專利名稱：鈉氫泵蛋白及其編碼基因和它們的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鈉氫泵蛋白，還涉及鈉氫泵蛋白的編碼基因，以及含有鈉氫泵基因的重組載體和細胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。
背景技術：
鈉氫泵(Na+/H+antiporter)是細胞中負責Na+/H+交換的一種跨膜運輸蛋白，廣泛存在于細菌、人和高等植物的質膜及許多真核生物細胞器的膜中。質膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+從細胞質中泵出細胞，產生跨質膜的H+電化學勢梯度，提供能量，驅動質膜上的鈉氫泵蛋白，使H+順其電化學勢進入細胞，同時Na+逆其電化學勢排出細胞。鈉氫泵蛋白通過Na+外排來保 持細胞內的低Na+水平和pH值的穩(wěn)定，是生物細胞耐受鹽堿的關鍵因子，另外它在細胞器的發(fā)生及離子均衡過程中，還執(zhí)行體積和滲透調節(jié)的功能，是保持細胞離子均衡的關鍵因子。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人基于對鈉氫泵的分子生物學研究，發(fā)現從嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)中得到了一種鈉氫泵蛋白及其編碼基因，另一方面還提供了含有鈉氫泵基因的重組載體和細胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。本發(fā)明提供了一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種鈉氫泵基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。本發(fā)明還提供了一種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。本發(fā)明還提供了得到的鈉氫泵蛋白及其編碼基因、含有該基因的重組載體及轉基因細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。鈉氫泵蛋白在耐鹽堿植物培育等方面具有重要的應用潛力。通過克隆得到鈉氫泵基因，并通過轉基因的操作將微生物來源的鈉氫泵基因導入到植物細胞中，獲得耐鹽堿性提聞的轉基因植株成為可能。


圖1顯示了重組載體pUC18-Bspl65-NhaE導入的大腸桿菌K12(pUC18-Bspl65-NhaE)的耐堿性的測定結果，其中，將重組載體pUC18-Bspl65_NhaE導入的大腸桿菌K12 (pUC18-Bspl65-NhaE)分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5 (含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH調節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定0D600，以導入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。圖2顯示了鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc以及導入重組載體pUC18-Bspl65_NhaE的KNabc (pUC18_Bspl65_NhaE)耐堿性的測定結果，其中，將導入重組載體pUC18_Bspl65_NhaE 的 KNabc (pUC18_Bspl65_NhaE)和納氧栗缺失的大腸桿菌 KNabc 分別接種至Ij pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。
具體實施例方式以下本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。相應地，本發(fā)明還提供了一種鈉氫泵基因，其中，該基因具有SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的鈉氫泵基因是從嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)中克隆得到的。此外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。在本發(fā)明中，所述“載體”可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒,曬菌體及反轉錄病毒等。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌pUC18質粒。本發(fā)明還提供了一種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。所述轉基因細胞為原核細胞或真核細胞，優(yōu)選可以是大腸桿菌、枯草桿菌或煙草BY2細胞，最優(yōu)選大腸桿菌。此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的鈉氫泵蛋白及其編碼基因、及含有鈉氫泵基因的重組載體和轉基因細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。所述生物為植物或微生物。實施例1編碼鈉氫泵的核苷酸序列的克隆(1)嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)總DNA的提取和純化取嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)的新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50毫摩爾/升Tris緩沖液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩爾/升乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 8.0)，混勻后于37°C放置20分鐘，然后加入2毫升10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，55°C放置5分鐘，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍體積乙醇，沉淀DNA。將沉淀回收的DNA先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，將所得DNA溶于0.5毫升TE緩沖液(pH 8.0,10毫摩爾/升Tris，I毫摩爾/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase) 3微升，37°C保溫I小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍體積乙醇，沉淀回收DNA，先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，真空干燥DNA沉淀，用去離子水溶解，得總DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結果為八26。/八280 — I.818，A260/A230 — 2.052。(2)鈉氫泵基因的克隆分析嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)的基因組信息后，設計鈉氫泵基因的上下游引物，其中上游引物為5’ -TATGACCATGATTACCATGACATACGCTC-3’，下游引物為5’ -CAGGTCGACTCTAGATTATTTTTTTGCTTTT-3’。通過高保真的核酸聚合酶 Pyrobest (Takara)，以上述提取的嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)基因組為模板擴增出鈉氫泵基因的全長。通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的大小，并將PCR產物送至諾賽基因公司測序，最后得到729bp的如SED ID NO:1所示的核苷酸序列。實施例2編碼鈉氫泵的基因功能驗證(I)重組克隆載體 pUC18-pUC18-Bspl65_NhaE 的構建利用Cycle-pure Kit純化上述得到的PCR產物。利用Fast clone Kit將純化的PCR產物和pUC18連接，將構建好的重組載體pUC18-Bspl65-NhaE通過化學轉化法導入到大腸桿菌K12BW25113中。通過含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板的篩選以及PCR驗證得到含有重組載體pUC18-Bspl65-NhaE插入的陽性克隆大腸桿菌K12 (pUC18-Bspl65_NhaE)，經測序證實pUC18-Bspl65_NhaE插入的擴增序列與鈉氫泵的核苷酸序列完全一致。(2)大腸桿菌K12BW25113鈉氫泵缺失體的構建通過設計含有待敲 除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物擴增打靶基因，利用大腸桿菌入噬菌體具有和宿主不同的λ Red重組系統(tǒng)將目的基因快速準確的敲除。通過敲除大腸桿菌K12BW2511的鈉氫泵基因，得到大腸桿菌K12BW25113鈉氫泵基因完全缺失的突變體E.coli KNabc，鈉氫泵基因被卡那霉素基因取代。(3)重組載體pUC18-Bspl65-NhaE導入的大腸桿菌K12(pUC18-Bspl65-NhaE)的耐堿性的測定將重組載體pUC18-Bspl65_NhaE 導入的大腸桿菌 K12 (pUC18-Bspl65_NhaE)分別接種至Ij pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以導入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結果如圖1所示。(4)鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc以及導入重組載體pUC18-Bspl65_NhaE的KNabc (pUC18_Bspl65_NhaE)耐喊性的測定將導入重組載體pUC18-Bspl65_NhaE 的 KNabc (pUC18_Bspl65_NhaE)和鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc分別接種到pH為8.0,8.5,9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE, 5N NaOH調節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結果如圖2所示。從圖1中可以看出，導入重組載體pUC18-Bspl65_NhaE的大腸桿菌K12在pH為
8.0,8.5,9.0和9.5的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，12小時后測定OD6tltl明顯高于導入PUC18空載體的大腸桿菌K12，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaE)的導入能夠提高大腸桿菌K12的耐堿性。從圖2中可以看出，導入重組載體pUC18-Bspl65_NhaE的大腸桿菌KNabc在pH8.0，8.5，9.0 和 9.5 (含有 50mM CAPS, HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調節(jié))的 LB 液體培養(yǎng)基中，12小時后測定0D_明顯高于導入大腸桿菌鈉氫泵的缺失體KNabc，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaE)的導入能夠提高大腸桿菌KNabc的耐堿性。綜上所述，本申請?zhí)峁┑拟c氫泵基因在耐鹽堿生物的培育等方面具有重要的應用潛力。通過克隆得到鈉氫泵基因，并通過轉基因的操作將微生物來源的鈉氫泵導入到植物細胞中，獲得耐鹽堿性提高 的轉基因植株成為可能。
權利要求
1.一種納氧栗蛋白，其特征在于，該納氧栗蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的鈉氫泵蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一種鈉氫泵基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一種重組載體，其 特征在于，該重組載體含有權利要求3所述的基因。
6.一種轉基因細胞，其特征在于，該轉基因細胞含有權利要求3所述的基因。
7.根據權利要求6所述的轉基因細胞，其中，所述轉基因細胞為原核細胞或真核細胞。
8.權利要求1所述的鈉氫泵蛋白、權利要求3所述的基因、權利要求5所述的重組載體、權利要求6所述的轉基因細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其中，所述生物為植物或微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。此外，還涉及鈉氫泵蛋白的編碼基因，其中，該基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。還涉及含有鈉氫泵基因的重組載體和細胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐堿性轉基因生物中的應用。
文檔編號A01H5/00GK103087162SQ20111033794
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權日2011年10月31日
發(fā)明者馬延和, 翟磊, 薛燕芬 申請人:中國科學院微生物研究所