專利名稱：降低植物種子的飽和脂肪酸含量的制作方法
降低植物種子的飽和脂肪酸含量
優(yōu)先權(quán)要求
本申請(qǐng)是共同懸而未決的申請(qǐng)U. S. S. N. 11/576,750(其是2005年10月7日提交，指定美國，并在2006年4月20日以PCT國際公開文本NO.W02006/042049A2以英語公布的PCT國際專利申請(qǐng)NO.PCT/US05/36052的進(jìn)入國家階段)的部分繼續(xù)。PCT國際專利申請(qǐng)No. PCT/US05/36052是2004年10月8日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/617，532的繼續(xù)。本申請(qǐng)也是2010年6月24日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/358,314的繼續(xù)。技術(shù)領(lǐng)域
一般而言，一些實(shí)施方案涉及某些delta-9去飽和酶酶、編碼這些酶的核酸、和其在植物細(xì)胞中的表達(dá)方法。一些實(shí)施方案涉及利用某些delta-9去飽和酶酶的活性來降低植物材料(例如，種子)中飽和脂肪酸的百分比組成并增加ω-7脂肪酸的百分比組成。本文中還公開了通過具體實(shí)施方案中的方法生成的植物和植物材料。
發(fā)明背景
植物衍生的油已經(jīng)逐漸替換動(dòng)物衍生的油和脂肪作為飲食脂肪攝取的主要來源。 然而，大多數(shù)工業(yè)化國家的飽和脂肪攝取仍然占總熱量消費(fèi)的約15%至20%。致力于促進(jìn)更健康的生活方式，美國農(nóng)業(yè)部(USDA)最近已經(jīng)推薦飽和脂肪占日常熱量攝取的小于10%。 為了促進(jìn)消費(fèi)者意識(shí)，目前由USDA發(fā)布的標(biāo)記準(zhǔn)則現(xiàn)在要求每14g食物份(serving)小于1. Og的總飽和脂肪酸水平接受“低飽和”標(biāo)簽，而每14g食物份小于O. 5g的總飽和脂肪酸水平接受“無飽和”標(biāo)簽。這意味著植物油的飽和脂肪酸含量分別需要小于7%和3. 5%以接受“低飽和”(low-sat)或“無飽和”標(biāo)簽。由于這些準(zhǔn)則的發(fā)布，消費(fèi)者對(duì)“低飽和”和 “無飽和”油的需要已經(jīng)有猛增。至今，此需要已經(jīng)主要以蕓苔(canola)油，以及少得多的程度以向日葵和紅花油滿足。
雖然不飽和脂肪(單不飽和的和多不飽和的)是有益的(尤其在適度消費(fèi)時(shí))，但是飽和的和反式的脂肪不然。飽和脂肪和反式脂肪提高血液中不想要的LDL膽固醇水平。 膳食膽固醇也提高LDL膽固醇，并且甚至可以在沒有提高LDL的情況下促成心臟病。因此， 可取的是，選擇飽和脂肪、反式脂肪、和膽固醇低的食物作為健康飲食的一部分。
無論是植物還是動(dòng)物起源的油的特征主要由油分子中碳和氫原子`的數(shù)目，及脂肪酸鏈中包含的雙鍵的數(shù)目和位置決定。自植物衍生的大多數(shù)油由不同量的棕櫚酸(16:0)、 硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)脂肪酸構(gòu)成。常規(guī)地，棕櫚酸和硬脂酸稱為“飽和的”，這是因?yàn)槠涮兼溡詺湓语柡停⑶乙虼藳]有雙鍵；它們含有有可能的最大數(shù)目的氫原子。然而，油酸、亞油酸、和亞麻酸是其中分別具有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)雙鍵的18碳脂肪酸鏈。通常認(rèn)為油酸單不飽和脂肪酸，而認(rèn)為亞油酸和亞麻酸是多不飽和脂肪酸。U.S.D.A.將“無飽和”油產(chǎn)品定義為那些具有小于3. 5%脂肪酸含量的產(chǎn)品，其以按重量計(jì)的組合飽和脂肪酸含量(與脂肪酸的總量相比)計(jì)算。
蕓苔油具有所有植物油的最低水平飽和脂肪酸?！笆|苔”指基于種子的總脂肪酸含量(優(yōu)選地，至多O. 5% (按重量計(jì))，且最優(yōu)選地，基本上為0% (按重量計(jì)))具有至多2% (按重量計(jì))的芥酸(C22:l)含量，并且在壓碎后生成含有小于30 μ mol/g脫脂(oil-free)粗粉的風(fēng)干粗粉的油菜籽(蕓苔屬(Brassica))。與更傳統(tǒng)的物種品種比較，這些類型的油菜籽根據(jù)其可食性區(qū)別。
假定在含油種子中，脂肪酸合成主要在質(zhì)體中發(fā)生。脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是棕櫚酸酯(16:0)，其似乎有效延長為硬脂酸酯(18:0)。雖然仍在質(zhì)體中，但是飽和脂肪酸然后可以受到稱為?；?ACP delta-9去飽和酶的酶去飽和，以引入一個(gè)或多個(gè)碳_碳雙鍵。 具體地,硬脂酸酯可以受到質(zhì)體delta-9去飽和酶酶快速去飽和以產(chǎn)生油酸酯(18:1)。實(shí)際上，棕櫚酸酯也可以被質(zhì)體delta-9去飽和酶去飽和成棕櫚油酸酯(16:1)，但是此脂肪酸在大多數(shù)植物油中僅以痕量(0-0. 2%)出現(xiàn)。如此，質(zhì)體中脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是棕櫚酸酯、硬脂酸酯、和油酸酯。在大多數(shù)油中，油酸酯是合成的主要脂肪酸，因?yàn)轱柡椭舅嵋缘偷枚嗟谋壤嬖凇?br> 新合成的脂肪酸從質(zhì)體輸出至細(xì)胞質(zhì)。隨后植物脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)中的去飽和似乎限于油酸酯，其可以被微粒體去飽和酶去飽和成亞油酸酯(18:2)和亞麻酸酯(18:3)，所述微粒體去飽和酶對(duì)酯化為磷脂酰膽堿(PC)的油酰基或亞油?；孜锲鹱饔谩Ａ硗?，根據(jù)植物，油酸酯可以通過延長(至20:1、22:1、和/或24:1)，或者通過添加官能團(tuán)進(jìn)一步修飾。 然后，這些脂肪酸以及飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸酯在內(nèi)網(wǎng)狀膜中裝配成甘油三酯。
植物酰基-ACP delta-9去飽和酶酶是可溶的。它位于質(zhì)體基質(zhì)中，并且使用酯化為ACP(主要是硬脂酰-ACP)的新合成的脂肪酸作為底物。這與其它delta-9去飽和酶酶形成對(duì)比，所述其它delta-9去飽和酶酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀膜(ER，或線粒體)中，使用酯化為Co-A的脂肪酸作為底物，并飽和脂肪酸棕櫚酸酯和硬脂酸酯兩者去飽和。美國專利 5，723，595和6，706，950涉及植物去飽和酶。
已經(jīng)將酵母delta-9去飽和酶基因自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分離，克隆，并測(cè)序。Stukey 等(1989) J. Biol. Chem. 264:16537-44; Stukey 等(1990) J. Biol. Chem. 265:20144-9。已經(jīng)將此酵母基因?qū)霟煵萑~組織中(Polashcok等(1991)FASEB J. 5:A1157;Polashok 等(1992)Plant Physiol. 100:894-901)，并且在此組織中明顯表達(dá)。 此外，在馬鈴薯中表達(dá)此酵母基因。見Wang等(1996) J. Agric. Food Chem. 44:3399-402; 及Wang等(2001)Phytochemistry58:227-32。雖然對(duì)使用此酵母delta-9去飽和酶基因的煙草和馬鈴薯兩者報(bào)告了某些不飽和脂肪酸的一些增加及某些飽和脂肪酸的一些減少，但是煙草和馬鈴薯明顯不是油類作物。也將此酵母基因?qū)胗筒?Brassica napus)中。美國專利 5，777，201。
已經(jīng)將來自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的不同真菌?；?CoA delta-9 去飽和酶導(dǎo)入蕓苔中，由此實(shí)現(xiàn)含油種子中降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請(qǐng)公開文本US2008/0260933A1。構(gòu)巢曲霉酰基-CoA delta-9去飽和酶在含油種子中對(duì)硬脂酸酯 (61-90%)比對(duì)更豐富的棕櫚酸酯脂肪酸(36-49%)提供更大的消減。發(fā)明概述
本文中公開了新穎的真菌delta-9去飽和酶酶；包含編碼此類去飽和酶的至少一種核苷酸序列的核酸；和包含前述物質(zhì)之任一的植物、植物材料(例如，種子)、植物部分、和植物商品產(chǎn)品。一些實(shí)施方案的方面以自Magnaporthe grisea、穎枯小球腔菌 (Leptosphaeria nodorum)、和美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)分離的真菌 delta-9 去飽和酶酶例示。一些例子包括天然的和合成的delta-9去飽和酶，其對(duì)棕櫚酸或硬脂酸具有底物偏愛。
一些實(shí)施方案包括編碼包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列的 delta-9 去飽和酶酶的分離的核酸分子SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52, SEQ IDN0:72 JPSEQ ID N0:73。在具體的例子中，核酸分子包含與選自下組的序列至少60%相同的序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48JPSEQ ID NO:49。這些和其它實(shí)施方案可以包括包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列的分離的 delta-9去飽和酶多肽SEQ ID NO: 12,SEQID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
還公開了在植物細(xì)胞中表達(dá)至少一種前述核酸和/或多肽的方法。具體的實(shí)施方案利用delta-9去飽和酶酶活性，使得飽和脂肪酸的百分比組成在自任何前述物質(zhì)生成的植物、植物材料(例如，種子)、和/或包含植物細(xì)胞的植物部分、和/或植物商品產(chǎn)品中可以降低。在一些實(shí)施方案中，ω-7脂肪酸在植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品產(chǎn)品中可以伴隨增加。
一些實(shí)施方案包括用于減少植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品產(chǎn)品中飽和脂肪酸量的方法，該方法包括用編碼本發(fā)明的delta-9去飽和酶多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使得細(xì)胞中的飽和脂肪酸量減少。一些實(shí)施方案包括用于創(chuàng)建遺傳工程化植物的方法，所述遺傳工程化植物與同一物種的野生型植物相比在植物中包含減少的飽和脂肪酸量。此類方法可以包括用編碼本發(fā)明的delta-9去飽和酶多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料 (或植物細(xì)胞)，并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物材料(或植物細(xì)胞)以獲得植物。在具體的例子中，可以用編碼本發(fā)明的delta-9去飽和酶多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化來自擬南芥物種的植物細(xì)胞和/ 或植物材料。
前述和其它特征從幾個(gè)實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述及參照進(jìn)行的附圖看會(huì)變得更加顯而易見。
附圖簡述


圖1包括對(duì)多種真菌去飽和酶蛋白質(zhì)序列的示意性系統(tǒng)發(fā)生分析。將描繪的去飽和酶的完整蛋白質(zhì)序列使用ClustalX比對(duì)，并使用MEGA展示。
圖2(a_d)包括真菌delta-9去飽和酶基因序列的比對(duì)。大寫字體代表此比對(duì)中的保守核苷酸。陰影字體代表此比對(duì)中的相同核苷酸。
圖3 (a-b)包括真菌delta-9去飽和酶多肽的比對(duì)。
圖4-18包括包含可用于一些實(shí)施方案的真菌delta-9去飽和酶多肽編碼核苷酸序列的例示性質(zhì)粒的質(zhì)粒圖。圖4明確包括包含LnD9DS-2編碼(圖4a;pDAB110110)和 HzD9DS 編碼(圖 4b;pDAB110112)核苷酸序列且進(jìn)一步包含 PvPhas5’UTR 和 PvPhas3’UTR 的例示性質(zhì)粒的質(zhì)粒圖。
圖19包括的數(shù)據(jù)顯示了來自用某些例示性真菌delta-9去飽和酶基因序列轉(zhuǎn)化的植物的例示性T2擬南芥種子的總飽和脂肪酸含量(%FAMEs)。
圖20包括的數(shù)據(jù)顯示了來自用某些例示性真菌delta-9去飽和酶基因序列轉(zhuǎn)化的植物的例示性T2擬南芥種子的棕櫚酸(C16:0)含量(%FAME)。
圖21包括的數(shù)據(jù)顯示了來自用某些例示性真菌delta-9去飽和酶基因序列轉(zhuǎn)化的植物的例示性T2擬南芥種子的硬脂酸(C18:0)含量(%FAME)。
圖22包括的數(shù)據(jù)顯示了來自用某些例示性真菌delta-9去飽和酶基因序列轉(zhuǎn)化的植物的例示性T2擬南芥種子的棕櫚油酸(C16:l)含量(%FAME)。
圖 23 包括來自用 pDAB7319(AnD9DS v3 和 LnD9DS_2 v2)或 pDAB7324(AnD9DS v3 和 HzD9DS v2)轉(zhuǎn)化的蕓苔植物的發(fā)育種子中HzD9DS和LnD9DS-2mRNA轉(zhuǎn)錄物(相對(duì)于AnD9DS 轉(zhuǎn)錄物)積累的圖示。相對(duì)于肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄物水平測(cè)定每種基因的qRT-PCRA ACt，然后相對(duì)于每種樣品中AnD9DS轉(zhuǎn)錄物的水平標(biāo)準(zhǔn)化HzD9DS和LnD9DS_2轉(zhuǎn)錄物的量。
序列表
所附序列表中列出的核酸序列使用如37C. F. R. §1. 822中限定的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫顯示。僅顯示每種核酸序列的一條鏈，但是互補(bǔ)鏈理解為通過對(duì)展示鏈的任意提及而包括在內(nèi)。在所附序列表中
SEQ ID NO:1 顯不了用于 PCR 擴(kuò)增 Magnaporthe grisea 酸基-CoAdelta-9 去飽和酶基因(在一些地方稱為MgD9DS)片段的正向引物。
SEQ ID NO: 2顯示了用于PCR擴(kuò)增M. grisea酰基-CoA delta-9去飽和酶基因 (在一些地方稱為MgD9DS)片段的反向引物。
SEQ ID N0:3顯示了通過PCR擴(kuò)增的M. grisea酰基-CoA delta-9去飽和酶基因 (在一些地方稱為MgD9DS)的例示性片段。
SEQ ID NO:4顯示了例示性的無內(nèi)含子的MgD9DS克隆。
SEQ ID NO:5顯示了編碼第一穎枯小球腔菌?；?CoA delta-9去飽和酶(在一些地方稱為LnD9DS-l)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:6和7顯不了可以用于一些實(shí)施方案的引物序列。
SEQ ID N0:8顯示了顯示了編碼第二例示性穎枯小球腔菌?；?CoAdelta_9去飽和酶(在一些地方稱為LnD9DS-2)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:9顯示了來自M. grisea的例示性天然delta-9去飽和酶基因(標(biāo)記為 MgD9DS vl)的編碼區(qū)。
SEQ ID N0:10顯示了來自美洲棉鈴蟲的例示性天然delta-9去飽和酶基因(標(biāo)記為HzD9DS vl)的編碼區(qū)。
SEQ ID N0:11顯示了來自穎枯小球腔菌的例示性天然delta-9去飽和酶 (LnD9DS-2vl)基因的編碼區(qū)。
SEQ ID NO: 12顯示了來自M. grisea的例示性天然delta-9去飽和酶(MgD9DS)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13顯示了來自美洲棉鈴蟲的例示性天然delta-9去飽和酶(HzD9DS) 的氨基酸序列.
SEQ ID NO: 14顯示了來自穎枯小球腔菌的例示性天然delta-9去飽和酶 (LnD9DS-2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15顯示了例示性的經(jīng)蕓苔優(yōu)化的來自M. grisea的delta-9去飽和酶基因(MgD9DS v2)的序列。
SEQ ID NO: 16顯示了例示性的經(jīng)蕓苔優(yōu)化的來自美洲棉鈴蟲的delta-9去飽和酶基因(HzD9DS v2)的序列。
SEQ ID NO: 17顯示了例示性的經(jīng)蕓苔優(yōu)化的來自穎枯小球腔菌的delta-9去飽和酶基因(LnD9DS-2 v2)的序列。
SEQ ID NO: 18-39顯示了可以用于一些實(shí)施方案的引物和探針的序列。
SEQ ID N0:40_43顯不了可以在一些實(shí)施方案中用于提高表達(dá)的例不性備選 Kozak序列ο
SEQ ID N0:44顯示了別的例示性的經(jīng)蕓苔優(yōu)化的來自穎枯小球腔菌的delta-9去飽和酶基因(LnD9DS-2 v3)的序列。
SEQ ID N0:45顯示了別的例示性的經(jīng)蕓苔優(yōu)化的來自美洲棉鈴蟲的delta-9去飽和酶基因(HzD9DS v3)的序列。
SEQ ID NO:46顯示了 Myc標(biāo)簽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47顯示了 HA標(biāo)簽的氨基酸序列。
SEQ ID N0:48顯示了編碼構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶(在一些地方稱為AnD9DS v2)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:49顯示了編碼構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶(在一些地方稱為AnD9DS v3)的第二種例示性核酸序列。N0:50顯示了如以SEQ ID N0:48_49 (AnD9DS)例示的核酸編碼的氨基酸序NO: 51顯示了另一種例示性AnD9DS去飽和酶的氨基酸序列。NO:52顯示了來自釀酒酵母的例示性天然delta-9去飽和酶(ScOLEl)的NO:53-66顯不了可以用于一些實(shí)施方案的質(zhì)粒。NO :67-71包括可以用于一些實(shí)施方案的幾種核酸調(diào)節(jié)控制元件。NO: 72顯示了例示性AnD9DS去飽和酶的N端68個(gè)殘基(1_68)。NO: 73顯示了例示性AnD9DS去飽和酶的C端175個(gè)殘基(281-455)。NO:74顯示了質(zhì)粒pDABllOllO的圖。NO:75顯示了質(zhì)粒pDAB110112的圖。N0:76顯示了編碼例示性M. grisea?；?CoA delta-9去飽和酶(在一些地方稱為MgD9DS)的例示性核酸序列。
SEQ ID NO:77顯示了來自穎枯小球腔菌的例示性天然delta-9去飽和酶SEQ ID NO: 14內(nèi)包含的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78顯示了來自美洲棉鈴蟲的例示性天然delta-9去飽和酶SEQ ID NO: 13內(nèi)包含的氨基酸序列。
發(fā)明詳述`
1.幾個(gè)實(shí)施方案的概述
我們先前將來自構(gòu)巢曲霉的真菌?；?CoA delta-9去飽和酶導(dǎo)入蕓苔中，由此實(shí)現(xiàn)種子油中降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請(qǐng)公開文本US2008/0260933A1。構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶在種子油中對(duì)硬脂酸酯￠1-90%)比對(duì)更豐富的棕櫚酸酯脂肪酸
SEQID列。
SEQID
SEQID氨基酸序列。
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID(36-49%)提供更大的消減。因此，優(yōu)先對(duì)棕櫚酸酯飽和物起作用的delta-9去飽和酶的共導(dǎo)入會(huì)通過互補(bǔ)構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶的硬脂酸酯優(yōu)選活性來實(shí)現(xiàn)總飽和物的進(jìn)一步降低。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，公開了具有一定底物特異性范圍的真菌delta-9去飽和酶多肽。具體的實(shí)施方案包括棕櫚酸酯優(yōu)選性delta-9去飽和酶(例如，如本文中公開的天然真菌酶，或其功能性等同物；和設(shè)計(jì)為具有棕櫚酸底物偏愛的合成多肽)。
本文中公開了編碼delta-9去飽和酶多肽的核酸分子，其包含與選自下組的序列至少 60% 相同的核苷酸序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDN0:15, SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQID NO:48和SEQ ID NO:49。在一些實(shí)施方案中，核酸分子可以進(jìn)一步包含與delta-9去飽和酶多肽編碼序列可操作連接的基因調(diào)節(jié)元件。在具體的實(shí)施方案中，基因調(diào)節(jié)元件可以是菜豆蛋白啟動(dòng)子、菜豆蛋白5’非翻譯區(qū)、菜豆蛋白3’非翻譯區(qū)、 根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)ORFl 3’非翻譯區(qū)、木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子、煙草(Nicotiana tabacum) RB7基質(zhì)附著區(qū)、T鏈邊界序列、LfKCS3啟動(dòng)子、和FAEl啟動(dòng)子。
還公開了 delta-9去飽和酶多肽及編碼此類delta-9去飽和酶多肽的核酸分子， 所述delta-9去飽和酶多肽包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:50，SEQ IDNO:52，SEQ ID NO:72和SEQ ID N0:73。
在一些實(shí)施方案中，可以在植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物中表達(dá)核酸分子和 delta-9去飽和酶多肽，以相對(duì)于同一物種的野生型植物中觀察到的量,減少植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物中飽和脂肪酸的量。本發(fā)明的備選實(shí)施方案包括用于減少植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物中飽和脂肪酸量的方法。此類方法可以包括用至少一種前述核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物，使得植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物中飽和脂肪酸的量減少。具體的實(shí)施方案包括用于優(yōu)先減少植物材料、細(xì)胞、組織、或全植物中棕櫚酸和/或硬脂酸脂肪酸的方法。
例如，可以對(duì)植物、或自植物衍生的植物材料(例如，擬南芥屬的植物，或蕓苔) 實(shí)施本文中所公開的方法。一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及用于創(chuàng)建或再生遺傳工程化植物的方法，所述遺傳工程化植物與同一物種的野生型植物相比在植物中包含減少的飽和脂肪酸量，所述方法包括用至少一種前述核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或材料；并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物材料以獲得植物。還公開了通過任何前述方法獲得的植物、植物材料、植物細(xì)胞、和種子。
I1.縮寫
ΧγΔζ含有X個(gè)碳和從羧基端開始數(shù)起第
ACP酰基載體蛋白
COA輔酶A
FA脂肪酸`
FAM熒光素
FAS脂肪酸合成
FAME脂肪酸甲酯
KASIIβ -酮脂酰-ACP合酶II
MUFA 單不飽和脂肪酸
WT野生型
II1.術(shù)語
脂肪酸如本文中使用的，術(shù)語“脂肪酸”指例如從約C12至C22的不同鏈長的長鏈脂肪族酸(鏈烷酸)，盡管更長和更短鏈長的酸兩者是已知的。脂肪酸的結(jié)構(gòu)以符號(hào)x:yAz 表示，其中“X”是特定脂肪酸中碳(C)原子的總數(shù)，且“y”是碳鏈中如從該酸的羧基端開始數(shù)起的第“z”位中的雙鍵數(shù)目。
代謝途徑術(shù)語“代謝途徑”指細(xì)胞內(nèi)存在的、由酶催化以實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化或另一代謝途徑啟動(dòng)的一系列化學(xué)反應(yīng)。代謝途徑可以牽涉幾個(gè)或許多步驟，并且可以與不同代謝途徑競(jìng)爭(zhēng)特定反應(yīng)底物。類似地，一種代謝途徑的產(chǎn)物可以是又一代謝途徑的底物。
代謝工程出于本發(fā)明的目的，“代謝工程”指改變細(xì)胞中的一種或多種代謝途徑， 使得在細(xì)胞中運(yùn)行的總代謝途徑的總體方案內(nèi)實(shí)現(xiàn)將初始底物逐步修飾為具有期望的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的理性策略設(shè)計(jì)。
去飽和酶如本文中使用的，術(shù)語“去飽和酶”指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即，引入雙鍵)以生成感興趣的脂肪酸或前體的多肽。植物可溶性脂肪酸去飽和酶酶可以將雙鍵區(qū)域?qū)Ｒ恍砸腼柡偷孽；?ACP底物中。酰基-CoA去飽和酶將雙鍵區(qū)域?qū)Ｒ恍砸腼柡偷闹觉；?CoA底物中。該反應(yīng)牽涉通過由形成去飽和酶構(gòu)造核心的四螺旋束配位的兩電子還原性二鐵中心活化分子氧。一些實(shí)施方案中特別感興趣的是?；?CoA delta-9去飽和酶。
delta-9-18 IO1-ACP去飽和酶是所有植物維持膜流動(dòng)性需要的。雖然此酶主要使硬脂酰-ACP去飽和，但是它在棕櫚酰-ACP的情況中也在微小的程度上有活性。
變體去飽和酶如本文中使用的，術(shù)語“變體去飽和酶”涵蓋展現(xiàn)出與在生成不常見的脂肪酸中的作用一致的比活譜的那些去飽和酶。變體去飽和酶可以自生物體分離，經(jīng)由定向進(jìn)化程序來工程化改造，或者工程化改造為摻入來自一種或多種表征過的去飽和酶的保守氨基酸的合成去飽和酶。
后代植物出于本發(fā)明的目的，“后代植物”指可以通過植物育種方法獲得的任何植物，或自其獲得的植物材料。植物育種方法是本領(lǐng)域中公知的，并且包括天然育種、人工育種、牽涉DNA分子標(biāo)志分析的選擇育種、轉(zhuǎn)基因?qū)W、和商業(yè)育種。
植物材料如本文中使用的，術(shù)語“植物材料”指自植物獲得的任何細(xì)胞或組織。
核酸分子核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有義和反義鏈兩者、cDNA、基因組DNA、和上述物質(zhì)的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核苷酸、或任一類核苷酸的經(jīng)修飾形式。如本文中使用的，“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義的。 該術(shù)語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯(lián)接連接在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸之任一或兩者。
核酸分子可以經(jīng)過化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易領(lǐng)會(huì)`的。此類修飾包括例如標(biāo)記物、甲基化、用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、懸垂的模塊(moiety)(例如，`肽)、插入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素，等等)、螯合劑、燒化劑(alkylator)、和經(jīng)修飾的連接(例如,alpha異頭核酸,等等)。術(shù)語“核酸分子”還包括任何拓?fù)鋵W(xué)構(gòu)象，包括單鏈、雙鏈，部分雙鏈體、三聯(lián)體、發(fā)夾、環(huán)形和掛鎖構(gòu)象。
可操作連接的當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄性谂c第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，若啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子與編碼序列可操作連接。在重組生成時(shí)，可操作連接的核酸序列一般是連續(xù)的，且在必需連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，在同一閱讀框中。然而，核酸為了可操作連接不需要是連續(xù)的。
調(diào)節(jié)元件如本文中使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”指具有基因調(diào)節(jié)活性的核酸分子； 即具有影響可操作連接的可轉(zhuǎn)錄核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯的能力的核酸分子。調(diào)節(jié)元件諸如啟動(dòng)子、前導(dǎo)物、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是具有基因調(diào)節(jié)活性的非編碼核酸分子，其在活細(xì)胞的總體基因表達(dá)中發(fā)揮不可或缺的作用。因此，在植物中發(fā)揮功能的分離的調(diào)節(jié)元件可用于經(jīng)由分子工程化技術(shù)修飾植物表型。“調(diào)節(jié)元件”意指決定是否表達(dá)特定基因、何時(shí)表達(dá)特定基因、及以何種水平表達(dá)特定基因的一系列核苷酸。調(diào)節(jié)DNA序列與調(diào)節(jié)蛋白或其它蛋白質(zhì)特異性相互作用。
如本文中使用的，術(shù)語“基因調(diào)節(jié)活性”指能夠影響可操作連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸分子。具有基因調(diào)節(jié)活性的分離的核酸分子可以提供可操作連接的核酸分子的時(shí)間或空間表達(dá)或調(diào)控表達(dá)水平和速率。具有基因調(diào)節(jié)活性的分離的核酸分子可以包括啟動(dòng)子、內(nèi)含子、前導(dǎo)物、或3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
啟動(dòng)子如本文中使用的，術(shù)語“啟動(dòng)子”指牽涉RNA聚合酶II或其它蛋白質(zhì)諸如轉(zhuǎn)錄因子(調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白因子)的識(shí)別和結(jié)合以啟動(dòng)可操作連接的基因轉(zhuǎn)錄的核酸分子。啟動(dòng)子可以自身含有招致可操作連接的基因轉(zhuǎn)錄的亞元件諸如順式元件或者增強(qiáng)子域?！爸参飭?dòng)子”是在植物細(xì)胞中功能性的天然的或非天然的啟動(dòng)子。可以使用植物啟動(dòng)子作為5’調(diào)節(jié)元件以調(diào)控一種或多種可操作連接的基因表達(dá)。植物啟動(dòng)子可以以其時(shí)間、空間、或發(fā)育表達(dá)模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有啟動(dòng)子的核酸序列。
序列同一性如本文中在兩種核酸或多肽序列的背景中所使用的，術(shù)語“序列同一性”或“同一性”可以指兩種序列中在規(guī)定的比較窗里為 了實(shí)現(xiàn)最大對(duì)應(yīng)性而比對(duì)時(shí)相同的殘基。
兩種核酸序列間或兩種氨基酸序列間的相似性按照序列間共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，兩種序列越相似。用于比對(duì)比較序列的方法在下文詳細(xì)描述。
在提及蛋白質(zhì)使用序列同一性百分比時(shí)，認(rèn)可的是，不相同的殘基位置經(jīng)常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸殘基用具有類似化學(xué)特性(例如，電荷、疏水性或空間效應(yīng))的其它氨基酸殘基取代，并且因此不改變分子的功能特性。
因此，在序列相差保守取代時(shí)，百分比序列同一性可以向上調(diào)節(jié)以校正不相同殘基位點(diǎn)處取代的保守性質(zhì)。相差此類保守取代的序列被說成具有“序列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行此調(diào)節(jié)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。通常，此類技術(shù)牽涉將保守取代評(píng)分為部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在對(duì)相同的氨基酸給予0-1的得分，而對(duì)非保守取代給予O得分的情況中，對(duì)保守取代給予0-1的得分。可以計(jì)算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA)中執(zhí)行的。
如本文中所使用的，術(shù)語“序列同一性百分比”可以指在比對(duì)窗里比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列時(shí)測(cè)定的數(shù)值，其中為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，比較窗中序列的部分與參照序列 (其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通過測(cè)定兩個(gè)序列中存在相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比來計(jì)算百分比。
氨基酸序列中的類似位置可以通過前述段落中所描述的方法比對(duì)核酸和氨基酸序列。在比對(duì)時(shí)，若各位置在共有序列內(nèi)是相同的，則一個(gè)序列中的位置與比對(duì)序列中的位置在“類似位置”中。
用于比對(duì)比較序列的方法是本領(lǐng)域中公知的。各種程序和比對(duì)算法記載于Smith 和 Waterman, Adv. Appl. math. 2 : 482，1981; Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988;Higgins 和 Sharp, Gene73:237-44, 1988;Higgins 和 Sharp, CABI0S5:151-3，1989;Corpet 等，Nucleic Acids Re search16: 10881-10890，1988;Huang,等，Computer Applications in the Biosciences8:155-65， 1992;Pearson 等，Methods in Molecular Biology24:307-31, 1994;Tatiana等，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. , 174:247-50，1990. Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (詳細(xì)考慮序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算)。
國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)基本局部比對(duì)搜索工具(BLAST)在因特網(wǎng)上可獲得(于blast, ncb1. nlm. nih. gov/Blast. cgi),其與序列分析程序,例如blastp和blastn結(jié)合使用。關(guān)于如何使用此程序測(cè)定序列同一'I"生的描述在因特網(wǎng)上經(jīng)由NCBI于blast, ncb1. nlm. nih. gov/ Blast. cgi CMD=ffeb&PAGE_TYPE=BlastDocs 可獲得。
為了比較氨基酸序列 ，使用缺省參數(shù)采用BLAST程序的“Blast2種序列 (Blast2sequence) ”功能(bl2seq)。特定參數(shù)可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷內(nèi)調(diào)節(jié)，以例如提供錯(cuò)配罰分或匹配獎(jiǎng)勵(lì)。
經(jīng)轉(zhuǎn)化的如本文中使用的，術(shù)語“經(jīng)轉(zhuǎn)化的”指已經(jīng)接受外來核酸分子，諸如構(gòu)建體導(dǎo)入的細(xì)胞、組織、器官、或生物體?？梢詫?dǎo)入的核酸分子整合入接受細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組DNA中，使得導(dǎo)入的多核苷酸分子得到后續(xù)后代繼承?！稗D(zhuǎn)基因”或“經(jīng)轉(zhuǎn)化”細(xì)胞或生物體還包括所述細(xì)胞或生物體的后代和自在例如雜交中采用此類轉(zhuǎn)基因植物作為親本的育種程序生成并展現(xiàn)出源自存在外來核酸分子的改變的表型的后代。
IV.減少宿主細(xì)胞、組織、或生物體中飽和脂肪酸的代謝工程方法
A.概述
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在植物種子中弓丨入具有特定?；?CoA偏愛(例如，對(duì)于棕櫚酸或硬脂酸)的delta-9去飽和酶。delta-9去飽和酶的特定?；?CoA偏愛實(shí)現(xiàn)對(duì)某些特定飽和脂肪酸集合(例如，棕櫚酸酯，用于轉(zhuǎn)化成單不飽和產(chǎn)物)的靶向。選擇?；?CoA delta-9去飽和酶來降低植物中的飽和脂肪酸含量，因?yàn)樗鼈兺ǔ２灰匀魏慰刹煊X的程度在植物系統(tǒng)中生成。
B.多肽
依照本發(fā)明的一些實(shí)施方案的多肽包含如下的氨基酸序列，其在與選自下組的序列比對(duì)時(shí)顯示增加的百分比同一性SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:72和SEQ IDNO:73 這些和其它實(shí)施方案內(nèi)的特定氨基酸序列可以包含與前述序列具有例如至少約70%，約75%，約80%，81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%96%，97%, 98%, 99% 或 100% 同一性的序列。在許多實(shí)施方案中，在與前述序列比對(duì)時(shí)具有前述序列同一性的氨基酸序列編碼具有delta-9-18:0-ACP去飽和酶酶促活性的肽，或此類肽的部分。C.核酸—些實(shí)施方案包括編碼上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些實(shí)施方案中的核酸序列在與選自下組的序列比對(duì)是顯示增加的百分比同一性SEQ ID NO:3, SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID N0:48和SEQ IDN0:49。這些和其它實(shí)施方案內(nèi)的特定核酸序列可以包含與選自下組的序列具有例如至少約 60%,約 65%,約 70%,約 75%,約 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%96%，97%, 98%, 99%或 100% 同一性的序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQID NO:9，SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ IDNO: 16，SEQID NO: 17，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，可以 例如通過依照密碼子簡并性引入可允許的核苷酸取代在不實(shí)質(zhì)性改變編碼多肽的氨基酸序列的情況中修飾核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含基因調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子)。啟動(dòng)子可以基于會(huì)接受載體構(gòu)建體插入的細(xì)胞類型選擇。在細(xì)菌、酵母和植物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。啟動(dòng)子也可以基于其調(diào)節(jié)特征進(jìn)行選擇。此類特征的例子包括增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性、可誘導(dǎo)性、組織特異性、和發(fā)育階段特異性。在植物中，已經(jīng)描述了病毒或合成起源的誘導(dǎo)型、組成性活性、時(shí)間調(diào)節(jié)性、和空間調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子。見例如Poszkowski 等(1989)EMBO J. 3:2719;Odell 等(1985)Nature313:810;及 Chau 等(1989)Science244:174-81)。有用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如由通過應(yīng)用安全劑(取代的苯磺酰胺除草劑)誘導(dǎo)的水楊酸或聚丙烯酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、自菠菜硝酸鹽還原酶可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列衍生的硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、和與RuBP羧化酶的小亞基和LHCP家族結(jié)合的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。有用的組織特異性、發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的例子包括￠-伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sa啟動(dòng)子和種子特異性啟動(dòng)子?？捎糜谠诜N子質(zhì)體中優(yōu)先表達(dá)的植物功能性啟動(dòng)子包括那些來自牽涉含油種子中脂肪酸生物合成的蛋白質(zhì)和來自植物儲(chǔ)存蛋白的。此類啟動(dòng)子的例子包括來自可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列諸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、ACP、硬脂酰-ACP去飽和酶、和油質(zhì)蛋白的5’調(diào)節(jié)區(qū)。另一種例示性的組織特異性啟動(dòng)子是種子組織特異性的凝集素啟動(dòng)子。其它有用的啟動(dòng)子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章魚堿合酶啟動(dòng)子(其在根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動(dòng)子；增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子；玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子；來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；來自煙草的EIF-4A啟動(dòng)子(Mandel等,(1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004);玉米鹿糖合成酶；玉米醇脫氫酶I ;玉米光收獲復(fù)合物(light harvesting compolex);玉米熱休克蛋白；來自擬南芥的幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子；LTP(脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白)啟動(dòng)子；矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶；豆富含甘氨酸的蛋白I ;馬鈴薯patatin ;泛素啟動(dòng)子；和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。優(yōu)選地，有用的啟動(dòng)子是種子選擇性的、組織選擇性的、或誘導(dǎo)型的。種子特異性調(diào)節(jié)在例如EPO 255 378中有討論。為了獲得更高的異源基因表達(dá)，可以優(yōu)選的是再工程化改造基因，使得它在表達(dá)宿主細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞，例如，蕓苔、稻、煙草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表達(dá)。因此，設(shè)計(jì)植物表達(dá)的編碼delta-9去飽和酶的基因中任選的額外步驟(即，在提供一種或多種基因調(diào)節(jié)元件外)是為了最佳表達(dá)而再工程化改造異源基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)。具體的實(shí)施方案包括再設(shè)計(jì)的基因，其經(jīng)過優(yōu)化以提高在轉(zhuǎn)基因蕓苔植物細(xì)胞或擬南芥植物細(xì)胞中，而不是在用天然存在的異源基因序列轉(zhuǎn)化的蕓苔植物細(xì)胞或擬南芥植物細(xì)胞中的表達(dá)水平(即，生成更多蛋白質(zhì))。由于由遺傳密碼的冗余性/簡并性提供的可塑性(即，一些氨基酸由超過一種密碼子規(guī)定)，不同生物體或生物體類中的基因組進(jìn)化已經(jīng)導(dǎo)致同義密碼子的差別選擇。此“密碼子偏愛”在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中得到反映。例如，具有含相當(dāng)較低G+C含量的基因組的生物體利用更多的在同義密碼子的第三位具有A或T的密碼子，而那些具有較高G+C含量的生物體利用更多的在第三位具有G或C的密碼子。此外，認(rèn)為mRNA內(nèi)“次要”密碼子的存在可以降低 所述mRNA的絕對(duì)翻譯速率，尤其在與次要密碼子對(duì)應(yīng)的帶電荷的tRNA的相對(duì)豐度較低時(shí)。此推理的延伸是通過個(gè)別次要密碼子降低翻譯速率對(duì)于多種次要密碼子至少會(huì)是疊加的。因此，在特定表達(dá)宿主中具有相對(duì)較高次要密碼子含量的mRNA會(huì)具有相應(yīng)較低的翻譯速率。此速率可以通過編碼蛋白質(zhì)的相應(yīng)低水平反映。在工程化改造編碼delta-9去飽和酶的優(yōu)化基因以在蕓苔或擬南芥(或其它植物，諸如稻、煙草、玉米、棉或大豆)中表達(dá)中，若已經(jīng)測(cè)定預(yù)期的宿主植物的密碼子偏愛，則其是有幫助的。存在多種公眾可用的DNA序列數(shù)據(jù)庫，其中可以尋找關(guān)于植物基因組的密碼子分布或各種植物基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息。密碼子偏愛是表達(dá)宿主(例如，植物，諸如蕓苔或擬南芥)使用以編碼其蛋白質(zhì)的氨基酸的密碼子的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。密碼子偏愛可以以單一密碼子相對(duì)所有氨基酸的密碼子的使用頻率計(jì)算。或者，密碼子偏愛可以以單一密碼子用于編碼特定氨基酸，相對(duì)于所述氨基酸的所有其它密碼子(同義密碼子)的頻率計(jì)算。在為delta-9去飽和酶基因的植物表達(dá)設(shè)計(jì)優(yōu)化的編碼區(qū)中，應(yīng)當(dāng)確定植物優(yōu)選的主要(“第一選擇”)密碼子，及優(yōu)選密碼子的第二、第三、第四選擇等等(在存在多種選擇時(shí))。然后，可以設(shè)計(jì)新的編碼delta-9去飽和酶基因氨基酸序列的DNA序列，其中新的DNA序列與天然DNA序列(編碼去飽和酶)不同之處在于取代編碼宿主優(yōu)選性(第一優(yōu)選性、第二優(yōu)選性、第三優(yōu)選性、或第四優(yōu)選性，等等)密碼子以規(guī)定氨基酸序列內(nèi)每個(gè)位置處的氨基酸。然后，對(duì)新的序列分析限制酶位點(diǎn)，其可以已經(jīng)通過修飾創(chuàng)建。通過將這些密碼子用下一優(yōu)選性密碼子替換來進(jìn)一步修飾鑒定的推定限制性位點(diǎn)以除去限制性位點(diǎn)。序列中可以影響異源序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它位點(diǎn)是外顯子內(nèi)含子接合(5’或3’)、多聚-A添加信號(hào)、和/或RNA聚合酶終止信號(hào)。可以進(jìn)一步分析序列，并將其進(jìn)行修飾以降低TA或CG雙聯(lián)體的頻率。在這些雙聯(lián)體外，具有相同的超過約6個(gè)G或C核苷酸的序列區(qū)組也可以不利地影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，有利地，通過將第一或第二選擇的密碼子，等等用選擇的下一優(yōu)選性密碼子替換來修飾這些區(qū)組。上文所描述的方法使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修飾對(duì)于特定植物而言外來的基因，使得基因在植物中最佳地表達(dá)。所述方法在PCT申請(qǐng)W097/13402中進(jìn)一步例示。如此，可以使用與一些實(shí)施方案的去飽和酶/基因在功能上等同的經(jīng)優(yōu)化的合成基因來轉(zhuǎn)化宿主，包括植物。關(guān)于生成合成基因的更多指導(dǎo)可以參見例如美國專利5，380，831。一旦在紙上或在計(jì)算機(jī)芯片中設(shè)計(jì)出經(jīng)植物優(yōu)化的DNA序列，可以在實(shí)驗(yàn)室中合成實(shí)際的DNA分子以在序列上精確對(duì)應(yīng)于設(shè)計(jì)的序列?？梢詫⒋祟惡铣傻腄NA分子克隆，并以其它方式操作，完全就像它們?cè)醋宰匀换蛱烊粊碓茨菢?。D.用于遺傳轉(zhuǎn)化植物材料的方法一些實(shí)施方案涉及生成包含一種或多種核酸分子的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述核酸分子包含與選自下組的序列至少60%相同的核酸序列SEQ IDNO :3, SEQ ID NO :4, SEQID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10, SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ IDNO: 16，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。此類核酸分子還可以包含例如非編碼調(diào)節(jié)元件，諸如啟動(dòng)子。也可以將其它序列與非編碼調(diào)節(jié)元件和可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列一起導(dǎo)入細(xì)胞中。這些其它序列可以包含3’轉(zhuǎn)錄終止子、3’多聚腺苷酸化信號(hào)、其它非翻譯序列、轉(zhuǎn)運(yùn)或靶向序列、選擇標(biāo)志、增強(qiáng)子、和操縱基因。一般地，轉(zhuǎn)化方法包括下列步驟選擇合適的宿主細(xì)胞，用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一般地，這些方法可以分成5類(I)化學(xué)方法(Graham和Van der Eb (1973)Virology54(2):536-9;Zatloukal 等(1992)Ann. N. Y. Acad. Sc1. 660:136-53); (2)物理方法，諸如微注射(Capechi (1980) Cel 122 (2) :479-88)、電穿孔(Wong 和 Neumann (1982)Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7;Fromm 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sc1.USA82 (17) : 5824-8;美國專利 5，384，253)、和顆粒加速(Johnston 和 Tang (1994) MethodsCell Biol. 43 (A) : 353-65; Fynan 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA90 (24) : 11478-82; (3)病毒載體(Clapp(1993)Clin. Perinatol. 20(1) : 155-68;Lu 等(1993)J.Exp.Med. 178(6):2089-96;Eglitis 和 Anderson(1988)Biotechniques6(7):608-14) ;(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel 等(1992)Hum. Gen. Ther. 3 (2) : 147-54; Wagner 等(1992)Proc. Natl.Acad. Sc1. USA89 (13) :6099-103);和(5)細(xì)菌介導(dǎo)的機(jī)制，諸如用土壤桿菌?；蛘?，可以通過直接注射植物的生殖器官來將核酸直接導(dǎo)入花粉中。Zhou等(1983)Methods inEnzymologylOl:433;Hess(1987)Intern. Rev. Cytol. 107:367;Luo 等(1988)Plant Mol.Biol. Reporter6:165;Pena等(1987)Nature325:274。其它轉(zhuǎn)化方法包括例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如美國專利5，508, 184中例示的。也可以將核酸分子注射入未成熟的胚中。Neuhaus等(1987)Theor. Appl. Genet. 75:30。最常使用的用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移方法(Fraley 等(1983)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80:4803)(如美國專利 5, 824, 877;美國專利5，591，616;美國專利5，981，840;和美國專利6，384，301中例示的)和生物射彈或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即，基因槍)(諸如記載于美國專利5，550,318;美國專利5，538,880;美國專利6，160，208;美國專利6，399,861;和美國專利6，403，865)。通常，核轉(zhuǎn)化是期望的，但是在期望特異性轉(zhuǎn)化質(zhì)體，諸如葉綠體或造粉體的情況中，可以對(duì)某些植物物種諸如擬南芥、煙草、馬鈴薯和蕓苔物種利用期望的核酸分子的微粒介導(dǎo)的遞送來轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。經(jīng)由使用屬于土壤桿菌屬的遺傳工程化土壤細(xì)菌實(shí)現(xiàn)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。幾種土壤桿菌物種介導(dǎo)轉(zhuǎn)移稱為“T-DNA”的特定DNA，其可以遺傳工程化改造為將任何期望的DNA部分?jǐn)y帶入許多植物物種中。標(biāo)記T-DNA介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制過程的主要事件是誘導(dǎo)毒力基因、和加工并轉(zhuǎn)移TDNA。此過程是許多綜述的主題。見例如Ream(1989)Ann. Rev.Phytopathol. 27:583-618;Howard 和 Citovsky(1990)Bioassaysl2:103-8;Kado (1991)Crit. Rev. Plant Sc1. 10:1-32;Zambryski(1992)Annual Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 43:465-90;Gelvin(1993)于Transgenic Plants, Kung和Wu編，Academic Press, SanDiego, CA,第 49 頁-第 87 頁；Binns 和 Howitz (1994)于 Bacterical Pathogenesisof Plants and Animals, Dang 編，Berlin:Springer Verlag.，第 119-38 頁;Hooykaas和 Beijersbergen(1994)Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79;Lessl 和 Lanka(1994)Cell77:321-4;及 Zupan 和 Zambryski(1995)Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618。為了對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞選擇或評(píng)分(不管轉(zhuǎn)化方法如何)，導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA可以含有在可再生的植物組織中發(fā)揮功能以生成化合物的基因，所述化合物對(duì)植物組織賦予對(duì)否則有毒性的化合物的抗性。作為選擇、篩選、或評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)物使用的感興趣的基因包括但不限于￠-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、螢光素酶、和抗生素或除草劑耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括賦予對(duì)青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博來霉素)； 甲氨蝶呤(和甲氧芐啶)；氯霉素；和四環(huán)素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草劑抗性基因賦予。Della-Cioppa等(1987)Bio/Technology5:579_84。也可以執(zhí)行其它選擇裝置，包括例如但不限于對(duì)膦絲菌素(phosphinothricin)、雙丙氨磷和正向選擇機(jī)制的耐受性(Joersbro等(1998)Mol.Breed. 4:111-7)，并且認(rèn)為在本發(fā)明的實(shí)施方案的范圍內(nèi)。然后，可以容許通過選擇或篩選鑒定并在支持再生的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞成熟成植物。目前公開的方法可以與任何可轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織一起使用。如本文中使用的，可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織包括但不限于能夠進(jìn)一步增殖以產(chǎn)生植物的那些細(xì)胞或組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可許多植物細(xì)胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中在插入外源DNA和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件后植物細(xì)胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、未成熟的花序、枝分生組織、節(jié)外植體、愈傷組織、下胚軸組織、子葉、根、和葉。自經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育、和培養(yǎng)植物是本領(lǐng)域中已知的。Weissbach 和 Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,(編)AcademicPress, Inc. , San Diego, CA;Horsch 等(1985) Science227:1229-31。此再生和生長方法通常包括下列步驟選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并將那些細(xì)胞培養(yǎng)到胚發(fā)育的通常階段到生根的小植物階段。類似地，再生轉(zhuǎn)基因的胚和種子。在此方法中，一般將轉(zhuǎn)化體在存在選擇培養(yǎng)基的情況中培養(yǎng)，所述選擇培養(yǎng)基選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并誘導(dǎo)植物幼芽(shoot)的再生。Fraley 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80:4803。這些幼芽通常在 2 至 4 個(gè)月內(nèi)獲得。此后，將所得的轉(zhuǎn)基因生根幼芽在合適的植物生長培養(yǎng)基諸如土壤中種植?？梢詫⑿颐庥诒┞队谶x擇劑的細(xì)胞，或已經(jīng)在篩選測(cè)定法中得分為正的細(xì)胞在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，可以將幼芽轉(zhuǎn)移至合適的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有選擇劑和防止細(xì)菌生長的抗生素。許多幼芽會(huì)形成根。然后，將這些移植至土壤或其它培養(yǎng)基以容許根的繼續(xù)發(fā)育。一般地，如上文概述的方法會(huì)根據(jù)采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的細(xì)節(jié)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷內(nèi)。再生的轉(zhuǎn)基因植物可以自花傳粉以提供純合轉(zhuǎn)基因植物。或者，可以將自再生的轉(zhuǎn)基因植物獲得的花粉與非轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選地，農(nóng)藝學(xué)重要的物種的近交系雜交。相反，可以使用來自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉來給再生的轉(zhuǎn)基因植物傳粉。轉(zhuǎn)基因植物可以將轉(zhuǎn)化的核酸序列傳遞給其后代。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物是在轉(zhuǎn)化的核酸序列方面是純合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而將所述序列遺傳給所有其后代?？梢宰杂赊D(zhuǎn)基因植物生成的種子培養(yǎng)后代。然后，可以將這些其它植物自花傳粉以生成真正的植物育種系?？梢詫?duì)來自這些植物的后代評(píng)估基因表達(dá)，等等?？梢酝ㄟ^幾種常見的方法諸如Western印跡、Northern印跡、免疫沉淀、和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)檢測(cè)基因表達(dá)。也可以對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物分析導(dǎo)入的DNA的存在和由本發(fā)明的核酸分子和氨基酸分子賦予的表達(dá)水平和/或脂肪酸譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于分析經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的許多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印跡或Northern印跡、基于PCR的方法、生物化學(xué)測(cè)定法、表型篩 選法、田間評(píng)估、和免疫診斷測(cè)定法。用于特異性轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。已經(jīng)對(duì)許多作物，包括但不限于擬南芥屬的成員、棉(棉(Gossypium hirsutum))、大豆(大豆(Glycine max))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、和蕓苔屬的成員描述了使用這些方法的轉(zhuǎn)化和植物再生。已經(jīng)對(duì)棉(美國專利5，004，863;美國專利5，159，135;美國專利 5, 518, 908);大豆(美國專利 5, 569, 834;美國專利 5，416，011; McCabe 等(1988)Biotechnology6:923;Christou 等(1988)Plant Physiol. 87:671-4);(美國專利5, 463, 174);花生(Cheng 等(1996)Plant Cell R印 15:653-7;McKently 等(1995)PlantCell Rep. 14:699-703);蕃木瓜；和豌豆(Grant等(1995)Plant Cell Rep. 15:254-8)發(fā)表了主要通過使用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法也是本領(lǐng)域中公知的。已經(jīng)對(duì)許多作物，包括但不限于大麥(大麥(Hordeum vuIgarae));玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays));燕麥(燕麥(Avenasativa));野茅(野茅(Dactylis glomerata));稻(稻(Oryza sativa),包括印度和日本變種)；高粱(高粱(Sorghum bicolor));甘鹿(甘鹿(Saccharum sp));華狀羊茅(華狀羊茅(Festuca arundinacea));草地草(turfgrass)物種(例如，匍莖剪股穎(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、維穗純?nèi)~草(Stenotaphrum secundatum))；小麥(小麥(Triticum aestivum));和苜猜(苜猜(Medicago sativa))描述了使用這些方法的轉(zhuǎn)化和植物再生。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用并修改許多轉(zhuǎn)化方法以對(duì)許多感興趣的目標(biāo)作物生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物?？梢赃x擇任何植物在目前公開的方法中使用。依照本發(fā)明修飾的優(yōu)選的植物包括例如但不限于含有種子植物、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、琉璃苣(琉璃苣屬(Borago)物種)、蕓苔(Canola)(蕓苔(Brassica)物種)、蓖麻(蓖麻(Ricinuscommunis))、可可豆(可可(Theobroma cacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉屬(Gossypium)物種)、兩節(jié)莽屬(Crambe)物種、萼距花屬(Cuphea)物種、亞麻亞麻物種)、小濱菊屬(Lesquerella)和鯨油草(Limnanthes)物種、Linola、旱金蓮(旱金蓮屬(Tropaeolum)物種)、月見草屬(Oenothera)物種、橄欖(olive)(木樨欖屬(Olea)物種)、棕櫚(油棕屬(Elaeis)物種)、花生(花生屬(Arachis)物種)、油菜籽(rapeseed)、紅花(紅花屬(Carthamus)物種)、大豆(大豆屬(Glycine)和野生大豆(Soja)物種)、向日葵(向日葵屬(Helianthus)物種)、煙草(煙草屬(Nicotiana)物種)、斑鳩菊屬(Vernonia)物種、小麥(小麥屬(Triticum)物種)、大麥(大麥屬(Hordeum)物種)、稻(稻屬(Oryza)物種)、燕麥(燕麥屬(Avena)物種)、高粱(高粱屬(Sorghum)物種)、和黑麥(黑麥屬(Secale)物種)或禾本科(Gramineae)的其它成員。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用并修改許多轉(zhuǎn)化方法以對(duì)許多感興趣的目標(biāo)作物生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。E.轉(zhuǎn)基因種子在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以包含delta-9去飽和酶多肽，其包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO: 12，SEQ IDN0:13, SEQ ID NO: 14，SEQ IDNO: 50，SEQ ID NO: 51，SEQ ID NO: 52，SEQID NO: 72 和 SEQ ID NO: 73。在這些和其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以包含與 選自下組的序列至少60%相同的核酸序列SEQ ID NO:3, SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44，SEQ IDNO:45，SEQ ID NO:48和SEQ IDN0:49。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以展現(xiàn)出降低的飽和脂肪酸(例如，棕櫚酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平。可以自能育轉(zhuǎn)基因植物收獲種子，并可以用于培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的后代世代，包括包含如上文所列的至少一種核酸序列，和任選地至少一種別的感興趣的基因或核酸構(gòu)建體的雜種植物系。提供以下實(shí)施例來例示某些具體的特征和/或?qū)嵤┓桨浮＿@些實(shí)施例不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限于所描述的具體特征或?qū)嵤┓桨浮?br> 實(shí)施例實(shí)施例1 :?；?Cok delta-9去飽和酶的克隆和在olel缺陷型酵母中的功能性表征Magnaporthe grisea -CoA delta_9 去t包矛口IS白勺克 1 :使用引物自基因組DNA分離Magnaporthe grisea酸基-CoA delta-9去飽和酶基因(MgD9DS)，所述引物基于最初注釋為“假設(shè)的蛋白質(zhì)”，并且在核苷酸水平與釀酒酵母酰基-CoA delta-9去飽和酶(即，0LE1)具有55. 4%同一性的發(fā)表的NCBI/Broad研究所序列。設(shè)計(jì)正向和反向引物，長度各為41個(gè)堿基對(duì)。正向引物MgA9F(SEQ ID NO:1)包括5’端的EcoRI位點(diǎn)。反向引物Mg9AR(SEQ ID NO: 2)含有三個(gè)閱讀框之每個(gè)中的終止密碼子和末端XhoI位點(diǎn)。使用Takara EZ Taq PCR試劑盒(Takara Bio Inc.，Otsu, Shiga, Japan)遵循制造商的方案PCR擴(kuò)增MgD9DS基因。擴(kuò)增條件是94° C達(dá)I分鐘，接著是94° C達(dá)30秒、60° C達(dá)60秒、和于72。C延伸90秒的30個(gè)循環(huán)。于72。C實(shí)施最終的延伸步驟達(dá)10分鐘。自瓊脂糖凝膠切出預(yù)期的1，425個(gè)堿基對(duì)PCR產(chǎn)物，并使用Montage旋轉(zhuǎn)柱按照制造商的推薦(Millipore，Billerica，MA)純化。將純化的片段克隆入.pCR:R'2.1 TOPO 克隆載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。按照供應(yīng)商條件將TOPO反應(yīng)轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)ToplO大腸桿菌細(xì)胞中。將含有推定的克隆的細(xì)菌菌落分離。用Macherey-Nagel NucleospinDNA 分離試劑盒(Machery-NageI，Neumann-Neander-Strasse, Diiren, Germany)實(shí)施微量質(zhì)粒制備，并用EcoRI和XhoI限制性酶消化DNA。鑒定含有預(yù)期的1，425bp MgD9DS基因片段的陽性克隆。經(jīng)由測(cè)序反應(yīng)獲得核苷酸序列。PCR擴(kuò)增片段的序列以SEQ ID N0:3列出。序列分析揭示位于MgD9DS基因的5’端中的小的(90bp)內(nèi)含子。使用剪接重疊延伸(Splice Overlap Extension)PCR除去內(nèi)含子。將所得的PCR擴(kuò)增子進(jìn)行凝膠純化，
克隆入pCRR2.1「OPO 克隆載體中，并轉(zhuǎn)化入ToplO大腸桿菌細(xì)胞中。經(jīng)由分析來自單
一轉(zhuǎn)化體菌落的純化的DNA的限制酶消化物來鑒定幾個(gè)克隆。對(duì)這些克隆測(cè)序以確認(rèn)無內(nèi)含子的MgD9DS克隆的存在。所得的序列以SEQ ID N0:4列出。將具有和沒有內(nèi)含子的MgD9DS基因各自以EcoRI/XhoI片段亞克隆入酵母表達(dá)載體中。此酵母表達(dá)載體含有構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶(AnD9DS)基因，其側(cè)翼有釀酒酵母delta-9去飽和酶啟動(dòng)子和delta-9去飽和酶3’UTR/終止子。將構(gòu)巢曲霉delta-9去飽和酶基因在EcoRI/XhoI片段上切除，所述EcoRI/XhoI片段用含有MgD9DS基因的片段或含有無內(nèi)含子的MgD9DS基因的片段替換。將含有MgD9DS基因的兩種克隆(一種具有內(nèi)含子，而一種沒有內(nèi)含子)進(jìn)行釀酒酵母轉(zhuǎn)化。
`
使用堿-陽離子酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Qbiogene, Montreal, Canada)轉(zhuǎn)化delta-9去飽和酶缺陷型釀酒酵母菌株(0FY093)，其在具有了^^丨/ 80的酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培養(yǎng)基上維持。根據(jù)在不含Tween '80 (單不飽和脂肪酸補(bǔ)充物)或尿嘧啶的培養(yǎng)基(具有瓊脂的Dropout Base及SC-URA)上生長鑒定互補(bǔ)菌株。將互補(bǔ)菌株在選擇培養(yǎng)基上單菌落純化三次。通過delta-9去飽和酶基因的PCR擴(kuò)增，及對(duì)PCR產(chǎn)物的測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)互補(bǔ)菌株。另外，如下將含有MgD9DS克隆的菌株恢復(fù)成脂肪酸和尿嘧啶依賴性，即將菌株在YPD+Tween 80 :培養(yǎng)基上傳代至少三次，然后將菌株補(bǔ)到不含Tween 80的D0BASC-URA培養(yǎng)基。含有內(nèi)含子的MgD9DS編碼序列的表達(dá)未獲成功，指示酵母機(jī)器沒有剪接內(nèi)含子。通過FAME分析進(jìn)一步表征含有無內(nèi)含子的MgD9DS編碼序列的酵母菌株的底物特異性。穎枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去飽和酶的克隆通過使用BlastN搜索自穎枯小球腔菌EST集合將兩種穎枯小球腔菌EST序列(分別為1，246和429個(gè)堿基對(duì))鑒定為與釀酒酵母酰基-Cok delta-9去飽和酶(0LE1)共享高水平序列同一性(分別為54. 0%和54. 2%)。在比對(duì)時(shí)，這些序列彼此是64. 6%相同的，提示兩種獨(dú)特的穎枯小球腔菌?；?CoA delta-9去飽和酶的存在。通過用1，246bp基因探針篩選穎枯小球腔菌cDNA文庫分離LnD9DS-l基因(SEQ ID N0:5)。獲得此基因的序列，并分離編碼序列。通過首先用429bp EST序列BLAST搜索發(fā)表的Broad研究所穎枯小球腔菌基因組序列來分離LnD9DS-2基因的整個(gè)序列。此搜索將超重疊群(Supercontig) Lnl. 4鑒定為含有與429bp片段具有100%同源性的基因，該基因注釋為編碼“假設(shè)的蛋白質(zhì)”。接著，使用基于Lnl. 4超重疊群序列的PCR引物自穎枯小球腔菌cDNA文庫克隆LnD9DS_2基因。使用的引物序列是Lnd9FAD2F(SEQ IDNO:6)和Lnd9FAD2R(SEQ ID NO: 7) 正向引物設(shè)計(jì)為具有5’ BamHI位點(diǎn)，而反向引物含有三個(gè)閱讀框中的終止密碼子和末端NcOI位點(diǎn)。將穎枯小球腔菌cDNA文庫的等分試樣以1/10稀釋以為PCR反應(yīng)提供400ng模板DNA。使用Takara EZ Taq PCR試劑盒遵循推薦的擴(kuò)增條件實(shí)施PCR擴(kuò)增，所述推薦的擴(kuò)增條件為94° C達(dá)I分鐘，接著是94° C達(dá)30秒、60° C達(dá)60秒、和于72° C延伸90秒的30個(gè)循環(huán)。于72° C實(shí)施最終的延伸步驟達(dá)10分鐘。自瓊脂糖凝膠切出預(yù)期的1，370個(gè)堿基對(duì)產(chǎn)物，并使用Montage旋轉(zhuǎn)柱按照制造商的推薦純化。將純化的片段克隆入pCRR2.1 TOPOr克隆載體中。依照制造商的推薦方案將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)ToplO大腸桿菌細(xì)胞中。將含有推定克隆的菌落分離。用Macherey-Nagel Nucleospin柱實(shí)施微量質(zhì)粒制備，并用BamHI和NcoI限制酶消化DNA。將推定的LnD9DS_2克隆鑒定并測(cè)序。測(cè)序后，通過 與“假定的蛋白質(zhì)”序列比較確認(rèn)LnD9DS-2(SEQ ID N0:8)克隆。鑒定LnD9DS-2序列中的保守變化。通過在堿基位置271處用腺嘌呤替換胸苷將密碼子IGC (半胱氨酸)改變?yōu)锳GC(絲氨酸)，該密碼子翻譯成發(fā)表序列的氨基酸89。這是保守的變化，并且發(fā)現(xiàn)半胱氨酸不是多種絲狀真菌間高度保守的氨基酸，因此未嘗試改正。將分別為SEQ ID勵(lì):5和8的1^0905-1和1^0905-2基因克隆入酵母表達(dá)載體中。通過限制酶分析和DNA測(cè)序確認(rèn)含有LnD9DS-l和LnD9DS_2編碼序列之任一的克隆。使用來自Qbiogene的堿-陽離子酵母轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化delta-9去飽和酶缺陷型釀酒酵母菌株(0FY093)，其在具有Tween 80的Yro培養(yǎng)基上維持。根據(jù)在不含Tween 80 (單不飽和脂肪酸補(bǔ)充物)或尿嘧啶的培養(yǎng)基(DOBAsc-Ura)上生長鑒定互補(bǔ)菌株。將互補(bǔ)菌株在選擇培養(yǎng)基上單菌落純化三次。通過delta-9去飽和酶基因的PCR擴(kuò)增，及對(duì)PCR產(chǎn)物的測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)互補(bǔ)菌株。另外，如下將含有LnD9DS-2克隆的菌株恢復(fù)成脂肪酸和尿嘧啶依賴性，即將菌株在YPD+Tween 80k'培養(yǎng)基上傳代至少三次，然后將菌株補(bǔ)到不含Tween k 80的DOBA SC-URA培養(yǎng)基。通過FAME分析進(jìn)一步表征含有LnD9DS_l或LnD9DS_2編碼序列之任一的酵母菌株的底物特異性。HzDQDS基因的克隆和對(duì)Delta-9去飽和酶缺陷型釀酒酵母的轉(zhuǎn)化自DASPIC089(下文描述)在BamHI/XhoI片段上切出植物優(yōu)化的編碼美洲棉鈴蟲酸基 _CoA delta-9 去飽和酶(HzD9DS)(在 Rosenfield 等(2001) Insect Biochem. Mol.Biol. 31 (10) :949-64中鑒定為HzP⑶S2)的合成基因，并使用Montage旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行凝膠純化。將此片段連接入先前描述的酵母表達(dá)載體的相應(yīng)限制酶位點(diǎn)中，并使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和供應(yīng)商的方案(Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5 a中。在限制性 分析和DNA測(cè)序后，選擇含有HzD9DS基因的克隆來轉(zhuǎn)化入delta-9去飽和酶缺陷型釀酒酵母菌株0FY093中。使用來自Qbiogene的堿-陽離子酵母轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化0FY093菌株，其在具有Tween 80的YPD培養(yǎng)基上維持。根據(jù)在不含Tweenf 80 (脂肪酸補(bǔ)充物)和尿嘧啶的培養(yǎng)基(D0BASC-URA)上的生長鑒定互補(bǔ)菌株。將推定的互補(bǔ)菌株在選擇培養(yǎng)基上單菌落純化三次。如下進(jìn)一步確認(rèn)互補(bǔ)菌株i)使用Qbiogene酵母質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA，接著使用HzD9DS基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；ii)對(duì)HzD9DS基因特異性PCR產(chǎn)物測(cè)序；及iii)通過將菌株在YPD+Tween 8(f.培養(yǎng)基上傳代至少三次，然后將菌株補(bǔ)到不含Tweerv 80的DOBA SC-URA培養(yǎng)基將菌株恢復(fù)成脂肪酸和URA-3依賴性。通過FAME分析進(jìn)一步表征一種確認(rèn)的互補(bǔ)HzD9DS酵母菌株的底物特異性。分析OLEl缺陷型酵母菌株中表汰的LnD9DS-l, LnD9DS~2. MgD9DS和HzD9DS如上文所列的，自植物病原性真菌Magnaporthe grisea(MgD9DS)和穎枯小球腔菌(LnD9DS-l和LnD9DS-2)克隆三種例示性?；?CoA delta-9去飽和酶(D9DS)基因。三種基因及其編碼的蛋白質(zhì)先前尚未表征。酰基-CoA delta-9去飽和酶催化輔酶A的飽和14-、16-、和18-碳脂肪酰基硫酯的碳原子9和10間的順式雙鍵形成，導(dǎo)致分別生成肉豆蘧腦酸(14:1)、棕櫚油酸(16:1)、或油酸(18:1)。通過消除相同生物學(xué)背景中不同真菌酰基-CoAdelta-9去飽和酶基因來消除涉及生物體特異性生物學(xué)的效應(yīng)。因此，使用棕櫚?；?硬脂?；鵆oA去飽和酶(OLEl)缺陷型0FY093酵母菌株內(nèi)的內(nèi)源olel基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)真菌?；?CoA delta-9去飽和酶基因的表達(dá)。如此，對(duì)此系統(tǒng)中脂肪酸底物特異性觀察到的差異可歸因于互補(bǔ)釀酒酵母菌株中表達(dá)的特定真菌delta-9去飽和酶。將互補(bǔ)0YF093菌株中表達(dá)的MgD9DS、LnD9DS_l和LnD9DS_2CoA去飽和酶的底物特異性表征，并與W0/1999/050430中描述的與AnD9DS(sdeA)互補(bǔ)的0FY093比較。使用上文所描述的方案將含有AnD9DS基因(其表達(dá)由olel基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))的酵母表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入釀酒酵母0FY093菌株中并表達(dá)。

將互補(bǔ)釀酒酵母菌株在沒有脂肪酸補(bǔ)充的極限培養(yǎng)基中于30° C培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)清洗過的且凍干的細(xì)胞團(tuán)粒實(shí)施定量FAME分析。表I中顯示了此分析的結(jié)果。LnD9DS-2促進(jìn)C14:1和C16:1的形成，而LnD9DS-l和MgD9DS對(duì)C18:0具有偏愛，如根據(jù)酵母脂肪酸組成分析中C16:1/18:1脂肪酸的比率指示的。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其編碼包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列的酶 delta-9 去飽和酶SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ IDN0:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含與選自下組的序列至少60%相同的核苷酸序列SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID N0:44JPSEQ ID N0:45。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其進(jìn)一步包含基因調(diào)節(jié)元件。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，其中所述基因調(diào)節(jié)元件選自下組釀酒酵母delta-9去飽和酶啟動(dòng)子、delta-9去飽和酶3’ UTR/終止子、olel基因啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、菜豆 (Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白5’非翻譯區(qū)、菜豆菜豆蛋白3’非翻譯區(qū)、菜豆菜豆蛋白基質(zhì)附著區(qū)、根癌土壤桿菌0RF23 3’非翻譯區(qū)、木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子、根癌土壤桿菌 ORFl 3’非翻譯區(qū)、煙草(Nicotiana tabacum) RB7基質(zhì)附著區(qū)、Overdrive、T鏈邊界序列、 LfKCS3 啟動(dòng)子、FAEl 啟動(dòng)子、SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID N0:43、 Myc標(biāo)簽、和血凝素標(biāo)簽。
5.一種分離的酶delta-9去飽和酶，其包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
6.一種嵌合delta-9去飽和酶多肽，其包含SEQ ID NO:72和/或SEQ IDN0:73，其中所述多肽進(jìn)一步包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID N0:77和SEQ ID N0:78。
7.一種用于降低細(xì)胞中飽和脂肪酸量的方法，該方法包括用權(quán)利要求1的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得所述細(xì)胞中的飽和脂肪酸量降低。
8.依照權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
9.依照權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
10.依照權(quán)利要求9的方法，包括用權(quán)利要求1的超過一種核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞。
11.依照權(quán)利要求9的方法，其中轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞將用于降低所述植物細(xì)胞中 16:0-ACP水平的手段導(dǎo)入所述植物細(xì)胞中。
12.依照權(quán)利要求11的方法，其中所述用于降低植物細(xì)胞中16:0-ACP水平的手段 (mean)是質(zhì)體外去飽和酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述質(zhì)體外去飽和酶是選自下組的去飽和酶LnD9DS去飽和酶、AnD9DS去飽和酶、HzD9DS去飽和酶、和MgD9DS去飽和酶。
14.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述植物細(xì)胞選自自下組選擇的屬擬南芥屬(Arabidopsis)、琉璃苣屬(Borago)、蕓苔(Canola)、蓖麻屬(Ricinus)、可可樹屬 (Theobroma)、玉蜀黍?qū)?Zea)、棉屬(Gossypium)、兩節(jié)莽屬(Crambe)、萼距花屬(Cuphea)、 亞麻屬(Linum)、小濱菊屬(Lesquerella)、鯨油草(Limnanthes)、Linola、旱金蓮屬 (Tropaeolum)、月見草屬(Oenothera)、木樨欖屬(Olea)、油棕屬(Elaeis)、落花生屬 (Arachis)、油菜籽(rapeseed)、紅花屬(Carthamus)、大豆屬(Glycine)、野生大豆(Soja)、 向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nicotiana)、斑鳩菊屬(Vernonia)、小麥屬(Triticum)、大麥屬(Hordeum)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(Avena)、高粱屬(Sorghum)、黑麥屬(Secale)JP 禾本科(Gramineae)的其它成員。
15.—種含油種子植物，其包含權(quán)利要求1的核酸序列。
16.一種植物種子，其表達(dá)選自下組的質(zhì)體外去飽和酶SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51JPSEQ IDNO: 52
17.—種轉(zhuǎn)基因油菜(Brassica napus)系的種子，所述種子相對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因油菜系的等基因型式具有降低的16:0水平。
18.一種用于創(chuàng)建遺傳工程化植物的方法，所述遺傳工程化植物與野生型植物相比在所述植物中包含降低的飽和脂肪酸量，所述方法包括用權(quán)利要求1的核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料；并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物材料以獲得植物。
19.依照權(quán)利要求18的方法，其中所述植物選自自下組選擇的屬擬南芥屬 (Arabidopsis)、琉璃苣屬(Borago)、蕓苔(Canola)、蓖麻屬(Ricinus)、可可樹屬 (Theobroma)、玉蜀黍?qū)?Zea)、棉屬(Gossypium)、兩節(jié)莽屬(Crambe)、萼距花屬(Cuphea)、 亞麻屬(Linum)、小濱菊屬(Lesquerella)、鯨油草屬(Limnanthes)、Linola、旱金蓮屬 (Tropaeolum)、月見草屬(Oenothera)、木樨欖屬(Olea)、油棕屬(Elaeis)、落花生屬 (Arachis)、油菜籽(rapeseed)、紅花屬(Carthamus)、大豆屬(Glycine)、野生大豆(Soja)、 向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nicotiana)、斑鳩菊屬(Vernonia)、小麥屬(Triticum)、 大麥屬(Hordeum)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(Avena)、高粱屬(Sorghum)、黑麥屬(Secale)JP 禾本科(Gramineae)的其它成員。
20.通過權(quán)利要求18的方法獲得的植物。
21.自權(quán)利要求20的植物獲得的植物材料。
22.權(quán)利要求21的植物材料，其中所述植物材料是種子。
全文摘要
組合物和方法包括在植物細(xì)胞中遺傳編碼和表達(dá)新穎的delta-9去飽和酶。在一些實(shí)施方案中，在植物細(xì)胞中表達(dá)核酸以利用delta-9去飽和酶酶活性，使得植物種子中飽和脂肪酸的百分比組成降低，而且有伴隨的ω-7脂肪酸增加的方法。在其它實(shí)施方案中，氨基酸序列具有delta-9去飽和酶活性。為了增加全植物、植物種子、和植物材料，例如種子中不常見脂肪酸的量,方法可以牽涉在植物細(xì)胞、植物材料、和全植物中表達(dá)delta-9去飽和酶。
文檔編號(hào)A01H5/10GK103068986SQ201180040626
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者A.O.默洛, D.J.加科特, M.A.湯普森, T.A.沃爾什, S.貝文 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司