專利名稱：尖鐮孢番茄頸腐根腐?；图捌湓谂嘤杨i腐根腐病抗病品種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尖鐮孢番茄頸腐根腐專化型及其在培育番茄頸腐根腐病抗病品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄頸腐根腐病最早發(fā)現(xiàn)于日本，之后在很多國家發(fā)生并成為影響溫室番茄生產(chǎn)的重要病害。番茄頸腐根腐病的主要癥狀表現(xiàn)為番茄莖基部和根部褐變腐爛，發(fā)病植株在土壤與植株莖基部交接處(環(huán)繞莖基部)有明顯的深褐色病斑；早期侵染的植株，在3-5片葉的幼苗期從發(fā)病部位折倒而萎蔫死亡；晚期侵染的植株，在5葉期以后至開花結(jié)果期發(fā)病，表現(xiàn)為莖基部縊縮、呈深褐色、植株仍然直立而萎蔫致死，發(fā)病嚴(yán)重時病死率高達(dá)100%。番茄頸腐根腐病除了侵染番茄，還能侵染豆科植物、葫蘆科植物和藜科植物。我國是番茄生產(chǎn)和出口大國，近年來番茄設(shè)施栽培的面積逐年加大且往往連作種植。番茄頸腐根腐病是一種土傳病害，能在溫室區(qū)迅速蔓延，在連作栽培區(qū)造成的損失逐年加大甚至造成絕產(chǎn)。因此，生產(chǎn)上迫切需要抗番茄頸腐根腐病的優(yōu)良植物品種。我國發(fā)生番茄頸腐根腐病始于2007年，近幾年來有蔓延和加重的趨勢，選育抗病品種作為最有效的防治方法已經(jīng)引起我國番茄育種家的高度重視。成功分離、純化和鑒定我國番茄頸腐根腐病病原，并了解該病原菌的生長條件是進行抗病育種的必要條件，但我國關(guān)于番茄頸腐根腐病的研究尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供尖鐮孢番茄頸腐根腐專化型及其在培育番茄頸腐根腐病抗病品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為尖鐮孢番茄頸腐根腐?；?Fusarium oxysporum f. sp.radicis-lycopersici)Forl-c,已于2011年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5517。尖鐮孢番茄頸腐根腐?；?Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici)Forl-c CGMCCNo. 5517 簡禾爾菌株Forl-C0本發(fā)明還保護菌株在如下(a)或(b)中的應(yīng)用(a)篩選抗番茄頸腐根腐病植物(種質(zhì)資源)；(b)篩選具有抑制番茄頸腐根腐病作用的產(chǎn)品。所述植物為番茄果砧1號。本發(fā)明還保護菌株在培育頸腐根腐病發(fā)病植物中的應(yīng)用。所述植物為番茄(如番茄自交系Q-167)、黃瓜(如黃瓜品種102)、甜菜(如甜菜品種紫葉甜菜)或菜豆。本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)菌株的方法，是在如下條件下進行所述培養(yǎng)溫度為20-30°C，pH值為4-10。所述溫度具體可為25°C。所述pH值可為6_9，具體可為8。
本發(fā)明還保護一種促進菌株R)rl-c的分生孢子萌發(fā)的方法，是在如下條件下培養(yǎng)所述分生孢子溫度為15-30°C，相對濕度為90-100%。所述溫度具體可為25°C。所述相對濕度具體可為100%。本發(fā)明還保護一種培育菌株R)rl-c的培養(yǎng)基，是將查彼克培養(yǎng)基中的氮源替換為等質(zhì)量的其它氮源得到的培養(yǎng)基。所述查彼克培養(yǎng)基中的氮源為硝酸鈉。所述其它氮源為有機氮和/或硝態(tài)氮，具體可為硝酸鉀、蛋白胨和甘氨酸中的至少一種。所述查彼克培養(yǎng)基具體可由如下物質(zhì)組成:2. OOg NaNO3U. OOg K2HP04、0. 50g KCl、0· 5gMgS04 · 7Η20、0· OlgFeSO4,30. OOg 蔗糖、1000ml 蒸餾水和 17. OOg 瓊脂。本發(fā)明還保護一種抑制菌株R)rl-c的菌絲生長的方法，是將菌株R)rl-c置于630C以上的溫度下，從而抑制所述菌絲生長。所述方法具體可將菌株i^or 1-c在63°C以上的溫度下放置10分鐘以上。本發(fā)明還保護一種殺死菌株R)rl-c的分生孢子的方法，是將所述分生孢子置于ere以上的溫度下，從而殺死所述分生孢子。所述方法具體可將所述分生孢子在ei°c以上的溫度下放置 ο分鐘以上。本發(fā)明還保護一種篩選抑制頸腐根腐病的產(chǎn)品的方法，包括如下步驟(1)將菌株接種植物，得到頸腐根腐病發(fā)病植物；(2)用所述頸腐根腐病發(fā)病植物篩選抑制頸腐根腐病的產(chǎn)品。所述植物為番茄(如番茄自交系Q-167)、黃瓜(如黃瓜品種102)、甜菜(如甜菜品種紫葉甜菜)或菜豆。本發(fā)明提供了一株菌，為尖鐮孢番茄頸腐根腐?；?。本發(fā)明提供的菌株可以引發(fā)多種植物的頸腐根腐病。本發(fā)明還對該菌株的生長最適溫度、生長最適PH、生長最適氮源、菌絲致死溫度、分生孢子萌發(fā)的最適溫度、分生孢子萌發(fā)的最適濕度和分生孢子的致死溫度等的條件進行了研究。本發(fā)明有助于我國番茄頸腐根腐病研究工作者對番茄頸腐根腐病的致病機理的解析、有助于番茄頸腐根腐病生防制劑的研發(fā)、有助于番茄頸腐根腐病抗性遺傳及相關(guān)基因分子標(biāo)記的研究，有助于番茄頸腐根腐病抗病基因的挖掘，有助于番茄頸腐根腐病抗病植物材料的鑒定和篩選等工作，為番茄頸腐根腐病的綜合防治打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明對于有效控制番茄頸腐根腐病的危害具有重大價值，將促進我國番茄頸腐根腐病抗病育種的發(fā)展。


圖1為菌株R)rl-c的形態(tài)鑒定圖。圖2為氮源對菌株R)rl-c的菌落生長的影響。圖3為溫度對菌株R)rl-c的分生孢子萌發(fā)的影響。圖4為番茄果砧1號和Q-167浸根接種菌株R)rl_C四周后的的照片。圖5為各種待測產(chǎn)品對菌株R)rl-c的分生孢子萌發(fā)的影響。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、菌株的獲得和鑒定一、菌株的獲得2008年8月于國家蔬菜工程技術(shù)研究中心農(nóng)場大棚內(nèi)采集典型發(fā)病植株，按常規(guī)方法用PDA平板25°C條件下進行病原分離培養(yǎng)，挑單孢純化。分離到一株病原菌，將其命名為菌株Forl-c。二、菌株的鑒定1、形態(tài)鑒定將菌株R)rl-c接種到PDA平板上，25°C黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。在CLA培養(yǎng)基水瓊脂，20g瓊脂，IL水，康乃馨葉片塊)上培養(yǎng)，觀察大型分生孢子、小型分生孢子和
厚垣孢子，并在100倍倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式。形態(tài)鑒定圖見圖1，A為菌落形態(tài)，B為大型分生孢子(橫線代表25um)，C為小型分生孢子(橫線代表25um)，D為CLA培養(yǎng)基上原位的小型孢子(橫線代表50um)。菌株Forl-c在PDA培養(yǎng)基上呈淡紫灰色，菌落圓形，菌絲絨毛狀，25°C條件下在PDA上黑暗培養(yǎng)5d菌落直徑60mm左右。大型分生孢子鐮刀型，以3個隔膜為主。小型分生孢子長橢圓形，通常無隔。分生孢子梗短、生于菌絲側(cè)面，單生，無分枝。厚垣孢子頂生或間生，圓形，多為單獨生長，偶爾也對生或串生。依據(jù)《The FusariumLaboratory Manual》(Leslie，J. F. & Summerel 1，B. A. The Fusarium LaboratoryManual. 2006)，鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。2、rDNA_ITS 鑒定將菌株R)rl-c接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在25°C、125rpm振蕩培養(yǎng)3 4d，過濾收集菌絲體用于DNA提取。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITSl (5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘)和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘)對菌株Forl-c的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。擴增條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最終72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析。電泳檢測結(jié)果顯示，PCR擴增得到大小約500bp的片段，經(jīng)測序分析菌株Forl-c的ITS序列片段全長50!3bp。BLAST比對分析表明該序列與GenBank中EU839387等尖孢鐮刀菌的序列同源性達(dá)到99%，這一分析結(jié)果表明該菌株屬于尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。綜合形態(tài)鑒定和rDNA-ITS鑒定結(jié)果，確認(rèn)菌株R)rl_C為尖鐮孢番茄頸腐根腐?；?。尖鐮孢番頸腐根腐專化型(Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici)已于2011年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
(簡稱06110，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.5517。尖鐮孢番茄頸腐根腐?；?Fusariumoxysporumf. sp. radicis-lycopersici)Forl-c CGMCC No. 5517 簡禾爾菌株 Forl-c。實施例2、菌株R)rl-c的致病性測定番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)自交系Q-167 國家蔬菜工程技術(shù)研究中心)。1、將菌株R)rl-c在PDA平板(pH6.幻培養(yǎng)7天后，用蒸餾水配成濃度為IO7個/mL的孢子懸浮液。2、將番茄自交系Q-167的種子用52°C溫水浸種30分鐘，再用清水沖洗。3、用浸根法進行接種將步驟2的種子催芽后播種在盛有滅菌蛭石的營養(yǎng)缽內(nèi)，幼苗1片真葉時輕輕拔起，用水將根系沖干凈，放入步驟1得到的孢子懸浮液(設(shè)置蒸餾水對照)中浸根10分鐘，然后移栽入盛有滅菌蛭石和草炭(1質(zhì)量份蛭石+兩質(zhì)量份草炭)的苗缽內(nèi)。將將植株隨機分為兩組，分別置于18°c和27°C條件下培養(yǎng)。進行浸根處理1個月后調(diào)查兩組植株的發(fā)病率。采用蒸餾水浸根的植株均未發(fā)生番茄頸腐根腐病。采用孢子懸浮液浸根的植株在18°C培養(yǎng)條件下番茄頸腐根腐病的發(fā)病率為100%，在27°C培養(yǎng)條件下番茄頸腐根腐病的發(fā)病率為70%。植株發(fā)病后從發(fā)病部位的病健交接處分離純化病原菌觀察形態(tài)，與實施例1的步驟二的1中的形態(tài)描述一致。實施例3、菌株R)rl-c的致病范圍測定供試植物如下番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)自交系Q-167 國家蔬菜工程技術(shù)研究中心)；黃瓜(Citrullus sativus L.)品種102 北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心；甜菜(Beta vulgaris L.)品種紫葉甜菜北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心；菜豆(Phaseolus vulgaris L.)北京聚宏種苗技術(shù)有限責(zé)任公司。分別將各個供試植物進行以下實驗1、將菌株R)rl-c在PDA平板(pH6.幻培養(yǎng)7天后，用蒸餾水配成濃度為IO7個/mL的孢子懸浮液。2、將供試植物的種子用52°C溫水浸種30分鐘，再用清水沖洗。3、用浸根法進行接種方法同實施例2的步驟3，在18°C條件下培養(yǎng)植株。進行浸根處理4周后調(diào)查發(fā)病情況。采用蒸餾水浸根的植株均未發(fā)生番茄頸腐根腐病。采用孢子懸浮液浸根的番茄、黃瓜、甜菜和菜豆番茄頸腐根腐病發(fā)病率均為100%。結(jié)果表明，菌株不僅能使番茄致病，還能使黃瓜、菜豆和甜菜致病。實施例4、菌株R)rl-c生長條件的研究一、溫度對菌株R)rl-c的菌落生長的影響從長有菌株R)rl-c的PDA平板上用5mm打孔器打取菌餅(從病原菌菌落邊緣打取)，將其置于新的PDA平板(pH6. 5)中央，分別在不同溫度(5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C或40°C )下黑暗培養(yǎng)，每個培養(yǎng)溫度設(shè)置4個重復(fù)，5天后用十字交叉法測量菌落直徑。結(jié)果見表1。菌株R)rl-c在5°C時幾乎無生長，在10 25°C范圍內(nèi)，隨著溫度的升高生長量增加，25°C時生長量最大，之后隨著溫度的升高生長量下降，40°C時沒有生長(表1)。菌株R)rl-C生長適宜的溫度范圍為20 30°C，最適溫度為25°C。表1采用不同溫度培養(yǎng)后的菌落直徑
權(quán)利要求
1.尖鐮孢番頸腐根腐?；?Fusariumoxysporum f. sp. radicis-lycopersici)Forl-c，它的保藏編號為CGMCC No. 5517。
2.權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚏)rl-C在如下(a)或(b)中的應(yīng)用(a)篩選抗番茄頸腐根腐病植物；(b)篩選具有抑制番茄頸腐根腐病作用的產(chǎn)品。
3.權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚏)rl-c在培育頸腐根腐病發(fā)病植物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為番茄、黃瓜、甜菜或菜豆。
5.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^rl-c的方法，是在如下條件下進行所述培養(yǎng)溫度為20-30°C，pH值為4-10。
6.一種促進權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^orl-c的分生孢子萌發(fā)的方法，是在如下條件下培養(yǎng)所述分生孢子溫度為15-30°C，相對濕度為90-100%。
7.一種培育權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^rl-c的培養(yǎng)基，是將查彼克培養(yǎng)基中的氮源替換為等質(zhì)量的其它氮源得到的培養(yǎng)基。
8.一種抑制權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^orl-c的菌絲生長的方法，是將所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^orl-c置于63°C以上的溫度下，從而抑制所述菌絲生長。
9.一種殺死權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐專化型i^orl-c的分生孢子的方法，是將所述分生孢子置于61°C以上的溫度下，從而殺死所述分生孢子。
10.一種篩選抑制頸腐根腐病的產(chǎn)品的方法，包括如下步驟(1)將權(quán)利要求1所述尖鐮孢番茄頸腐根腐?；蚷^orl-c接種植物，得到頸腐根腐病發(fā)病植物；(2)用所述頸腐根腐病發(fā)病植物篩選抑制頸腐根腐病的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了尖鐮孢番茄頸腐根腐?；图捌湓谂嘤杨i腐根腐病抗病品種中的應(yīng)用。本發(fā)明菌株(簡稱菌株Forl-c)的保藏號為CGMCC No.5517。本發(fā)明有助于我國番茄頸腐根腐病研究工作者對番茄頸腐根腐病的致病機理的解析、有助于番茄頸腐根腐病生防制劑的研發(fā)、有助于番茄頸腐根腐病抗性遺傳及相關(guān)基因分子標(biāo)記的研究，有助于番茄頸腐根腐病抗病基因的挖掘，有助于番茄頸腐根腐病抗病植物材料篩選和鑒定等工作，為番茄頸腐根腐病的綜合防治打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明對于有效控制番茄頸腐根腐病的危害具有重大價值，將促進我國番茄頸腐根腐病抗病育種的發(fā)展。
文檔編號A01P3/00GK102559512SQ20111042336
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者李常保, 柴敏, 王麗君, 耿麗華, 遲勝起 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院