專(zhuān)利名稱：水稻轉(zhuǎn)錄因子OsAP21基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子基因的功能及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)作物產(chǎn)量危害的自然災(zāi)害中，干早、低溫和鹽漬是諸多非生物逆境中最為嚴(yán)重的，這些不利的環(huán)境因素能夠?qū)χ参镌斐蓚?。例如，干早脅迫能夠影響光合作用，抑制植物生長(zhǎng)，而且會(huì)在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致大量活性氧和自由基的產(chǎn)生，從多方面影響植物的正常生長(zhǎng)。 低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，從而導(dǎo)致類(lèi)似于干旱引起的滲透脅迫發(fā)生。高鹽脅迫則會(huì)破壞水勢(shì)的平衡和離子分布的平衡，導(dǎo)致植物受到分子損傷、生長(zhǎng)延遲。這些非生物逆境不僅嚴(yán)重制約了糧食生產(chǎn)，而且日益惡化植物的生存環(huán)境乃至影響到人類(lèi)。在緩解環(huán)境日益惡化的同時(shí)，使植物自身對(duì)這些逆境具有更強(qiáng)的抵抗力是保證作物產(chǎn)量、質(zhì)量不受影響的一個(gè)重要手段。轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)非常重要的一類(lèi)基因，它們是一群能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，從而調(diào)控目的基因以特定的強(qiáng)度、在特定的時(shí)間與空間表達(dá)蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子可以單獨(dú)或協(xié)同調(diào)節(jié)各種脅迫誘導(dǎo)功能基因的表達(dá)，從而形成不同的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在這些網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)錄因子往往作為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)將不同逆境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)連接在一起，形成更大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，要使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良，轉(zhuǎn)錄因子具有很好的潛能。轉(zhuǎn)錄因子OsAP21基因序列于2005年由Ohyanagi等在NCBI上登陸 (ΝΜ_001048853 )，但對(duì)其功能至今還沒(méi)有任何研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子OsAP21基因的功能，并進(jìn)一步公開(kāi)了該基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)OsAP21基因在水稻受激素及非生物逆境時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)模式判斷， 該基因可能參與植物抗逆途徑。根據(jù)該基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從水稻 IR36總cDNA中擴(kuò)增得到OsAP21基因。利用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化到擬南芥植株中，并研究其在擬南芥體內(nèi)的抗逆功能，為基因在其他植物上的應(yīng)用提供了很好的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的水稻OsAP21基因可用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的抗旱、耐鹽和耐冷能力。本發(fā)明還公開(kāi)了一種提高植物抗旱、耐鹽和耐冷能力的方法，是用水稻OsAP21基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。所述的提高植物抗旱、耐鹽和耐冷能力的方法，包括下述步驟
(1)提取水稻RNA，
(2)PCR獲得水稻OsAP21基因片段，(3)將水稻OsAP21基因片段構(gòu)建到pCAMBIA-1304中獲得農(nóng)桿菌雙元載體命名為 YG8473,
(4)利用電擊法質(zhì)粒YG8473轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，
(5)帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌采用蘸花法轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，
(6)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選。本發(fā)明根據(jù)OsAP21基因的序列(ΝΜ_001048853)設(shè)計(jì)如下引物 R6995 5，-GGATCCATGGCTGCCAGCGAGGAAAGCTC-3，(SEQ ID NO. 1), R6996 5，- GAGCTCTAGTACTCC CAGAGGAGAGG-3，(SEQ ID NO. 2)。利用PCR技術(shù)從水稻頂36總cDNA中擴(kuò)增得到0sAP21基因全長(zhǎng)cDNA。經(jīng)測(cè)序?yàn)檎_，0sAP21的全長(zhǎng)cDNA為687bp (SEQ ID NO :7)，編碼一個(gè)由2 個(gè)氨基酸組成的蛋白 (SEQ ID NO :8)。本發(fā)明根據(jù)0sAP21基因的cDNA序列設(shè)計(jì)如下檢測(cè)引物 0sAP21Fl :5，- CCCTCCTCCTCCACCTCCACC-3，(SEQ ID NO. 3) 0sAP21Zl :5，-GCGCATCGTACGCCGTCCAGC -3，(SEQ ID NO. 4)。檢測(cè)水稻經(jīng)過(guò)ABA、PEG、NaCl和冷處理后體內(nèi)0sAP21基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明 0sAP21受ABA、PEG、NaCl和冷誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明將含0sAP21的質(zhì)粒經(jīng)漢a HI + Sac I雙酶切后，利用DNA回收試劑盒回收 687bp左右的DNA片段，將此片段與相應(yīng)酶切的pCAMBIA-1304載體相連構(gòu)建成一個(gè)新的載體，命名為YG8473。為了更好的表達(dá)外源基因，在YG8473載體的多克隆位點(diǎn)處兩側(cè)插入了煙草的染色質(zhì)附著SAR序列，這有利于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳及表達(dá)；外源基因的表達(dá)單元內(nèi)， 在目的基因的兩側(cè)導(dǎo)入了和feci酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入，外源基因的表達(dá)由雙 CAMV 35S 啟動(dòng)子 + TMV Omega leader sequence 控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制場(chǎng)^ 抗性基因的表達(dá)，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記基因。本發(fā)明利用電擊法將構(gòu)建好的雙元載體YG8473導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105。通過(guò)農(nóng)桿菌蘸花法將flsA^V基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，然后驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA、NaCl敏感性的提高，對(duì)高鹽、干旱和低溫的耐受性提高。本發(fā)明的0sAP21基因是能夠調(diào)控植物耐旱、耐冷和耐高鹽的轉(zhuǎn)錄因子基因；且該抗逆基因來(lái)自植物本身，對(duì)環(huán)境影響較小。本發(fā)明通過(guò)對(duì)0sAP21基因轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行該基因的功能研究，獲得效果如下
1 .獲得了對(duì)干旱、高鹽、冷逆境有高耐性的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株；2.基因具有抗
干旱、高鹽、低溫等逆境的功能，為利用該基因在其他植物上的應(yīng)用而提高抗逆性提供了理論依據(jù)及利用價(jià)值。


圖1 :0sAP21在ABA、PEG、NaCl和Cold條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式。圖2 雙元載體YG8473的構(gòu)建示意圖。圖3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的PCR鑒定。圖4 ,0sAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA敏感性的提高。圖5 ,0sAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)NaCl敏感性的提高。
4
圖6 :OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物對(duì)干旱的耐受性。圖7 ,OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物對(duì)高鹽的耐受性。圖8 ,OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物對(duì)低溫的耐受性。圖9 OsAP21的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :0sAP21在ABA、PEG、NaCl及冷條件下的表達(dá)模式分析。1. RNA 的抽提
水培2周的IR36水稻苗分別用ΙΟΟμΜ的ABA溶液、15%的PEG溶液和250mM NaCl溶液和4°C 士 1光照培養(yǎng)處理不同時(shí)間(1、2、4、8、12和Mh)后取樣，分別提取植株總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA以備后用。具體操作為
1) RNA的抽提按照上海華舜生物公司的RNA抽提試劑盒進(jìn)行。2) RNA中基因組DNA的去除參照DNase I (RNase Free)說(shuō)明書(shū)； ①在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，總量50 μ L :
全 RNA20-50 μ g
IOXDNase I Buffer5 μ
DNase I (RNase-free, 5U/ μ L)2μ L
RNase Inhibitor (40 U/μ L)0. 5 μ L
DEPC 處理水up to 50 μ L0
② 37°C 反應(yīng) 20_30min。③加入50 μ L的DEPC處理水。④加入IOOyL(等量)的苯酚/氯仿/異戊醇05:對(duì)1)，充分混勻。⑤離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中。⑥加入IOOyL(等量)的氯仿/異戊醇04:1)，充分混勻。⑦離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中。⑧加入1/10 量的 3Μ NaAC (ρΗ5· 2)。⑨加入2. 5倍量預(yù)冷的無(wú)水乙醇，_20°C (_70°C)放置30-60min。⑩離心回收沉淀，用70%的冷無(wú)水乙醇清洗沉淀，真空干燥。用適量的DEPC水處理水溶解后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)是否除去基因組DNA。3) RNA含量和質(zhì)量的分析
將抽提好的RNA稀釋50倍，分光光度計(jì)測(cè)定。質(zhì)量好的RNA其0D26(1/0D28(1比值在 1. 8-2. 0之間，按照RNA含量將其調(diào)整為同一濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。2、反轉(zhuǎn)錄為cDNA
反轉(zhuǎn)錄方法參照Τ0Υ0Β0反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，總量20 μ L0 10XRT Buffer4μ L
dNTP mix(2. 5mM each)2μ L
01igdT2IMl
RNase Inhibitor (40 U/μ L)0. 5 μ L
5RNA
χ μ L
Rnase free H2O
11-χ μ L
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件:42°C，Ih ；850C，5min ；4°C，5min。3、RT-PCR 檢測(cè)
以水稻組織在各個(gè)脅迫處理下的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，通過(guò)調(diào)整模板量和模板濃度，將內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增量調(diào)為一致，再按相同條件擴(kuò)增基因，可方便地鑒定出水稻在各種不同處理下以及各個(gè)組織中OsAP21基因的表達(dá)量，得出水稻轉(zhuǎn)錄因 =f OsAP21基因在激素和逆境處理下的表達(dá)模式(圖1)。根據(jù)水稻內(nèi)標(biāo)基因actin (登錄號(hào)X16^0)設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)引物如下 RaclZl: 5，-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3，(SEQ ID NO. 5) RaclFl 5，-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3，(SEQ ID NO. 6)
用該引物進(jìn)行擴(kuò)增，可擴(kuò)增出269bp的條帶。PCR反應(yīng)體系 試劑
IOXreaction buffer dNTP mix(2. 5mM each) 模板cDNA
RaclZl(0. μδ/μ1) RaclFl(0. μδ/μ1) Taq plus (5υ/μ1) ddH20 總體積
用量
2μ1
μ μ 0. 2μ1 0. 2μ1 0. 2μ1 15. 4μ1 20 μ 。
終濃度
IX 0.125mM 2. 5ngM 1 ng/μ 1 ng/μ 0. 05 U/μΙPCR 反應(yīng)程序預(yù)變性 94°C，5 min ;94°C，20s ;56°C，20s ;72°C 20s ;72°C，5min,
26 cycles。0sAP21目的基因的檢測(cè)引物如下(擴(kuò)增片段 0sAP21Fl :5，- CCCTCCTCCTCCACCTCCACC-3，(SEQ ID NO. 3) 0sAP21Zl :5，-GCGCATCGTACGCCGTCCAGC -3，(SEQ ID NO. 4)。PCR反應(yīng)體系 試劑
2XGC buffer dNTP mix(2. 5mM ) 模板cDNA 0sAP21Fl 0sAP21Zl La-Taq(5υ/μ1) ddH20 總體積PCR反應(yīng)程序
IOmin, 35 cycles。
用量 10μ1 μ μ 0. 2μ1 0. 2μ1
0. 2μ1 7. 4μ1 20 μ 。 預(yù)變性94 °C, 10
終濃度 IX 0.125mM 2. 5ng/ μ 1 1 ng/ μ 1 1 ng/ μ 1 0. 05 U/μΙ
min ；94 "C，30s ；68 "C，30s ；72 "C 40s ；72 "C，
實(shí)施例2 水稻OsAP21基因的獲得
水稻頂36水培2周后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA (與實(shí)施例1同)。以上述cDNA 為模板，經(jīng) R6995 5，-GGATCCATGGCTGCCAGCGAGGAAAGCTC-3，(SEQ ID NO. 1)和 R6996 5，- GAGCTCTAGTACTCC CAGAGGAGAGG-3，(SEQ ID NO. 2)為引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:
試劑用量終濃度2XGC buffer10μ1dNTP mix(2. 5mM ) μ 0模板DNA μ 2. 5ng/μ 1R191050. 2μ11 ng/,μ 1R191060. 2μ11 ng/,μ 1La-Taq(5υ/μ1)0.2μ10.05ddH207. 4μ1總體積20 μ 。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C，10 min ；94 °C, 30s ；54 °C, 30s ；72 °C Imin ；72 °C, IOmin, 35 cycles。PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ 直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過(guò)夜，高效轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)中，獲得陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)上海桑尼公司測(cè)序比對(duì)，所得序列為水稻0sAP21基因。實(shí)施例3 農(nóng)桿菌雙元載體YG8473的構(gòu)建
將含0sAP21基因的T/A克隆載體質(zhì)粒經(jīng)漢3 HI + Sacl雙酶切后，利用DNA回收試劑盒回收687bp左右的DNA片段，將此片段與相應(yīng)酶切的pCAMBIA-1304載體(AF234300. 1) (購(gòu)買(mǎi)于上海皓嘉生物科技有限公司)相連，獲得的載體命名為YG8473。為了更好的表達(dá)外源基因，可在YG8473載體的多克隆位點(diǎn)處兩側(cè)插入煙草的染色質(zhì)附著SAR序列，這有利于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳及表達(dá)；外源基因的表達(dá)單元內(nèi)，在目的基因的兩側(cè)導(dǎo)入了和feci酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入，外源基因的表達(dá)由雙CAMV 35S 啟云力子 + TMV Omega leader sequence 控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence 控制//J^ 抗性基因的表達(dá)，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記基因(圖2)。實(shí)施例4 電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
1)制備農(nóng)桿菌EHA105(中國(guó)大連Takara公司購(gòu)買(mǎi))感受態(tài)，方法參照 MicroPulser Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司)；
2)取70μ L ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞，加入16μ L YG8473質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)入0. Icm的電擊杯中轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)(200 Ω，1. 7KV，25 μ f)。電擊后立即加入800 μ L修復(fù)液混勻，轉(zhuǎn)入1. 5mL 離心管中；
3)培養(yǎng)Ih后，涂LB平板(利福平50 μ g/ml，慶大霉素50 μ g/ml，氯霉素100 μ g/
ml)；
4)挑取幾個(gè)克隆，堿法抽提農(nóng)桿菌質(zhì)粒，酶切鑒定，PCR檢測(cè)。實(shí)施例5 農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備及轉(zhuǎn)化擬南芥農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備
71)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mLLB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培養(yǎng) 20 小時(shí)(Rashid et al.，1996)；
2)取ImL菌液轉(zhuǎn)接入20- 30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm培養(yǎng)約12小時(shí)，使菌液0D600 ^ 1. 5 ；
3)4°C，8000rpm離心lOmin，收集菌體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5%蔗糖，0.05% Silwet L-77)將菌體懸起并稀釋至OD6tltl 0. 8。蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥
1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中輕輕搖動(dòng)約IOs后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮膜將擬南芥罩住，以保持濕潤(rùn)的環(huán)境，托盤(pán)中加入PNS營(yíng)養(yǎng)液，置于22°C培養(yǎng)室低光強(qiáng)度下生長(zhǎng)M小時(shí)，即可正常培養(yǎng)。2)初次轉(zhuǎn)化四天后，再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以在花發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。3)生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集擬南芥Ttl植株上所結(jié)T1種子，利用50 Pg/mL潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化種子的篩選。陽(yáng)性種子的篩選
1)稱25 — 30mg種子放入1. 5ml離心管。2) Iml 75%乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5s，去上清。3)加入Iml過(guò)濾后的漂白粉(5%)消毒15 min (不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000 轉(zhuǎn)/分鐘離心&，去上清。4 )無(wú)菌水洗滌3 — 4次。5)將種子均勻的播撒到1/2 MS平板(5(^g/mL潮霉素)上，Parafilm膜封口，4 V 冰箱放置兩天，220C，16h光照培養(yǎng)6天。6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行⑶S檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(T1)培養(yǎng)至開(kāi)花結(jié)實(shí)，收集T1植株上所結(jié)T2種子。按陽(yáng)性種子的篩選方法繼續(xù)進(jìn)行直至獲得純系。實(shí)施例6 -.OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆分析
將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交3代，獲得4個(gè)純合轉(zhuǎn)化株系(圖幻，收取種子。選取Pl和P2株系做進(jìn)一步分析，主要有以下幾個(gè)方面。1)植株對(duì)ABA的敏感性研究。將野生型和轉(zhuǎn)基因株系PI、P2的種子同時(shí)鋪在含有0、1. 0,2. ΟμΜ ABA的板上，22°C，1 光照培養(yǎng)2周后，觀察轉(zhuǎn)基因和野生型生長(zhǎng)差異(圖 4A)。另外，ABA對(duì)擬南芥根生長(zhǎng)的影響也做了更進(jìn)一步的分析。將萌發(fā)后生長(zhǎng)較一致的苗子移到分別含有0、1. 0,2.0,6. ΟμΜ ABA的MS培養(yǎng)基上，垂直放置于22°C，IMi光照條件下， 一周后觀察并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的根長(zhǎng)情況(圖4B、C)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因種子比野生型種子對(duì)ABA更敏感。在不含ABA的MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因株系P1、P2的平均根長(zhǎng)分別為1. 92、1. 88、1. 87cm沒(méi)有顯著差異；但是當(dāng)ABA的濃度為1. ΟμΜ時(shí)，WT的平均根長(zhǎng)為1. 68cm, PU Ρ2分別為0. 57,0. 66cm ；ABA濃度為2. ΟμΜ時(shí)，WT、P1、P2的根長(zhǎng)分別為 1. 67,0. 42,0. 55 cm ；ABA 濃度為 6. ΟμΜ 時(shí)，WT、PU Ρ2 的根長(zhǎng)分別為 1. 35,0. 32,0. 39 cm。 這表明ABA的存在影響了根的生長(zhǎng)，但是相對(duì)于野生型而言轉(zhuǎn)基因株系明顯表現(xiàn)出對(duì)ABA的敏感性。2)植株對(duì)NaCl的敏感性研究。將野生型和轉(zhuǎn)基因株系P1、P2的種子同時(shí)鋪在含有0、80、IOOmM NaCl的板上，22°C，IMi光照培養(yǎng)1周后，觀察轉(zhuǎn)基因和野生型生長(zhǎng)差異并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率(圖5)。在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因株系P1、P2的萌發(fā)沒(méi)有差異；當(dāng)NaCl的濃度為80mM時(shí)，WT的萌發(fā)率為93%，PI、P2分別為31%、58% ；當(dāng)NaCl的濃度為IOOmM時(shí)，WT的萌發(fā)率為86%，P1、P2分別為6%、28%。這表明NaCl的存在影響了擬南芥種子的萌發(fā)，且相對(duì)于野生型而言轉(zhuǎn)基因株系明顯表現(xiàn)出對(duì)NaCl的敏感性。3)植株抗干旱研究。取22°C，16小時(shí)光照培養(yǎng)約四周且生長(zhǎng)比較一致的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)I、P2與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株WT各兩缽(要保證培養(yǎng)土中的含水量比較低)分成兩組， 一組正常條件下培養(yǎng)，一組直接將整缽浸泡于15% PEG溶液中進(jìn)行模擬干旱處理，實(shí)時(shí)觀測(cè)各株系的表型(圖6)。結(jié)果表明，的轉(zhuǎn)基因株系P1、P2的存活率分別為85%和75%， 而野生型的存活率只有40%，大多數(shù)的植株葉片干枯死亡。這些結(jié)果表明OsAP21基因的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株對(duì)干旱的耐受力。4)植株耐高鹽研究。將22°C，IMi光照培養(yǎng)三周，且生長(zhǎng)比較一致的野生型和 OsAP21轉(zhuǎn)基因株系的植株用于高鹽耐受實(shí)驗(yàn)(圖7)。待培養(yǎng)土中的含水量比較少時(shí)，直接將培養(yǎng)缽浸于250mM NaCl溶液中，實(shí)時(shí)觀察各植株的表型變化。野生型植株在經(jīng)高鹽處理后所有的植株都出現(xiàn)很明顯的萎蔫，而OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥株系Pl和P2幾乎沒(méi)有萎蔫的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明OsAP21基因的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株的對(duì)高鹽的耐受力。5)植株耐冷研究。將MS平板上的野生型和OsAP21轉(zhuǎn)基因擬南芥株植株22°C，16 小時(shí)光照培養(yǎng)約兩周后，用于低溫耐受實(shí)驗(yàn)。MS平板置于4°C冰箱低溫馴化48h，-20°C放置約30min，然后置于22°C，16小時(shí)光照下正常培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀測(cè)各株系的表型(圖8)。野生型植株死亡率高于轉(zhuǎn)基因株系，表明轉(zhuǎn)基因植株在恢復(fù)過(guò)程中比野生型植株具有良好的耐冷性。6) OsAP21的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量
脯氨酸是植物體內(nèi)主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。在逆境條件下(干旱、鹽堿、冷)，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，因此植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反應(yīng)了植物的抗逆性大小。本發(fā)明檢測(cè)了野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在高鹽和干旱處理前后的脯氨酸含量(圖9)。在常溫條件下，脯氨酸含量很低的，野生型的脯氨酸含量為0.5890 ymol/ g，而的轉(zhuǎn)基因株系中脯氨酸含量分別為0. 3179和0. 9157 μ mol/ g。經(jīng)過(guò)高鹽脅迫后，脯氨酸含量大大的增加了，野生型的含量為1.5373 ymol/g，而轉(zhuǎn)基因株系中的最大值為2.6擬6 μ mol/ go經(jīng)過(guò)干旱脅迫后，野生型的脯氨酸含量為0.9507 4!1101/^，而《^/^7的轉(zhuǎn)基因株系中脯氨酸含量分別為1. 6439和2. 3871 μ mol/g。轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)高鹽和干旱脅迫后的脯氨酸含量顯著的高于野生型植株的脯氨酸含量。
權(quán)利要求
1.水稻基因用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的抗旱、耐鹽和耐冷能力。
2.一種提高植物抗旱、耐鹽和耐冷能力的方法，是用水稻feA^V基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物， 獲得轉(zhuǎn)基因植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高植物抗旱、耐鹽和耐冷能力的方法，其特征在于包括下述步驟(1)提取水稻RNA，(2)PCR獲得水稻OsAP21基因片段，(3)將水稻OsAP21基因片段構(gòu)建到pCAMBIA-1304中獲得農(nóng)桿菌雙元載體命名為 YG8473(4)利用電擊法質(zhì)粒YG8473轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，(5)帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌采用蘸花法轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，(6)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高植物抗、耐鹽和耐冷能力的方法，其特征在于所述的目標(biāo)植物是擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子OsAP21基因的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子OsAP21基因序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從水稻IR36總cDNA中擴(kuò)增得到OsAP21基因。利用農(nóng)桿菌蘸花法將OsAP21基因轉(zhuǎn)化擬南芥，研究OsAP21基因在擬南芥體內(nèi)的抗逆功能和提高植物抗逆特性中的應(yīng)用。公開(kāi)了所述的水稻OsAP21基因能用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的抗旱、耐鹽和耐冷能力。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102226188SQ201110149590
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月4日
發(fā)明者劉知曉, 朱雪, 熊愛(ài)生, 許冉冉, 金曉芬, 陳建民, 高勇, 黎華 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)