專利名稱：一種半楓荷離體組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，尤其是涉及一種半楓荷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
半楓荷Wii/^ia chingii Mete是金縷梅科常綠喬木，國家二級保護(hù)植物。中國特有種，具有楓香屬Liguidambar和蕈樹屬Altingia兩屬間的綜合性狀，對研究金縷梅科系統(tǒng)發(fā)育有科學(xué)價(jià)值。木材材質(zhì)優(yōu)良，旋刨性良好，可作旋刨制品。同時(shí)樹皮有舒筋活血、 祛風(fēng)除濕等功效民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腰腿痛、半身不遂、跌打損傷等癥，療效顯著。因天然林分受人為干擾嚴(yán)重及自然繁殖困難，分布范圍越來越窄，致使野生資源極為稀少。植物的組織培養(yǎng)指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。不同植物在離體培養(yǎng)過程中對的基本培養(yǎng)基類型、激素配比、培養(yǎng)條件等要求不同。目前利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在開展植物種質(zhì)資源保護(hù)和生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)苗木等方面上的技術(shù)以日趨完善。現(xiàn)有技術(shù)均是以半楓荷葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷，通過愈傷增殖，再誘導(dǎo)愈傷分化成芽，且未誘導(dǎo)出不定根。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單的、誘導(dǎo)率高，成活率高的半楓荷的完整的組織培養(yǎng)方法。為解決上述問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案即為一種半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其具體步驟為
取材取半楓荷的當(dāng)年生枝條為外植體；于合適時(shí)間取優(yōu)良母株當(dāng)年生枝條為外植體；所述合適時(shí)間優(yōu)選為連續(xù)晴天一周后，于中午12 14點(diǎn)取材；
無菌材料的建立對外植體進(jìn)行消毒處理獲得無菌材料；具體為將外植體用洗潔精清洗并浸泡，再用流水沖洗，置于操作臺上，剪成帶1-2個(gè)節(jié)間的莖段，75%乙醇處理，再用 0. 1%升汞浸泡處理，期間不斷震蕩，無菌水清洗；
芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將無菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)出不定芽；所述所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+6-BA1. 5 2. 5mg/L +ΝΑΑ0. 2 0. 4mg/L,所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為光照時(shí)間8 12 h，光照強(qiáng)度3000 50001x，溫度25 27°C ；
增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)出的不定芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)出新的不定芽；所述芽增殖培養(yǎng)基為改良 MS+6-BA0. 4 0. 8mg/L +ΝΑΑ0. 05 0. 15mg/L ；
生根培養(yǎng)將新長出的2 - 3cm的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，使長出2 - 3cm的的根；所述生根培養(yǎng)基為1/2改良MS+IBA0. 4 0. 8mg/L +ΝΑΑ0. Γθ. 3mg/L ；
其中改良MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中NH4NO3含量調(diào)整為34(T660 mg/L、KN03含量調(diào)整為 1318 1722 mg/L，卡拉膠 6. 7 g/L，蔗糖 30g/L，pH 值 5. 8-6. O ； 1/2 改良 MS 即將改良 MS中大量元素減半，其余組分含量不變。移栽將生根苗先移栽至大棚進(jìn)行煉苗，再經(jīng)過處理后移栽入田間。具體為煉苗后將生根苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，0. 1%代森錳鋅浸泡處理，陰干，待植株枝干上的水分陰干后，移栽入事先已用0. 1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中，其中的基質(zhì)優(yōu)選為泥炭土 草炭珍珠巖為 9 :6 :1ο本發(fā)明提供一種具體的半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，為
取材連續(xù)晴天一周后，于中午12 2點(diǎn)取材，以優(yōu)良母株當(dāng)年生枝條為外植體； 無菌材料的建立將外植體用洗潔精清洗并浸泡lOmin，后用流水沖洗30min，置于操作臺上，剪成帶1-2個(gè)節(jié)間的莖段，75%乙醇處理25 s,0. 1%升汞浸泡處理10 min，期間不斷震蕩，無菌水清洗6遍，獲得無菌材料；
芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將無菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照時(shí)間纊12 h，光照強(qiáng)度3000 50001x，溫度25 27°C，14天后，可誘導(dǎo)出2 3cm的不定芽；
增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中，約7天后可見不定芽與培養(yǎng)基接觸的地方冒出新的芽點(diǎn)，其中的芽增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA0. Γ0. 8mg/L +ΝΑΑΟ. ΟΓΟ. 15mg/L ；
生根培養(yǎng)將新長出的2 - 3cm的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，使長出2 - 3cm的根；將2 3cm長的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，5d后可見其莖段末端切口處冒出白色根原基，14天后長成2 3cm的根，其中的生根培養(yǎng)基為1/2改良MS+IBA0. 4 0. 8mg/L +ΝΑΑΟ. Γθ. 3mg/L,
其中改良MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中NH4NO3含量調(diào)整為34(T660 mg/L、KN03含量調(diào)整為 1318 1722 mg/L，卡拉膠 6. 7 g/L，蔗糖 30g/L，pH 值 5. 8-6. O ； 1/2 改良 MS 即將改良 MS 中大量元素減半，其余組分含量不變。移栽將生根苗先移栽至大棚進(jìn)行煉苗，7天后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養(yǎng)基，用0. 1%代森錳鋅浸泡處理纊3 min，陰干，待植株枝干上的水分陰干的差不多時(shí)，移栽入事先已用0. 1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中，移栽后做好田間溫濕度管理，其中的基質(zhì)優(yōu)選為泥炭土 草炭珍珠巖為9 :6 :1。本技術(shù)完整的技術(shù)路線為以莖段為外植體，直接誘導(dǎo)不定叢芽(避免現(xiàn)有技術(shù)中用愈傷分化叢芽易出現(xiàn)變異的情況)，再通過不定叢芽的增殖、生根培養(yǎng)，以及組培苗的馴化移栽，從而建立起半楓荷完整的快繁體系。本發(fā)明公開的是一種新的半楓荷快繁體系，首次完成半楓荷整個(gè)組培育苗的流程，建立起其快繁體系。本發(fā)明的誘導(dǎo)率是用莖段誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率，達(dá)到70%，且通過不定叢芽的增殖，其增殖系數(shù)高達(dá)5. 62。本發(fā)明的生根率和成活率均較高，分別達(dá)到了 98. 7%和94. 2%。 利用此方法可簡單、高效的培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效的保護(hù)和繁殖該物種，滿足市場對半楓荷的需求，同時(shí)解除半楓荷的瀕危狀態(tài)，為今后更進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種奠定良好的基礎(chǔ)。


圖1和圖2，為半楓荷不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果圖； 圖3和圖4，為半楓荷不定芽的增殖結(jié)果圖；圖5和圖6，為半楓荷不定芽的生根結(jié)果圖； 圖7和圖8，為半楓荷生根苗的移栽圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例半楓荷的組織培養(yǎng)
1、半楓荷的取材到誘導(dǎo)出芽
連續(xù)晴天一個(gè)禮拜后，于中午12 14點(diǎn)取材，以江西全南縣天龍山優(yōu)良母株種子繁殖起來的植株的當(dāng)年生枝條為外植體，用洗潔精清洗并浸泡lOmin，后用流水沖洗30min，置于操作臺上，剪成帶1-2個(gè)節(jié)間的莖段，75%乙醇處理25 s，0. 1%升汞浸泡處理10 min, 期間不斷震蕩，無菌水清洗6遍，接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照時(shí)間纊12 h，光照強(qiáng)度3000 50001x，溫度25 27°C，14d后，可誘導(dǎo)出2 3cm的腋芽，見附圖1和2。誘導(dǎo)率為70% ； 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為改良MS (配方見表1) +6-BA1. 5 2. 5mg/L +NAAO. 2 0. 4mg/L ；
2、半楓荷組織培養(yǎng)的芽增殖與生根
將誘導(dǎo)出的不定叢芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中，約7d后可見不定芽與培養(yǎng)基接觸的地方冒出新的芽點(diǎn)，4周后統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)為5. 62%，葉片顏色正常，瓶苗生長狀況良好，見附圖3和4。將2 3cm長的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，光照時(shí)間8 12h，光照強(qiáng)度300(Γ5000 lx，溫度25 27°C。5d后可見其莖段末端切口處冒出白色根原基，14d后長成2 3cm的根，見附圖5和6。生根率98. 7%;
芽增殖培養(yǎng)基成分為改良MS+6-BA0. 4 0. 8mg/L +NAAO. 05 0. 15mg/L) 生根培養(yǎng)基成分為改良MS (配方見表2) +ΙΒΑ0. 4 0. 8mg/L +NAAO. Γθ. 3mg/L)
3、半楓荷組織培養(yǎng)方法中的移栽至大田
將生根瓶苗轉(zhuǎn)至移栽大棚進(jìn)行煉苗，見附圖7和8。7d后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養(yǎng)基，用0. 1%代森錳鋅浸泡處理纊3 min，陰干，待植株枝干上的水分陰干的差不多時(shí)，移栽入事先已用0. 1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中(泥炭土 草炭珍珠巖為9 6 :1)，移栽后做好田間溫濕度管理，成活率可達(dá)94. m。本發(fā)明中的半楓荷取自于江西全南縣天龍山優(yōu)良母株種子，不限于此，其它地方來源的半楓荷也能達(dá)到該發(fā)明目的；
表1改良MS
權(quán)利要求
1.一種半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟 取材取半楓荷的當(dāng)年生枝條為外植體；無菌材料的建立對外植體進(jìn)行消毒處理獲得無菌材料；芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將無菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)出不定芽；增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)出的不定芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)出新的不定芽； 生根培養(yǎng)將新長出的2 - 3cm的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，使長出2 - 3cm的的根；移栽將生根苗先移栽至大棚進(jìn)行煉苗，再經(jīng)過處理后移栽入田間。
2.權(quán)利要求1所述的半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述取材為，合適時(shí)間取優(yōu)良母株當(dāng)年生枝條為外植體；所述無菌材料的建立為將外植體用洗潔精清洗并浸泡，再用流水沖洗，置于操作臺上，剪成帶1-2個(gè)節(jié)間的莖段，75%乙醇處理，再用0. 1%升汞浸泡處理，期間不斷震蕩，無菌水清洗；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+6-BA1. 5 2. 5mg/L +ΝΑΑ0. 2 0. %ig/L，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為光照時(shí)間8 12h，光照強(qiáng)度3000 5000 lx，溫度25 27°C ；所述芽增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA0. 4 0. 8mg/L +ΝΑΑ0. 05 0. 15mg/L ； 所述生根培養(yǎng)基為改良MS+IBA0. 4 0. 8mg/L +ΝΑΑ0. Γθ. 3mg/L ； 所述移栽中，煉苗后將生根苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，0. 1%代森錳鋅浸泡處理，陰干，待植株枝干上的水分陰干后，移栽入事先已用0. 1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中。
3.權(quán)利要求2所述的半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述合適時(shí)間優(yōu)選為連續(xù)晴天一周后，于中午12 14點(diǎn)取材；所述基質(zhì)為泥炭土 草炭珍珠巖為9 :6 :1。
4.一種半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟取材連續(xù)晴天一周后，于中午12 14點(diǎn)取材，以優(yōu)良母株當(dāng)年生枝條為外植體； 無菌材料的建立將外植體用洗潔精清洗并浸泡lOmin，后用流水沖洗30min，置于操作臺上，剪成帶1-2個(gè)節(jié)間的莖段，75%乙醇處理25 s,0. 1%升汞浸泡處理10 min，期間不斷震蕩，無菌水清洗6遍，獲得無菌材料；芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將無菌材料接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照時(shí)間纊12 h，光照強(qiáng)度 3000 5000 lx，溫度25 27°C，14天后，可誘導(dǎo)出2 3cm的不定芽；增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接至芽增殖培養(yǎng)基中，約7天后可見不定芽與培養(yǎng)基接觸的地方冒出新的芽點(diǎn)，其中的芽增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA0. Γ0. 8mg/L +NAAO. 05 0. 15mg/L ；生根培養(yǎng)將新長出的2 - 3cm的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，使長出2 - 3cm的根；將2 3cm長的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，5d后可見其莖段末端切口處冒出白色根原基，14天后長成2 3cm的根，其中的生根培養(yǎng)基為1/2改良MS+IBA0. 4 0. 8mg/L +NAAO. Γθ. 3mg/L ；移栽將生根苗先移栽至大棚進(jìn)行煉苗，7天后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養(yǎng)基，用0. 1%代森錳鋅浸泡處理纊3 min，陰干，待植株枝干上的水分陰干的差不多時(shí)，移栽入事先已用0. 1%高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中，移栽后做好田間溫濕度管理。
5.權(quán)利要求4所述的半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述基質(zhì)為泥炭土 草炭珍珠巖為9 :6 :1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半楓荷離體組織培養(yǎng)方法，其步驟包括以半楓荷當(dāng)年生枝條為外植體；對外植體進(jìn)行消毒處理獲得無菌材料；通過芽誘導(dǎo)培養(yǎng)成不定芽；再經(jīng)過增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)以及組培苗的馴化移栽，建立起半楓荷完整的快繁體系。利用此方法可簡單、高效的培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效的保護(hù)和繁殖該物種，滿足市場對半楓荷的需求，同時(shí)解除半楓荷的瀕危狀態(tài)，為今后更進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種奠定良好的基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK102301958SQ201110211490
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者劉秀芳, 徐進(jìn)芳, 曹冬萍, 林文革, 陳細(xì)萍 申請人:地緣(廈門)生物科技有限公司