專利名稱：一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種劍麻植株再生體系建立的方法，特別涉及一種H. 11648麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，屬于組織培養(yǎng)育苗技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
劍麻為重要的熱帶纖維作物，主要分布在南北回歸線之間的部分熱帶、亞熱帶地區(qū)，種植區(qū)域十分有限，資源總量稀缺；劍麻纖維是航運、漁船、鉆探所用繩纜、繩網(wǎng)，電梯、 吊車的鋼索繩心等不可替代的原料，目前劍麻制品已廣泛用于金屬拋光、特種紙漿、金屬制品、運輸、礦山、家庭裝飾、地毯、工藝、醫(yī)藥和汽車工業(yè)中。劍麻是我國熱帶地區(qū)的特色作物，自1963-1964年從國外引進劍麻高產(chǎn)品種 H. 11648以來，劍麻產(chǎn)量成倍增加，單產(chǎn)躍居世界前列，成為可出口創(chuàng)匯的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。目前 H. 11648麻仍然是我國劍麻生產(chǎn)唯一的當家品種，由于單一品種的長期使用，早花早衰現(xiàn)象突出，病蟲害不斷滋生，劍麻產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展已面臨嚴重威脅，生產(chǎn)上對培育抗病高產(chǎn)劍麻新品種十分迫切。劍麻生命周期長，一生僅開一次花，其基因的分配與重組的機會有限，而且雜交育種受到數(shù)量性狀遺傳的制約，從一次雜交獲得理想F1代的機率極少，必須經(jīng)選擇后再回交或雜交，使變異朝一定的方向積累才能育成有生產(chǎn)價值的新品種，因有性雜交育種時間長、效率低，因此利用基因工程對劍麻進行遺傳改良是緩解劍麻種植品種長期缺乏的有效途徑。國內(nèi)外對劍麻的組織培養(yǎng)和植株再生做了一定的探索。在國外利用種子、珠芽、 走莖以及莖段等為外植體通過直接或間接的器官發(fā)生方式已成功的建立了亞洲馬蓋麻(A cantala Robx)、灰葉劍麻Cl fourcroydes Lem)、普通劍麻Cl sisalana Perrine)、藍劍麻(A tequilana Weber cultivar azul )> A. parrasana Berger> Α. tequilana> Α. crassispina > Α. duranguensisA. vera-cruz Mill.、Α. atroFii-e1/ ^·禾口 A arizonica 等體外再生體系并獲得了完整的再生植株；在國內(nèi)廣東省農(nóng)墾科技中心以劍麻鉆心芽莖尖作為外植體通過快繁的方式獲得大量叢生芽。廣東湛江農(nóng)墾科研所2005年初利用H. 11648 高產(chǎn)植株的珠芽做外植體通過以快繁的方式成功培育了 2萬多株小苗，但均存在玻璃化和繁殖系數(shù)偏低現(xiàn)象；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所和海南大學(xué)分別利用劍麻嫩芽和無菌苗葉片為外植體通過愈傷誘導(dǎo)獲得完整再生植株，但愈傷組織增殖緩慢，易褐化死亡，分化系數(shù)也較低；而且重復(fù)性也較差；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所呂玲玲以H. 11648麻莖尖為外植體通過快繁的方式獲得了一定數(shù)量的H. 11648植株，但繁殖系數(shù)低，玻璃化嚴重，且重復(fù)性差。因此，開展劍麻H. 11648高效再生體系研究具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。不僅可以在短期內(nèi)提供大量再生植株，為優(yōu)良種質(zhì)快速繁殖提供有效途徑，同時為劍麻誘變育種、單倍體育種以及基因工程育種打下良好的基礎(chǔ)，為劍麻遺傳改良提供有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的是提供一種增殖快，分化系數(shù)高，可在短期內(nèi)獲得大量再生植株的劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，包括如下步驟
(1)外植體表面消毒及無菌苗培養(yǎng)
以劍麻H. 11648 10-15cm珠芽苗或10-20cm吸芽苗的莖尖為材料，先將外層老葉剝離， 流水沖洗，用0. 3%高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超凈工作臺上用75%酒精處理Imin，再用0. 1%氯化汞溶液處理15-30 min，最后用無菌水沖洗3-5次，晾干后縱切，接種于改良SH 培養(yǎng)基SHl上，培養(yǎng)基SHl添加6-芐氨基腺嘌呤6-BA濃度為1. 0-5. Omg/L,培養(yǎng)條件為每天光照12-14小時，暗培養(yǎng)10-12小時，光照強度20001uX，培養(yǎng)溫度為^±2°C，培養(yǎng)2_3 個月成苗；
(2)愈傷組織的誘導(dǎo)
取步驟(1)培養(yǎng)的生長健壯的無菌苗莖尖縱切后置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)10天， 剝離外層葉片后轉(zhuǎn)入半光條件下培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基添加外源激素為萘乙酸NAA和6-芐氨基腺嘌呤6-BA ；萘乙酸NAA的濃度為0. 1-1. Omg/L, 6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1. 0-3. 5mg/L ；培養(yǎng)基的pH為5. 8-6. 0 ；誘導(dǎo)條件為光照12_14h，黑暗10-12h，光照強度20001UX，溫度；
(3)愈傷組織繼代培養(yǎng)
將步驟(2)誘導(dǎo)的淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)， 繼代培養(yǎng)基為改良的SH培養(yǎng)基SH2，培養(yǎng)基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ；其中6-BA的濃度為1. 5-4. Omg/L; NAA的濃度為0. 05-0. 5mg/L, IBA的濃度為0. 05-0. 5mg/L ；培養(yǎng)基的pH為5. 8-6. 0 ；繼代培養(yǎng)條件為光照12_14h，黑暗 10-12h，光照強度 20001UX，溫度 28士2°C ；
(4)不定芽誘導(dǎo)
將經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后得到的塊狀或球狀的淺黃綠色愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中進行不定芽誘導(dǎo)，分化基本培養(yǎng)基為改良SH培養(yǎng)基SHl，培養(yǎng)基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ；其中6-BA的濃度為1. 0-5. Omg/L; NAA的濃度為 0-1. 5mg/L, IBA 的濃度為 0-1. 5mg/L,培養(yǎng)基的 pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h， 光照為2000Lx，溫度；
(5)生根培養(yǎng)
將經(jīng)過不定芽誘導(dǎo)得到的再生植株長到5-8cm左右時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)， 生根基本培養(yǎng)基為改良SH培養(yǎng)基SHl，培養(yǎng)基添加外源激素IBA濃度為0. 5-3. 0 mg/L，培養(yǎng)基的PH為5. 8-6.0;光照12-14h，黑暗10_12h，溫度；
(6)再生植株移栽
待經(jīng)過生根培養(yǎng)的再生植株生根2-3周，長出4-5條壯根時，將其置于自然條件下煉苗 1周，然后將其移出，洗凈基部殘留的培養(yǎng)基，用3%高錳酸鉀浸泡Umin后移植到基質(zhì)為椰糠和河沙(椰糠河沙=1:1)的塑料遮光大棚中，大棚遮光度75%，白天最高溫度不超過 32°C，夜晚最低溫度不低于20°C，每天早晚各澆透水1次，再生植株的成活率在90%以上， 幼苗長出新葉后開始追施洲復(fù)合肥水肥，施肥后用清水噴淋一次，待幼苗長出新葉3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然環(huán)境下繼續(xù)培育。上述的改良的SHl培養(yǎng)基大量修改的成分為硝酸鉀1500-2500 mg/1，磷酸二氫鉀 150-500 mg/1，硝酸氨 100_500mg/l，SH 鐵鹽中的 FeSO4 · 7H20 為 15-27. 8mg/l, Na2-EDTA % 15-37. 3mg/l, SH微量的SiSO4 · 7H20為5_15mg/l，原來SH培養(yǎng)基的有機成分改為MS培養(yǎng)基的有機成分。上述的改良SH2培養(yǎng)基大量修改的成分為硝酸鉀0_2000mg/l，硝酸氨300-1100 mg/1,磷酸二氫鉀 150-500 mg/1, SH 鐵鹽中的 FeSO4. 7H20 為 15-27. 8mg/l, Na2-EDTA 為 15-37. ;3mg/l，SH微量的SiSO4. 7H20為5_15mg/l，原來SH培養(yǎng)基的有機成分改為MS培養(yǎng)基的有機成分。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是
本發(fā)明對劍麻H. 11648莖尖組織進行愈傷誘導(dǎo)及植株再生，愈傷誘導(dǎo)率和分化率均在 90%以上，愈傷組織顏色鮮艷，增殖快，分化系數(shù)高，不僅可在短期內(nèi)獲得大量再生植株，同時為H. 11648麻遺傳轉(zhuǎn)化和體外誘變研究創(chuàng)造有利條件，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種奠定了良好的基礎(chǔ)。該方法實施步驟簡單易行、快速、高效、實施條件寬松效果非常顯著。


圖1為本發(fā)明例1的無菌苗莖尖暗培養(yǎng)10天的情形； 圖2為本發(fā)明例1愈傷誘導(dǎo)1個月的情形；
圖3為愈傷組織繼代培養(yǎng)； 圖4為愈傷組織分化不定芽； 圖5為再生植株生根培養(yǎng)； 圖6為再生植株移栽。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1
取保存于本實驗室生長健壯的無菌苗莖尖為外植體，縱切后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (MS + NAA 0. 1-1. Omg/L + 6-BA 1. 5_3. 5mg/L)中暗培養(yǎng)10天，剝離外層葉片后轉(zhuǎn)入半光條件下培養(yǎng)，待愈傷組織誘導(dǎo)出來后，取淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織接種在愈傷繼代培養(yǎng)基(改良 SH2+6-BA 1. 5-4. Omg/L+NAA 0. 05-0. 5mg/L+IBA 0. 05-0. 5mg/L)中進行繼代培養(yǎng)，待愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(改良SH1+6-BA 1. 0-5. Omg/ L+NAA 0-1. 5mg/L+IBA 0-1. 5mg/L)中誘導(dǎo)植株再生。培養(yǎng)條件為pH5. 8-6. 0，卡那膠 6. 8-8. 0 g/Ι，蔗糖30g/l，光照12-14h，黑暗10_12h，溫度28士2°C ；本次接種58個外植體共獲得1021株再生植株，愈傷誘導(dǎo)率為93. 6%，分化率為92. 9%。實施例2
以H. 11648麻吸芽苗莖尖為材料進行消毒，先去除根和部分老葉，在流水沖洗下用手術(shù)刀片將其剩余葉片剝離，用0. 3%高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超凈工作臺上用75%酒精浸泡lmin，再用0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用無菌水沖洗3_5次。晾干并切除部分外植體，縱切后接種于改良SH1+6-BA1. 0-5. Omg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為每天光照 12-14小時，暗培養(yǎng)10-12小時，光照強度20001UX，培養(yǎng)溫度為^±2°C。待叢芽長出后， 以生長健壯的叢生芽莖尖為外植體，縱切并接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 6-BA 1. 5-3. 5mg/ L + NAA 0. 1-1. Omg/L中暗培養(yǎng)10天，剝離外層葉片后轉(zhuǎn)入半光條件下培養(yǎng)，每30天繼代 1次，待愈傷誘導(dǎo)出來后，取淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基(改良SH2 + 6-BA 1. 5-4. Omg/L mg/L + NAA 0. 05-0. 5mg/L + IBA 0. 05-0. 5mg/L )中進行繼代培養(yǎng)， 待愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(改良SH1+6-BA 1. 0-5. Omg/L+NAA 0-1. 5mg/L+IBA 0-1. 5mg/L)中誘導(dǎo)再生植株。培養(yǎng)條件為pH5. 8-6. 0，卡那膠6. 8-8. 0 g/ 1，蔗糖30g/l，光照12-14h，黑暗10-12h，光照為2000Lx，溫度沘士2工，濕度相對60%;本次接種24個外植體共獲得256株再生植株，愈傷誘導(dǎo)率為90. 9%，分化率為91. 6%。
實施例3
以劍麻H. 11648 10-15cm珠芽苗莖尖為材料進行消毒，流水沖洗下用手術(shù)刀片將葉片剝離，用0. 3%高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超凈工作臺上用75%酒精浸泡lmin，再用 0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用無菌水沖洗3-5次。晾干并切除部分外植體，縱切后接種于改良SH1+6-BA1. 0-5. Omg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為每天光照12-14小時，暗培養(yǎng) 10-12小時，光照強度20001UX，培養(yǎng)溫度為^±2°C。待叢生芽誘導(dǎo)出來后，取生長健壯的無菌苗莖尖，縱切后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)10天，剝離外層葉片后轉(zhuǎn)入半光條件下培養(yǎng)，取淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基(改良SH2 + 6-BA 1. 5-4. Omg/ L mg/L + NAA 0. 05-0. 5mg/L + IBA 0. 05-0. 5mg/L )中進行繼代培養(yǎng)，待愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(改良SH1+6-BA 1. 0-5. 0mg/L+NAA 0-1. 5mg/L+IBA 0-1. 5mg/L)中誘導(dǎo)再生植株。培養(yǎng)條件為:pH5. 8-6. 0，卡那膠6. 8-8. 0 g/Ι，蔗糖30g/l, 光照12-14h，光照為2000Lx，溫度^±2°C，濕度相對60%。本次接種30個外植體共獲得 325株再生植株，愈傷誘導(dǎo)率為93. 3%，分化率為90. 4%。
權(quán)利要求
1.一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體表面消毒及無菌苗培養(yǎng)以劍麻H. 11648 10-15cm珠芽苗或10-20cm吸芽苗的莖尖為材料，先將外層老葉剝離， 流水沖洗，用0. 3%高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超凈工作臺上用75%酒精處理Imin，再用0. 1%氯化汞溶液處理15-30 min，最后用無菌水沖洗3-5次，晾干后縱切，接種于改良SH 培養(yǎng)基SHl上，培養(yǎng)基SHl添加6-芐氨基腺嘌呤6-BA濃度為1. 0-5. Omg/L,培養(yǎng)條件為每天光照12-14小時，暗培養(yǎng)10-12小時，光照強度20001UX，培養(yǎng)溫度為^±2°C，培養(yǎng)2_3 個月成苗；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)取步驟(1)培養(yǎng)的生長健壯的無菌苗莖尖縱切后置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)10天， 剝離外層葉片后轉(zhuǎn)入半光條件下培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基添加外源激素為萘乙酸NAA和6-芐氨基腺嘌呤6-BA ；萘乙酸NAA的濃度為0. 1-1. Omg/L, 6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1. 0-3. 5mg/L ；培養(yǎng)基的pH為5. 8-6. 0 ；誘導(dǎo)條件為光照12_14h，黑暗10-12h，光照強度20001UX，溫度；(3)愈傷組織繼代培養(yǎng)將步驟(2)誘導(dǎo)的淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)， 繼代培養(yǎng)基為改良的SH培養(yǎng)基SH2，培養(yǎng)基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ；其中6-BA的濃度為1. 5-4. Omg/L; NAA的濃度為0. 05-0. 5mg/L, IBA的濃度為0. 05-0. 5mg/L ；培養(yǎng)基的pH為5. 8-6. 0 ；繼代培養(yǎng)條件為光照12_14h，黑暗 10-12h，光照強度 20001UX，溫度 28士2°C ；(4)不定芽誘導(dǎo)將經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后得到的塊狀或球狀的淺黃綠色愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中進行不定芽誘導(dǎo)，分化基本培養(yǎng)基為改良SH培養(yǎng)基SHl，培養(yǎng)基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ；其中6-BA的濃度為1. 0-5. Omg/L; NAA的濃度為 0-1. 5mg/L, IBA 的濃度為 0-1. 5mg/L,培養(yǎng)基的 pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h， 光照為2000Lx，溫度；(5)生根培養(yǎng)將經(jīng)過不定芽誘導(dǎo)得到的再生植株長到5-8cm左右時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)， 生根基本培養(yǎng)基為改良SH培養(yǎng)基SHl，培養(yǎng)基添加外源激素IBA濃度為0. 5-3. 0 mg/L，培養(yǎng)基的 PH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗 10_12h，溫度 28士2°C ；(6)再生植株移栽待經(jīng)過生根培養(yǎng)的再生植株生根2-3周，長出4-5條壯根時，將其置于自然條件下煉苗 1周，然后將其移出，洗凈基部殘留的培養(yǎng)基，用3%高錳酸鉀浸泡Umin后移植到基質(zhì)為椰糠和河沙的塑料遮光大棚中，大棚遮光度75%，白天最高溫度不超過32°C，夜晚最低溫度不低于20°C，每天早晚各澆透水1次，再生植株的成活率在90%以上，幼苗長出新葉后開始追施m復(fù)合肥水肥，施肥后用清水噴淋一次，待幼苗長出新葉3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然環(huán)境下繼續(xù)培育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，其特征在于所述的改良的SHl培養(yǎng)基大量修改的成分為硝酸鉀1500-2500 mg/1，磷酸二氫鉀 150-500 mg/1，硝酸氨 100_500mg/l，SH 鐵鹽中的 FeSO4 · 7H20 為 15-27. 8mg/l, Na2-EDTA 為 15-37. 3mg/l, SH微量的SiSO4 · 7H20為5_15mg/l，原來SH培養(yǎng)基的有機成分改為MS培養(yǎng)基的有機成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，其特征在于所述的改良SH2培養(yǎng)基大量修改的成分為硝酸鉀0-2000mg/l，硝酸氨300-1100 mg/1,磷酸二氫鉀 150-500 mg/1, SH 鐵鹽中的 FeSO4. 7H20 為 15-27. 8mg/l, Na2-EDTA 為 15-37. ;3mg/l，SH微量的SiSO4. 7H20為5_15mg/l，原來SH培養(yǎng)基的有機成分改為MS培養(yǎng)基的有機成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，其特征在于步驟(6)所述的基質(zhì)的重量比為椰糠河沙=1:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種劍麻莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立的方法，包括以下步驟(1)無菌苗培養(yǎng)莖尖作為外植體，消毒后縱切，接種在培養(yǎng)基中；(2)愈傷組織誘導(dǎo)用無菌苗莖尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中先進行暗培養(yǎng)，然后進行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)愈傷組織繼代培養(yǎng)取誘導(dǎo)的淡黃綠色球狀或塊狀愈傷組織進行繼代培養(yǎng)；(4)分化培養(yǎng)及植株再生將繼代培養(yǎng)獲得的塊狀或球狀的淺黃綠色愈傷組織進行不定芽誘導(dǎo)；(5)生根培養(yǎng)待分化出再生植株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(6)再生植株移栽；本方法通過對SH培養(yǎng)基進行改良，建立了劍麻愈傷誘導(dǎo)及再生體系，方法簡單，外植體容易獲得，生產(chǎn)快速、高效，為劍麻誘變和基因工程育種打下了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號A01G31/00GK102283131SQ20111021439
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者周文釗, 張燕梅, 戴梅蓮, 李俊峰, 林映雪, 陸軍迎 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所