(jìn)復(fù)合系MGl產(chǎn)酶、 提高了棉稈的糖化率和棉稈失重率。但是，從圖3也可以初步得出，F(xiàn)PA酶活性無(wú)機(jī)氮的效果均強(qiáng)于有機(jī)氮，可能無(wú)機(jī)氮有助于木質(zhì)素的溶解，為纖維素酶的作用提供更多的空間。從圖9，可以得出尿素為氮源的處理，糖化率和失重率明顯高于其它氮源，但是硝酸銨的處理效果最差，可能硝態(tài)氮不利于復(fù)合系MGl的利用。不同溫度對(duì)稀酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl降解效果的影響
從圖10、11可以看出，隨著溫度升高，F(xiàn)PA酶、β-G酶活基本保持不變，維持在較高的酶活性，耐高溫能力強(qiáng)，CMC酶的活性在32°C、37°C、42°C保持較高的活性，也就是溫度對(duì)CMC酶活性影響比較大，對(duì)FPA酶、β -G酶影響不大。糖化率和纖維素降解率32°C達(dá)最高值，42°C CMC酶活、糖化率和纖維素降解率都有不同程度的提高。綜合看來(lái)，32 37°C為較優(yōu)的發(fā)酵溫度。雖然酶活性變化不大，但是糖化率和失重率變化比較大，這可能由于溫度對(duì)復(fù)合系MGl的組成有較大的影響。起始pH值對(duì)稀酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl降解效果的影響見(jiàn)圖12、圖13。從圖12可看出來(lái)，pH在4. 8 6. 8之間，復(fù)合系MGl能維持較高的CMC、FPA、β -G 酶活性，pH在4. 8左右，糖化率最高，pH在5. 8左右失重率最大，且使棉稈有較高的糖化率和失重率，起始PH值調(diào)節(jié)為4. 8-5. 8之間。綜合來(lái)看，故選擇起始pH值5. 8為宜。三種纖維素酶的對(duì)PH的適應(yīng)性較大，但是糖化率和失重率的變化較大，可能是由于復(fù)合系MGl對(duì) PH變化比較敏感引起的。pH為5. 8時(shí)，有利于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。接種量對(duì)稀酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl降解效果的影響從圖14、15曲線變化來(lái)看， FPA酶的活性變化不大，CMC和β -G酶在和10%的接種量時(shí)活性最高。糖化率隨接種量的增加一直在增加，10%的接種量，糖化率最高，5%的接種量棉稈失重率達(dá)到最大值。這可能是10%的接種量帶入了更多的養(yǎng)分，誘導(dǎo)復(fù)合系MGl產(chǎn)生纖維素酶的能力減弱。以5.0% 接種量能獲得最高的棉稈失重率和較高的糖化率，以接種量5. 0%為較優(yōu)選擇。稀酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl降解的正交試驗(yàn)結(jié)果表1復(fù)合系MGl正交試驗(yàn)結(jié)果
處理氮源溫度PH接種量CMCaseZ(IU)FPase(IU)fi-G.(IU)糖化率％失重率°/c1111123.7812.887 6819.5916.282122221.919.5710.5123.6120.913133321.6110.3311.0223.0118.214212322.668.6010.5630.6512.665223121.026.5811.4329.7016 776231220.059.3310.4214.6210.877313220.5114 0911.6221.3114.588321323.1414 938.2625.0213 049332129.0117.748.0535.7925 34表2各處理因素對(duì)稀酸預(yù)處理棉稈復(fù)合系MGl降解效果影響的F值表
因素CMCaseZ(IU)FPasef(IU)P-G糖化失重A6. 9179**99. 0605**8. 8071=(=*30. 9462**136. 2974**B2. 03998. 2831**0. 21425.9831*63. 7649**C9. 5485**8. 2418**25. 148**115.9879**181.4213**D11. 0606**3.8666*12.0484**86. 2728**124. 4994**
注**表示影響達(dá)極顯著水平(P < 0. 01)，*表示影響達(dá)顯著水平(P < 0. 05)。
F值結(jié)果見(jiàn)表2，pH、氮源種類(lèi)和接種量對(duì)CMC、FPA、β-G酶活和I套化率和失重率的
影響達(dá)到顯著水平(P <0.01)，溫度對(duì)FPA酶和失重率的影響達(dá)到顯著水平(P <0.01)，
7對(duì)糖化率的影響達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)，對(duì)CMC、β -G酶活的影響未達(dá)到顯著水平。各因素對(duì) CMC、FPA, β -G酶活的影響
表3復(fù)合系MGlCMC酶活、FPA酶活和β-G酶活性比較
權(quán)利要求
1.一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將從新鮮牛糞為MG0、堆肥，37°C，發(fā)酵15d，為MG1、棉花地耕作層土壤0 40cm為 MG2和瘤胃液中取來(lái)的樣品為MG3，各取5g/mL加入到1 OOml PCS培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)，靜止， CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)待纖維素崩解以后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的PCS培養(yǎng)液中，接種量為10%(ν/ν)，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物，留下分解能力強(qiáng)的培養(yǎng)物，其中定期改變傳代方法每5代，取10mL，離心3500r · mirT1，棄上清液，加IOmL無(wú)菌生理鹽水，懸浮，接種到新鮮的PCS培養(yǎng)基上，待纖維素崩解時(shí)間穩(wěn)定以后，即初步篩選到纖維素分解混合菌群，初步得到降解棉稈木質(zhì)纖維素效果強(qiáng)、穩(wěn)定的復(fù)合菌系MG0，MG1，MG2 和MG3，然后利用MG0，MG1，MG2和MG3對(duì)棉稈進(jìn)行固體發(fā)酵，獲得效果最好的菌群為MG0，然后對(duì)MGl進(jìn)行產(chǎn)酶能力進(jìn)行優(yōu)化，獲得較好的產(chǎn)酶條件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法， 其特征在于，步驟1)中所述的堆肥牛糞、豬糞、雞糞的混合，其混合比例為2 1 1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用白腐菌協(xié)同木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系青貯棉稈的方法，將從新鮮牛糞、堆肥、棉花地耕作層土壤0～40cm和瘤胃液中取來(lái)的樣品，各取5g加入到100mLPCS培養(yǎng)基中，37℃密閉培養(yǎng)。待纖維素崩解以后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的PCS培養(yǎng)液中，接種量為10％(v/v)，如此轉(zhuǎn)接23代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物，留下分解能力強(qiáng)的培養(yǎng)物，待纖維素崩解時(shí)間穩(wěn)定以后，即初步篩選到纖維素分解混合菌群。本發(fā)明具有能耗低、操作簡(jiǎn)單以及不污染環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A23K1/14GK102550809SQ20121003258
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者吳書(shū)奇, 席琳喬, 張玲, 楊麗娟, 馬春暉 申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)