專利名稱：一種草莓抗連作障礙突變體的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用草莓枯萎病菌尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸混合液作為選擇壓力誘導(dǎo)篩選草莓抗連作障礙突變體的方法。
背景技術(shù)：
草莓受連作障礙影響非常嚴(yán)重，自毒物質(zhì)和土壤病原微生物均是導(dǎo)致草莓連作障礙的重要原因。目前，有關(guān)作物的化感作用已日益受到越來越多的關(guān)注，并且圍繞根系化感物質(zhì)的自毒作用研究更是成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者探尋連作障礙發(fā)生根本原因熱點(diǎn)。自毒作用是指一種作物或微生物以自然揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌和植物分解等方式向環(huán)境中釋放次生代謝物質(zhì)而影響周圍或鄰近的植物、動(dòng)物、微生物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的有害的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象，這些次生代謝物質(zhì)稱為自毒物質(zhì)。草莓根系分泌物和腐解物中的對(duì)羥基苯甲酸是其主要自毒物質(zhì)之一，常年連作使其含量在土壤中逐年積累，進(jìn)而抑制了草莓的生長(zhǎng)發(fā)育，降低了根系活性和抗病性，最終致使枯萎病的嚴(yán)重發(fā)生。草莓根際土壤中的病原微生物主要包括三類，分別是尖孢鐮刀菌oxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和大麗輪枝菌(verticillium dahliae),但以常導(dǎo)致枯萎病發(fā)生的尖孢鐮刀菌為主；該病菌是屬于土傳病原菌，生產(chǎn)上很難進(jìn)行防治。植物病原菌毒素是病原菌產(chǎn)生的對(duì)寄主植物有毒性的代謝產(chǎn)物，是導(dǎo)致植物病害發(fā)生的主要原因之一。以病原菌產(chǎn)生的致病毒素作為選擇壓力，在離體條件下進(jìn)行抗病突變體的篩選，是抗病性離體選擇體系中發(fā)展比較成熟、應(yīng)用較為成功的一種技術(shù)體系。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已有17種作物50余種病害的突變體問世，是微生物化育種技術(shù)中獲得抗性新材料或品系數(shù)較廣泛的。研究者郭麗娟等(郭利娟等，誘發(fā)玉米抗小斑病突變體的研究，從玉米單倍體胚性細(xì)胞無性系篩選抗小斑病突變，遺傳學(xué)報(bào)，1981，14(5) : 17-20)研究了玉米抗小斑病突變體，以玉米小斑病菌產(chǎn)生的致病毒素為選擇壓力，在短期內(nèi)離體誘發(fā)和篩選抗玉米小斑病的突變體。趙明敏等(趙明敏等，利用病原真菌毒素離體篩選茄子抗黃萎病突變體的研究，華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21 (1) :92-95)以爺子黃萎病菌毒素作選擇劑,離體篩選爺子抗黃萎病突變體，其愈傷組織均能夠較好的表達(dá)植株水平的抗性。諸多研究者所使用的試材不同，離體篩選時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基的不同，測(cè)定的不定芽半致死劑量差異也很大。迄今為止，關(guān)于草莓抗枯萎病突變體的誘導(dǎo)和篩選還缺乏系統(tǒng)研究，該技術(shù)也未成熟和程序化。本發(fā)明以草莓組培苗葉片為試材，以病原菌毒素和自毒物質(zhì)混合物作為選擇壓力進(jìn)行誘變處理，離體篩選草莓抗性突變體。根據(jù)不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，建立了離體葉段愈傷組織最優(yōu)再生體系；同時(shí)確定了毒素和自毒物質(zhì)混合液的半致死劑量。本發(fā)明中抗性突變體的成功篩選對(duì)解決草莓生產(chǎn)中連作障礙問題具有重要的理論和實(shí)踐意義。此處鍵入背景技術(shù)描述段落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用病原真菌毒素和自毒物質(zhì)混合液離體篩選草莓抗枯萎病突變體的方法，其以草莓組培苗葉段為誘導(dǎo)材料，在最優(yōu)再生體系條件下，以尖孢鐮刀菌毒素和對(duì)羥基苯甲酸混合液的半致死劑量為選擇壓力，研究愈傷組織生長(zhǎng)、分化和遺傳穩(wěn)定的特性，通過再生植株接種病原菌和澆灌對(duì)羥基苯甲酸處理，調(diào)查其生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)、根系病情指數(shù)和結(jié)實(shí)性，最終建立以毒素和自毒物質(zhì)混合液誘變篩選草莓抗枯萎病突變體的方法。技術(shù)方案1、建立離體葉段愈傷組織最優(yōu)再生體系剪取草莓組培苗4X4mm葉段，接種于不同MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)(25°C，3000LUX, 14h/d) 50d后，根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率和發(fā)生量，建立草莓離體葉段愈傷組織最優(yōu)再生體系。2、無菌毒素原液的配制在生長(zhǎng)于PDA平板上的尖孢鐮刀菌菌落邊緣切取Φ為5mm的菌餅,無菌條件下轉(zhuǎn)接到裝有150mL Czpek's培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶5枚菌餅；震蕩培養(yǎng)(25°C, 110r/min)21d后,4000r/min離心30min ;用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾
得無菌毒素原液。3、混合液誘導(dǎo)半致死劑量測(cè)定將步驟I中葉分別段接種在各含毒素原液5%、10%、15%、20% 和自毒物質(zhì)(1. 0X1(T2，1. OXlO-3,1. ΟΧΙΟ-4,1. OX 1(Γ5 和 L OX 1(Γ6molL—1)的MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)同步驟I，據(jù)誘導(dǎo)率得混合液誘導(dǎo)半致死劑量。4、突變體的初篩將篩步驟I中葉段接種在含混合液致死劑量培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽；將不定芽再接種在含半致死劑量混合物的MS培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)5代后；再將其接種于混合液濃度高一梯度的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)繼代培養(yǎng)5代，每代周期為30d，篩選得再生植株。5、突變體的復(fù)篩將再生植株接種在半致死劑量混合液的MS繼代培養(yǎng)基上，測(cè)定其分化和遺傳穩(wěn)定性；將分化和遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)的植株接種于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)同步驟I，50d后經(jīng)低溫春化((T2°C，10周)處理，然后再移植到花盆中，接種1. O X IO5個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液和 澆灌1. O X 10_4 moir1對(duì)羥基苯甲酸，40d后調(diào)查草莓根系病情指數(shù)和生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，最后統(tǒng)計(jì)植株果實(shí)重量，篩選得抗性突變體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果
本發(fā)明以草莓葉段為誘導(dǎo)愈傷組織材料，以尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸混合液作為選擇壓力，通過人工檢測(cè)再生植株的抗病能力和結(jié)實(shí)性，獲得了三株能穩(wěn)定分化和遺傳的抗性突變體。本發(fā)明建立的以尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸混合物作為選擇壓力與植株組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可以快速獲得有益的抗病草莓種質(zhì)資源，為草莓生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、周期短和重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。



圖1是利用毒素和自毒物質(zhì)混合液篩選草莓抗連作障礙突變體流程圖具體實(shí)施方式
I實(shí)施材料
草莓品種達(dá)賽萊克特，草莓生產(chǎn)中優(yōu)勢(shì)品種；病原菌枯萎病菌尖孢鐮刀菌草莓?；蚗Fusarium oxysporum Schl. f. sp. /^ragariae);對(duì)輕基苯甲酸,SCRC 國(guó)藥集團(tuán)有限公司。2實(shí)施方法2.1建立離體葉段愈傷組織再生體系
葉片切成4X4mm葉段后，正面向上接種于不同濃度蔗糖、麥芽糖為碳源并附加不同濃度TDZ或AgNOJ^ MS固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)(25°C，3000LUX, 14h/d)50d后統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織誘導(dǎo)率和發(fā)生量。每濃度處理接種40個(gè)葉段，重復(fù)4次。2. 2混合物半致死劑量的選擇
在生長(zhǎng)于PDA平板上的尖孢鐮刀菌菌落邊緣切取Φ為5mm的菌餅，無菌條件下轉(zhuǎn)接到裝有150mL Czpek’s培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶5枚菌餅。震蕩培養(yǎng)(25°C，110r/min)21d后，4000r/min離心30min,用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾得無菌毒素原液。將草莓葉段接種于同時(shí)含有不同濃度毒素原液(5%、10%、15%和20%)和不同濃度對(duì)羥基苯甲酸(10_2、10_3、10_4、10_5和10_6 mo Ir1)的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照(25 °C，3000LUX, 14 h/d)培養(yǎng)50d后，據(jù)存活率得毒素和對(duì)羥基苯甲酸混合液半致死劑量。分別以不同濃度毒素CKtl和不同濃度對(duì)羥基苯甲酸CK1作對(duì)照；每種濃度混合液處理重復(fù)5次，每重復(fù)20塊愈傷組織。2. 3草莓再生植株篩選
將4X4mm葉段接種在混合液半致死劑量MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照(25°C，3000LUX,14h/d)培養(yǎng)50d后，得誘導(dǎo)不定芽。然后將不定芽在半致死劑量MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5代；再將不定芽接種于混合物濃度高一梯度的培養(yǎng)基上繼續(xù)繼代培養(yǎng)5代，每代周期為30d，篩選得長(zhǎng)勢(shì)較好再生植株，備用。將篩選到的再生植株和野生型分別接種在含毒素和對(duì)羥基苯甲酸混合物的培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)3代后調(diào)查再生植株生長(zhǎng)和分化情況。以接種在不含毒素培養(yǎng)基上的再生植株和野生型作對(duì)照。

2. 4草莓抗性突變體鑒定
將篩選出的再生植株進(jìn)行生根培養(yǎng)，光照培養(yǎng)50d后，經(jīng)低溫春化((T2°C，10周)處理，然后再移植到花盆中置于陽光溫室培養(yǎng)，每盆接種1. OX IO5個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液和澆灌1. OX 10_4 mo 1Γ1對(duì)羥基苯甲酸各10mL，40d后調(diào)查草莓根系病情指數(shù)、株高、根長(zhǎng)、新生葉片數(shù)和干物質(zhì)重，最后統(tǒng)計(jì)植株果實(shí)重量，篩選得抗性突變體。5級(jí)劃分法0級(jí)無?。?級(jí)發(fā)病面積占根部表面積1/4以下；2級(jí)發(fā)病面積占根表面積1/4 1/2 ；3級(jí)發(fā)病面積占根表面積1/2 3/4 ；4級(jí)發(fā)病面積占根表面積3/4以上；
用下式計(jì)算病情指數(shù)病情指數(shù)(DI)SiJffi(XiKSnaf)XlOO。
ImU1*33實(shí)施結(jié)果
3.1誘導(dǎo)愈傷組織最優(yōu)再生體系的建立
實(shí)施結(jié)果表明(見表1)，以麥芽糖為碳源時(shí)，BA和TDZ均能誘導(dǎo)出愈傷組織，其對(duì)葉片的誘導(dǎo)結(jié)果明顯好于蔗糖。當(dāng)麥芽糖濃度為10g/L 30 g/L時(shí)，愈傷組織發(fā)生率較高，達(dá)到70%以上。愈傷組織生長(zhǎng)量隨著TDZ濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)濃度為3mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳。BA處理愈傷組織生長(zhǎng)量變化趨勢(shì)與TDZ處理相同，BA濃度為2mg/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)量最高；TDZ誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)量均高于同濃度BA處理。AgNO3濃度為lmg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)量均達(dá)最高值(95%和O. 27g)，誘導(dǎo)效果明顯高于其它濃度。綜上可得最優(yōu)離體葉片愈傷組織的再生體系MS固體培養(yǎng)基+麥芽糖(l(T30g/L)+TDZ(l 4mg/L)+ AgNO3 lmg/L。表I激素種類、碳源、AgNO3等因素對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響
權(quán)利要求
1.一種利用草莓枯萎病菌尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸混合液作為選擇壓力誘導(dǎo)篩選抗枯萎病突變體的方法，其特征在于，以草莓組培苗葉段為誘導(dǎo)材料，選用愈傷組織最優(yōu)再生體系誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，再將不定芽接種在含半致死劑量混合液的MS繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接于較高濃度混合液培養(yǎng)基再繼代培養(yǎng)，并對(duì)分化和遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)的小植株移栽于花盆中，通過接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液和澆灌自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸，進(jìn)一步鑒定植株抗病性、生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)和結(jié)實(shí)性，從而篩選得到抗性突變體；具體步驟如下 (1)剪取組培苗葉段，將其接種于不同碳源、不同濃度TDZ或AgNO3的MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，篩選愈傷組織誘導(dǎo)最優(yōu)再生體系，得愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基； (2)將草莓葉段接種于含有不同濃度尖孢鐮刀菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，篩選混合液誘導(dǎo)半致死劑量； (3)將草莓葉段接種在混合液半致死劑量愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；將不定芽接種在含半致死劑量混合液的MS培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)5代后；再接種于高濃度混合液培養(yǎng)基上繼續(xù)繼代培養(yǎng)5代,篩選再生植株； (4)將再生植株接種在混合液半致死劑量MS繼代培養(yǎng)基上，測(cè)定其分化和遺傳穩(wěn)定性；然后將篩選出的再生植株接種于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)60d后移植到花盆中；再用對(duì)羥基苯甲酸和病菌孢子懸浮液處理，30d后鑒定突變體發(fā)病情況，得抗性突變體。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的方法，其特征在于，以草莓組培苗葉段為誘導(dǎo)材料，愈傷組織最優(yōu)再生體系為MS固體培養(yǎng)基+麥芽糖(l(T30g/L)+TDZ(l 4mg/L)+ AgNO3 lmg/L。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的方法，其特征在于，篩選突變體混合液的半致死濃度為10%毒素十1.OX 10 4molL 1對(duì)輕基苯甲酸。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的方法，其特征在于，接種在含混合液半致死劑量的MS培養(yǎng)基上的不定芽，繼代培養(yǎng)5代后，再于含混合液濃度高一梯度MS培養(yǎng)基上繼續(xù)繼代培養(yǎng)5代，得誘導(dǎo)再生植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種以枯萎病菌毒素和自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸混合液作為選擇壓力誘導(dǎo)草莓抗連作障礙突變體的篩選方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。由尖孢鐮刀菌引起的草莓枯萎病和根系自毒物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸是引起草莓嚴(yán)重連作障礙的重要因素。本發(fā)明以草莓組培苗葉段為誘導(dǎo)材料，在含有毒素和對(duì)羥基苯甲酸混合液半致死濃度(10%毒素＋1.0×10-4molL-1)的最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基＋麥芽糖(10~30g/L)+TDZ(1~4mg/L)+AgNO31mg/L)中，篩選到分化率高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)且能結(jié)實(shí)的三株抗性突變體。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)草莓連作條件下抗重茬種質(zhì)資源的突破和創(chuàng)新提供了新的技術(shù)手段和理論支持。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103053415SQ20121002168
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者甄文超, 劉雪靜, 齊永志, 馬燕會(huì), 代麗 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)