專利名稱：一種梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種梅花愈傷組織高效誘導(dǎo)的方法。
背景技術(shù)：
梅花(Primus mume Sieb. Et Zucc.)是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，品種繁多，種質(zhì)資源豐富。它原產(chǎn)于我國(guó)西南地區(qū)及長(zhǎng)江流域、珠江流域，以川、滇、藏為中心，在我國(guó)有7000年以上的應(yīng)用史和3000年以上的栽培史。引種栽培過程中，培育出了眾多優(yōu)良的園藝新品種， 極大地豐富了我國(guó)的園林景觀。梅花從受粉到果實(shí)成熟僅要兩三個(gè)月左右的時(shí)間，果實(shí)發(fā)育時(shí)間短，其果實(shí)達(dá)到成熟時(shí)，胚尚未成熟。種子經(jīng)過砂藏處理，在正常條件下播種萌發(fā)率也很低。胚培養(yǎng)技術(shù)可以挽救胚敗育和發(fā)育不良，縮短休眠期，無需沙藏，極大地提高胚的萌發(fā)率及成苗率。潘曉等對(duì)‘淡豐后’杏梅品種的胚培養(yǎng)做了初步研究，顯著提高了種子的成苗率，但觀賞價(jià)值高的真梅品種在該研究中未有涉及。愈傷組織一方面可研究植物生長(zhǎng)發(fā)育及分化的機(jī)制、遺傳變異規(guī)律，對(duì)植物遺傳育種具有特殊意義；另一方面可用于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)有用化合物，或用于細(xì)胞培養(yǎng)篩選工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥生產(chǎn)上有用的無性系，或用于原生質(zhì)體培養(yǎng)中的原生質(zhì)體來源等。實(shí)踐證明，愈傷組織培養(yǎng)不僅是一種植物快繁的新手段，同時(shí)也是植物改良，種質(zhì)保存和有用化合物生產(chǎn)的理想途徑。而木本植物外植體污染率比較高，并且木本植物愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的困難。梅花組織培養(yǎng)研究中，通過葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)少見報(bào)道，高效的愈傷組織誘導(dǎo)體系更是少人問津。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種梅花葉片愈傷組織誘導(dǎo)方法，其為以真梅系梅花品種胚培養(yǎng)獲得的實(shí)生苗的幼嫩葉片為外植體，近軸面朝上接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2周以上，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D0. 25 2. 00mg/L, pH = 5. 8 6.0的固體培養(yǎng)基，更優(yōu)選為MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D0. 5 1. 5mg/L，pH = 5. 8 6. 0 的固體培養(yǎng)基，更優(yōu)選為 MS+ 蔗糖 20 40g/L+2，4-D1. 0mg/L，pH =5. 8 6.0的固體培養(yǎng)基。其中，幼嫩葉片在接種前，去掉葉柄，用刀片沿主脈劃2 3刀，保證葉緣處相連目的在于使葉片產(chǎn)生更多的傷口，促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)。其中，所述幼嫩葉片優(yōu)選為實(shí)生苗長(zhǎng)至6 8片葉片時(shí)，從上往下數(shù)第3 4片葉片。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胚培養(yǎng)包括如下步驟1)取開花后50 70天未成熟的梅花果實(shí)，用0. 5 1. 5%的高錳酸鉀溶液清洗外果皮并浸泡1 池，之后流水沖洗1 ai ；
2)砸碎果實(shí)，取出種子，并用流水清洗去掉種皮；3)將步驟2)去掉種皮的種子用70%的乙醇浸泡20 40s，升汞浸泡8 15min，無菌水沖洗至少3次后備用；4)將步驟3)表面滅菌后的種子保留部分子葉，接種于MS+0. 5 1. 5mg/ L6-BA+0. 1 0. 3mg/L IBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固體實(shí)生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1 3周后，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000 3000Lx，光照時(shí)間為14h/d。其中，優(yōu)選的梅花果實(shí)為開花后60天未成熟的果實(shí)。其中，優(yōu)選的固體實(shí)生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LIBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明中建立了梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系，該體系的建立，能夠高效的誘導(dǎo)愈傷組織，使葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)90%以上。此外，本發(fā)明建立了梅花胚培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)無菌苗長(zhǎng)期保存。用無菌實(shí)生苗的幼嫩葉片為外植體，解決了愈傷組織外植體來源的問題。


圖1所示為梅花胚培養(yǎng)無菌苗植株。圖2所示為梅花葉片愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1梅花外植體的采集及消毒春季采集真梅系梅花品種‘淡寒紅’果實(shí)，清水洗凈。配制的高錳酸鉀溶液置于2L的大燒杯中，浸泡清洗外果皮lh，流水沖洗Ih直至水澄清為止。用石制研缽輕砸，去掉果肉，輕砸內(nèi)果皮，取完整飽滿的種子，用清水浸泡去掉種皮，胚培養(yǎng)備用。接種時(shí)消毒， 用70%酒精浸泡種子30s，升汞浸泡lOmin，無菌水沖洗3次，接種備用。實(shí)施例2梅花種子的胚培養(yǎng)將實(shí)施例1滅菌過的種子放在無菌濾紙上，吸干種子表面的水；用鑷子將子葉分離，用刀片切割帶胚的子葉的下半部分，去掉其中的一片子葉以及另一片子葉的1/2，然后將外植體接種于含有40ml培養(yǎng)基的IOOml錐形瓶中，每瓶接種3個(gè)外植體，培養(yǎng)基配方為 MS+O. 5-1. 5mg/L 6-BA+0. 1-0. 3mg/L IBA (見表 1)，其中添加了濃度 30g/L 的蔗糖，7g/L 的瓊脂；將培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下，25 士 3°C培養(yǎng)兩周時(shí)間，再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周。光培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000 3000Lx，光照時(shí)間14h/d。接種一個(gè)月左右即可得到無菌苗。個(gè)激素濃度與萌發(fā)率結(jié)果見表1。表1不同激素組合對(duì)胚培養(yǎng)的影響
權(quán)利要求
1.一種梅花葉片愈傷組織誘導(dǎo)方法，其為以真梅系梅花品種胚培養(yǎng)獲得的實(shí)生苗的幼嫩葉片為外植體，近軸面朝上接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2周以上，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D 0. 25 2. 00mg/L，pH = 5. 8 6. 0的固體培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中幼嫩葉片在接種前，去掉葉柄， 用刀片沿主脈橫切2 3刀，保證葉緣處相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述幼嫩葉片為實(shí)生苗長(zhǎng)至6 8片葉片時(shí)，從上往下數(shù)第3 4片葉片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，胚培養(yǎng)包括如下步驟1)取開花后50 70天未成熟的梅花果實(shí)，用0.5 1. 5%的高錳酸鉀溶液清洗外果皮并浸泡1 池，之后流水沖洗1 池；2)砸碎果實(shí)，取出種子，并用流水清洗去掉種皮；3)將步驟2、去掉種皮的種子用70%的乙醇浸泡20 40s，升汞浸泡8 15min， 無菌水沖洗至少3次后備用；4)將步驟3)表面滅菌后的種子保留部分子葉，接種于MS+0.5 1. 5mg/L6-BA+0. 1 0. 3mg/L IBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固體實(shí)生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1 3周后，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000 3000Lx，光照時(shí)間為14h/d。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固體實(shí)生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LIBA+ 蔗糖 20 40g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+ 蔗糖 20 40g/L+2，4-D0. 5 1. 5mg/L, pH = 5. 8 6. 0 的固體培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖 20 40g/L+2，4-Dl. Omg/L, pH = 5. 8 6. 0 的固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供一種梅花葉片愈傷組織誘導(dǎo)方法，其為以真梅系梅花品種胚培養(yǎng)獲得的實(shí)生苗的幼嫩葉片為外植體，近軸面朝上接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2周以上，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D 0.25～2.00mg/L，pH＝5.8～6.0的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明中建立了梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系，該體系的建立，能夠高效的誘導(dǎo)愈傷組織，使葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)90％以上，而且愈傷組織的增殖量大。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102550404SQ20111042221
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者張啟翔, 楊煒茹, 石文芳, 陳晶鑫 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)