專利名稱：自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型及其制備方法。
背景技術(shù)：
諸多流行病學(xué)和臨床觀察研究結(jié)果表明，高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia, HHcy)增加心腦血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，血漿Hcy 每升高3umol/L，缺血性心臟病發(fā)生率增加11%，卒中發(fā)生率增加19%。Hhcy是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素之一，其誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)進(jìn)程一旦啟動(dòng)，最終會(huì)導(dǎo)致不可逆的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。
雖然一些循證醫(yī)學(xué)證據(jù)(2005年公布的NORVIT試驗(yàn)和2006年報(bào)道的H0PE2試驗(yàn)) 表明葉酸聯(lián)合B族維生素降低血Hcy水平對(duì)業(yè)已形成動(dòng)脈粥樣硬化患者一級(jí)終點(diǎn)的改善并無明顯作用，但是降低血Hcy水平，有可能改善僅有高同型半胱氨酸危險(xiǎn)因素(尚未形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊)所致的血管內(nèi)皮功能損傷，從而阻遏動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和/或發(fā)展。 Hhcy對(duì)心腦血管系統(tǒng)造成的損害仍不容小覷。到目前為止，Hhcy導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制仍未完全闡明。
最近國內(nèi)外研究表明，Hcy可能通過促進(jìn)氧化應(yīng)激，介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)，促平滑肌細(xì)胞增殖，影響血管內(nèi)皮功能，激活血小板凝血系統(tǒng)，影響脂代謝等機(jī)制參與AS的發(fā)生發(fā)展。深入研究同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣化損傷的作用機(jī)制以及采取有效的干預(yù)措施，迫切需要一種能最真實(shí)地反映人類動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展過程且重復(fù)性好的動(dòng)物模型。目前國際上普遍采用的建立HHcy動(dòng)物模型的方法主要有1、飲食中添加高蛋氨酸/同型半胱氨酸或葉酸、維生素B12缺失誘導(dǎo)HHcy形成；2、采用基因缺陷小鼠常用于敲除的基因有核心家庭胱硫瞇β-合酶(CBQ、甲烯四氫葉酸還原酶(MTHFR)、載脂蛋白E (ApoE)0采用飲食誘導(dǎo)的方法成本較低，但是個(gè)體差異較大，重復(fù)性差，可控性低；而將同型半胱氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶作用缺失后形成的HHcy模型因其性狀穩(wěn)定，重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用。純合CBS基因缺陷小鼠的血漿Hcy水平可以達(dá)到正常水平的40倍以上，伴有嚴(yán)重的生長發(fā)育遲滯，肝脂肪變性，晶狀體錯(cuò)位。雜和CBS基因缺陷小鼠血漿Hcy升高在2倍以上，且不伴有各種生長缺陷，因此成為研究輕度HHcy的理想模型。但是，多項(xiàng)研究表明，雖然出現(xiàn)了內(nèi)皮損傷，在CBS基因缺陷小鼠模型上并未觀察到動(dòng)脈粥樣硬化病理損害發(fā)生。MTHFR基因缺陷小鼠的表現(xiàn)型與CBS基因缺陷小鼠相似，但發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的傾向更大。純合和雜和的MTHFR基因缺陷HHcy小鼠經(jīng)飲食誘導(dǎo)后都可以觀察到類似動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積，而小鼠的血脂水平都在正常范圍，因此，MTHFR基因缺陷小鼠似乎可以成為單純輕度Hcy增高致動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型。
研究發(fā)現(xiàn)，給予高蛋氨酸或同型半胱氨酸飲食后，apoE基因缺陷小鼠可以形成大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。且飲食誘導(dǎo)對(duì)斑塊大小和數(shù)量的影響在前三個(gè)月即可出現(xiàn)，因此apoE基因缺陷小鼠可以用來研究HHcy在動(dòng)脈粥樣硬化硬化早期階段的影響。 目前也已有研究成功構(gòu)建了 apoE基因缺陷小鼠HHcy動(dòng)脈粥樣硬化模型，并指出高蛋氨酸誘導(dǎo)兩月后已有動(dòng)脈粥樣硬化病理改變，并發(fā)現(xiàn)其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是不穩(wěn)定的。
綜上所述，三種基因缺陷小鼠模型均各有利弊。雖然MTHFR基因缺陷或者apoE基因缺陷HHcy小鼠可以觀察到類似動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積，但也必須經(jīng)過飲食誘導(dǎo)。飲食誘導(dǎo)無非是在飲水或食物中添加蛋氨酸/同型半胱氨酸，或者使葉酸或維生素B12缺乏。這種方法可控性差，個(gè)體差異較大。一定濃度的蛋氨酸灌胃可以控制小鼠攝入的蛋氨酸劑量，但對(duì)小鼠的刺激較大，非藥物因素致死率增加。因此建立一種重復(fù)性高、可控性好的HHcy動(dòng)脈粥樣硬化模型勢(shì)在必行。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的制備方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種利用上述制備方法制備獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的制備方法，包括以下步驟(1)選取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES細(xì)胞SCR012作為基因打靶所用細(xì)胞，并構(gòu)建 Mthfr打靶載體；(2)利用電穿孔法進(jìn)行基因打靶，篩選陽性ES克??；(3)利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠與CBA雌性小鼠的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)；(5)將嵌合率大于50%的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行交配，后代小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，獲得Mthfr基因剔除雜合小鼠。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明提供一種利用上述制備方法獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，所述轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型為apoE和Mthfr雙重基因缺陷的HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，apoE和MTHFR雙重基因缺陷的HHcy動(dòng)脈粥樣硬化模型更好地結(jié)合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā)形成HHcy血癥并發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致動(dòng)脈粥樣硬化因素的作用。該動(dòng)物模型重復(fù)性高、可控性好，易于飼養(yǎng)繁殖，彌補(bǔ)了現(xiàn)有動(dòng)物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點(diǎn)， 為HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制研究及干預(yù)措施的探索提供了更好的平臺(tái)。利用這個(gè)平臺(tái)，對(duì)于HHcy動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性以及藥物治療的研究將進(jìn)一步深入且更加科學(xué)。


圖1為打靶質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2為質(zhì)粒酶切鑒定圖，打靶載體用EcoRI、HindIII酶切，目的條帶分別為 EcoRI :173bp、5641bp、7407bp ；HindIII :5999bp、7222bp。
圖3為ES克隆鑒定結(jié)果PCR電泳圖，Marker: Ikb ladder ;PCR陽性條帶4071bp。
圖4為ES克隆鑒定結(jié)果PCR電泳圖，Marker: Ikb ladder ;PCR陽性條帶2779bp。
圖5為小鼠尾巴DNA PCR 5’ arm鑒定圖。
圖6為小鼠尾巴DNA PCR 3’ arm鑒定圖。
圖7為apoE和MTHFR雙重基因缺陷小鼠及對(duì)照組小鼠。
圖8為各組小鼠血漿Hcy濃度，與ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠Hcy水平顯著增高，呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。
圖9為各組小鼠血漿TC、TG水平，其TC、TG水平較野生型和MTHFR (+\_)小鼠有顯著升高，但與ApoE(_\_)小鼠相比無明顯差異。
圖10為各組小鼠主動(dòng)脈根部形態(tài)學(xué)改變(X 200)，其中圖10AU0B為4月齡野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠，其主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜呈波浪狀；圖IOC為MTHFR(+\_)小鼠，其主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，欠光滑，但未見斑塊生成；圖IOD為ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠， 其主動(dòng)脈根部出現(xiàn)斑塊，體積較大，表面覆蓋一層薄的纖維帽，并有大量炎性細(xì)胞浸潤，斑塊中膠原比例明顯增高，且有斑塊內(nèi)埋藏纖維帽和斑塊內(nèi)出血。
圖11為各組小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP mRNA表達(dá)，RT-PCR結(jié)果表明，與ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主動(dòng)脈根部 BiP 和 CHOP 的 mRNA 表達(dá)水平顯著增高，半定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。
圖12為各組小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP蛋白水平的表達(dá)，Western-blot的結(jié)果表明，與 ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠主動(dòng)脈根部 BiP 和CHOP的蛋白表達(dá)水平顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明提供的自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的制備方法的具體實(shí)施方式
，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、制備自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型 1.選取基因打靶所用細(xì)胞U9/S6/SvEv品系雄性小鼠ES細(xì)胞SCR012。
2.構(gòu)建Mthfr打靶載體質(zhì)粒(見圖1)，質(zhì)粒酶切鑒定(見圖2)。
3.將打靶載體線性化將80ug Mthfr KO Vector質(zhì)粒DNA用NotI(酶用量100U) 酶切線形化，酶切體積200ul、37°C消化過夜；走膠分離純化，(膠回收試劑盒用QIAquick Gel Extraction Kit (Cat No. 28706))；隨后乙醇沉淀，IOOul 無菌的 PBS 重懸。
4. ES細(xì)胞打靶及篩選E S細(xì)胞SCR012 ；DNA量35 μ g ；電轉(zhuǎn)儀型號(hào)Bio — Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105)；電穿孔條件電壓240 ν，電容500 μ F;實(shí)際通電時(shí)間 10. 5ms，實(shí)際電壓256 ν ；克隆篩選條件300 μ g/ml G418、2uM GanC篩選8天；挑取抗性克隆共96個(gè)，提供DNA樣本96份。
5. ES細(xì)胞基因組鑒定 1)鑒定策略(圖1)5，PCR鑒定鑒定引物5L&ne0R，目的片段為4071bp，退火溫度65°C ； PCR 引物序列Neo-R: CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA ；5L: GTGGCCCCACACTCTTCAAAGTTT。
3，PCR鑒定鑒定引物3R&neoF,目的片段為2779bp,退火溫度:65°C ； PCR 引物序列Neo-F: CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC ；3R: CATGAAGGCCAGGCCAGGGTATTGG。
2) ES克隆鑒定結(jié)果共鑒定藥物抗性克隆96個(gè)，其中雙臂均發(fā)生正確同源克隆數(shù)12個(gè)，陽性率為12. 5%。 PCR電泳圖見圖3、圖4。
6.利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入小鼠的囊胚。顯微注射用囊胚來源于 C57BL/6J小鼠超數(shù)排卵，自然受孕，體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段。
利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J( $ )與CBA(早)的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)。將嵌合率大于50 %的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行鑒定(鑒定策略同上)，獲得本發(fā)明所述小鼠7只。
小鼠尾巴DNA PCR鑒定見圖5、圖6。
鑒定的引物和條件重組-Pl :GGGGAACTTCCTGACTAGGG ； 公共-P2:ATAACACGTTCCAGGCGAAG ； 野生-P3 CCCAGGGATGGATAACAGTG ；條帶大小homo:560bp heter 560+354bp wt 354bp tm: 60 度 30s，30cycles。
實(shí)施例2、驗(yàn)證ApoE/MTHFR雙重基因缺陷小鼠是否會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化(1)檢測(cè)模型Hcy和血脂譜的測(cè)定如圖 8 所示，與 ApoE(-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠 Hcy 水平顯著增高，呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05);如圖9所示，其TC、TG水平較野生型和MTHFR(+\_) 小鼠有顯著升高，但與ApoE (-\-)小鼠相比無明顯差異。
(2)各組主動(dòng)脈根部病理形態(tài)學(xué)改變?nèi)鐖D10所示，主動(dòng)脈根部切片經(jīng)H&E染色后發(fā)現(xiàn)，4月齡野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜呈波浪狀(圖10A，10B) ;MTHFR(+\_)小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，欠光滑，但未見斑塊生成(圖10C);ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主動(dòng)脈根部出現(xiàn)斑塊， 體積較大，表面覆蓋一層薄的纖維帽，并有大量炎性細(xì)胞浸潤，斑塊中膠原比例明顯增高， 且有斑塊內(nèi)埋藏纖維帽和斑塊內(nèi)出血(圖10D)。
(3)各組小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP mRNA表達(dá)如圖 11 所示，RT-PCR 結(jié)果表明與 ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR (+\-)小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP的mRNA表達(dá)水平顯著增高，半定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ<0· 05)。
(4)各組小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP蛋白質(zhì)水平的表達(dá)如圖12所示，Western-blot的結(jié)果表明與ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (-\") *MTHFR(+\_)小鼠主動(dòng)脈根部BiP和CHOP的蛋白表達(dá)水平顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。
綜上，根據(jù)本發(fā)明提供的制備方法獲得的apoE和MTHFR雙重基因缺陷小鼠模型，由兩種基因缺失效應(yīng)疊加，更好地結(jié)合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā) HHcy并發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致動(dòng)脈粥樣硬化因素的作用，彌補(bǔ)了先前各種動(dòng)物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點(diǎn)，為HHcy對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及干預(yù)措施的研究提供了更好的動(dòng)物模型。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種自發(fā)性HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的制備方法，包括以下步驟(1)選取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES細(xì)胞SCR012作為基因打靶所用細(xì)胞，并構(gòu)建 Mthfr打靶載體；(2)利用電穿孔法進(jìn)行基因打靶，篩選陽性ES克隆；(3)利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠與CBA雌性小鼠的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)；(5)將嵌合率大于50%的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行交配，后代小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，獲得Mthfr基因剔除雜合小鼠。
2.利用權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型為apoE和Mthfr雙重基因缺陷的HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種apoE和Mthfr雙重基因缺陷的高同型半胱氨酸血癥相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型及其制備方法，該動(dòng)物模型更好地結(jié)合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā)形成HHcy血癥并發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除HHcy以外其他致動(dòng)脈粥樣硬化因素的作用。該動(dòng)物模型重復(fù)性高、可控性好，易于飼養(yǎng)繁殖，彌補(bǔ)了現(xiàn)有動(dòng)物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點(diǎn)，為HHcy相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制研究及干預(yù)措施的探索提供了更好的平臺(tái)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102517333SQ20111043769
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者陸國平, 陳楨玥 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院