專利名稱：一種獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以月季‘薩曼莎’體細(xì)胞胚為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行月季遺傳轉(zhuǎn)化并獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法。
背景技術(shù)：
月季(Rosa hybrida)屬于薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)多年生常綠木本植物。月季栽培歷史悠久，被世界各國廣泛種植，是非常重要的觀賞花卉且具有重要的商業(yè)價值，但是由于月季花的瓶插壽命比較短，易患白粉病、黑斑病，這些都影響了它的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。在這些性狀改良上，傳統(tǒng)育種方法存在著很大的局限性。植物基因工程技術(shù)在保持品種的其他性狀相對穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，能夠利用外源基因?qū)ζ渌刂频男誀钸M(jìn)行定向改良，從而為培育月季新品種提供了新的途徑。對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件是具有一個可靠而有效的再生系統(tǒng)。目前月季的再生體系還不過完善，大多數(shù)的再生率不高且明顯受到基因型的限制，所以有關(guān)月季遺傳轉(zhuǎn)化成功的報道非常有限。第一篇關(guān)于月季遺傳轉(zhuǎn)化的報道是Firoozabady et al. (1991) 以R. hybrida cv. Royalty的胚性愈傷組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)化植株。隨后，Van der Salm et al. (1997)利用 R. hybridacv. Moneyway 的節(jié)間組織和農(nóng)桿菌在誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化了的不定根，在誘導(dǎo)不定根的分化產(chǎn)生胚狀體，從而得到再生的轉(zhuǎn)化植株。隨后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行月季遺傳轉(zhuǎn)化的研究成為了熱點，且有多篇成功報道(Li et al.，2002b ;2003)。Marchant etal. (1998a)采用基因槍法，以胚性愈傷組織為轟擊對象，成功地將水稻的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入到了 R. hybrida cv. Glad Tidings 中，從而使該品種的黑斑病發(fā)生頻率降低了 13%-43%。月季遺傳轉(zhuǎn)化也有利用PEG介導(dǎo)法的成功報道，其中原生質(zhì)體分離所用的復(fù)合物、植物基因型和實驗材料的來源、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件和外源DNA等因素都對其轉(zhuǎn)化的結(jié)果產(chǎn)生重要的影響(Schum and Hofmann, 2001)。Gao etal. (2004)，在對月季品種‘薩曼莎’進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化時，以葉片作為轉(zhuǎn)化受體沒有檢測到GUS基因的瞬間表達(dá)；用愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體時雖然得到了含有報告基因和目的基因的愈傷，但是最終沒有得到轉(zhuǎn)化的植株。李敬蕊(2006)在對月季品種‘薩曼莎’進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時，用葉片作為轉(zhuǎn)化受體得到了抗性芽，但仍然未得到轉(zhuǎn)化植株。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的專利申請“以葉片為外植體的月季再生植株的方法”(201010256892. 3)，提出以月季未成熟葉片為外植體，通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，建立月季再生體系的方法，但其不具有遺化轉(zhuǎn)化步驟，無法實現(xiàn)品種改良。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的成功報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種以月季‘薩曼莎’未成熟葉片為外植體，以體細(xì)胞胚為轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，具有方法簡單、培養(yǎng)周期短的優(yōu)點本發(fā)明獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，以月季‘薩曼莎’未成熟葉片誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，按下述步驟進(jìn)行處理(1)體胞胚誘導(dǎo)以月季未成熟葉片為外植體，將所述的外植體在體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚；(2)轉(zhuǎn)化受體的繼代增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚繼代增殖培養(yǎng)基中，為遺傳轉(zhuǎn)化提供轉(zhuǎn)化受體材料；(3)遺傳轉(zhuǎn)化將經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)的體細(xì)胞胚作為轉(zhuǎn)化受體材料轉(zhuǎn)入制備好的農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染，所述侵染時間為40-45min ；(4)然后將侵染后的體細(xì)胞胚進(jìn)行共培養(yǎng)，選擇增殖培養(yǎng)、選擇萌發(fā)培養(yǎng)、選擇成苗培養(yǎng)并最終得到月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株。所述步驟(1)中的體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括:MS基本培養(yǎng)基、2，4_D 3. 0-4. Omg/L、葡萄糖 30. Og/L、GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L、pH 6. 0。所述步驟⑵中體細(xì)胞胚繼代增殖培養(yǎng)基成分包括:MS基本培養(yǎng)基、2，4_D 1. 0mg/L、6-BA 0. 01-0. 05mg/L、葡萄糖 45. 0-60. Og/L、GEL 2. 5mg/L,加蒸餾水至 1L, pH 6. 0，每4周更新一次培養(yǎng)基，并用在更新的繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 2周的體細(xì)胞胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體所述步驟(3)中浸染時間為40min。所述步驟(4)中，為將侵染后的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在24士2°C黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇增殖培養(yǎng)8周，每兩周更新一次培養(yǎng)基，篩選得到抗性體細(xì)胞胚；所述選擇萌發(fā)培養(yǎng)為將篩選得到的抗性體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞選擇萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周，每兩周更新一次培養(yǎng)基，篩選得到抗性芽； 所述選擇成苗培養(yǎng)為將篩選得到的抗性芽接種到選擇成苗培養(yǎng)基中，每四周更新一次培養(yǎng)基，最終獲得月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株。所述步驟(4)中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，2，4_D 1. Omg/L, 6-BA 0. 01mg/L, ASlOO μ mol/L,葡萄糖 45. Og/L, GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L，pH 6. 0 ；所述體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，2，4-D 1. 0mg/L, 6-BA 0. 01mg/L, Km80-100mg/L, Cef300mg/L，葡萄糖 45. Og/L, GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L，pH 6. 0 ；所述體細(xì)胞選擇萌發(fā)培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，BAl. 0mg/L, NAA 0. lmg/L, GA3O. 5mg/L, Km50-75mg/L, Cef300mg/L，葡萄糖 30. Og/L, GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L，pH 6. 0 ；所述選擇成苗培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，BAl. 0mg/L, NAA 0. lmg/L, GA3O. 5mg/L, Km0-30mg/ L，Cef300mg/L，葡萄糖 30. Og/L, GEL2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L，pH 6. 0。所述的Km是卡那霉素(Kanamycin)用無菌蒸餾水配制成100mg/L的母液，Cef是頭孢霉素(Cefotaxime)用無菌蒸餾水配制成200mg/L的母液，AS是乙酰丁香酮稱取一定量的AS，用95 %的酒精溶解，最后用無菌蒸餾水定容，配制成10 μ mol/ml的母液，以上三種生化試劑均采用0. 45 μ m濾膜過濾滅菌，于-20°C保存；所述的MS是基本培養(yǎng)基，2，4-D是2，4- 二氯苯氧乙酸，BA是6_芐基腺嘌呤，NAA 萘乙酸，GA3是赤霉素，Glucose是葡萄糖，GEL是植物凝膠。為了便于對本發(fā)明的理解，申請人對上述各個步驟中所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中所用到的植物激素做了如下定義培養(yǎng)基包括體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚繼代增殖培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基、選擇萌發(fā)培養(yǎng)基、選擇成苗培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用基本培養(yǎng)基來源如下MS基本培養(yǎng)基(Murashige T. and F. Skoog. Physiol. Plant, 1962，15 473-497)。由于是以經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)的體細(xì)胞胚作為轉(zhuǎn)化受體材料，其遺傳轉(zhuǎn)化控制條件與現(xiàn)有胚性愈傷組織為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化也不盡相同，研究表明針對月季的‘薩曼莎’ 品種，侵染條件與能否獲得抗性體細(xì)胞胚有著極其重要的關(guān)系，必須嚴(yán)格控制侵染時間在 40-45min,優(yōu)選40min.侵染時間過短，農(nóng)桿菌尚未吸附到受體材料的傷口或組織表面，不利于農(nóng)桿菌的生長從而降低遺傳轉(zhuǎn)化效率；侵染時間過長，農(nóng)桿菌對受體材料產(chǎn)生毒害作用從而使受體材料褐化甚至死亡。農(nóng)桿菌的菌液濃度參照現(xiàn)有菌液濃度，優(yōu)選菌液濃度為 OD值0. 6-0. 8，合適和侵染時間和菌液濃度可以有效提高轉(zhuǎn)化效果；進(jìn)一步的，申請人經(jīng)過多年研究、反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，步驟(4)中的選擇增殖培養(yǎng)、選擇萌發(fā)培養(yǎng)、選擇成苗培養(yǎng)過程中相應(yīng)培養(yǎng)基中卡那霉素含量的控制對提高轉(zhuǎn)化效果也具有重要影響，因此，體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基中卡那霉素(Km)含量為80-100mg/L，優(yōu)選100mg/L，選擇萌發(fā)培養(yǎng)基中卡那霉素(Km)含量為50-75mg/L，優(yōu)選50mg/L，選擇成苗培養(yǎng)基卡那霉素(Km)含量為0_30mg/ L，優(yōu)選 30mg/L。本發(fā)明利用經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)的體細(xì)胞胚作為轉(zhuǎn)化受體材料，侵染后可直接進(jìn)行選擇增殖培養(yǎng)，減少了工藝步驟，較現(xiàn)有的以胚性愈傷組織為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植株方法的培養(yǎng)周期相比，可減少4-8周時間，從而縮短了培養(yǎng)周期，并成功獲得了月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株。有益效果1、通過本發(fā)明方法成功實現(xiàn)以月季‘薩曼莎’體細(xì)胞胚為轉(zhuǎn)化受體材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)及后期進(jìn)一步培養(yǎng)獲得了含有GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因植株，為目的基因的轉(zhuǎn)化打下了良好的基礎(chǔ)。2、工藝簡單、培養(yǎng)周期較短。3、本發(fā)明所采用的外植體來源不受季節(jié)限制，可以周年進(jìn)行月季‘薩曼莎’的組織和細(xì)胞培養(yǎng)。4、離體培養(yǎng)下的月季‘薩曼莎’體細(xì)胞胚還可通過次生胚不斷增殖，具有良好的增殖效果。


圖1 :本發(fā)明中月季‘薩曼莎’體細(xì)胞胚為受體的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)路線圖。圖2 本發(fā)明中月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS活性檢測，a為陰性對照， b，c為轉(zhuǎn)基因植株的葉片，圖3 :d為轉(zhuǎn)基因植株的葉片放大圖。
具體實施例方式試驗材料選擇、培養(yǎng)基設(shè)計與接種培養(yǎng)1、試驗材料來源及其處理
月季‘薩曼莎’未成熟葉片誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚接種于體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖繼代培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周的體細(xì)胞胚為受體材料；菌株和質(zhì)粒所用根癌農(nóng)桿菌為C58菌株，含有pCAMBIA2301質(zhì)粒，該質(zhì)粒于35S 組成型表達(dá)啟動子后攜帶GUS報告基因，并融合Km抗性篩選基因。2、培養(yǎng)基設(shè)計表1列出了本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分及其用量。表1月季的離體培養(yǎng)基設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于以月季‘薩曼莎’未成熟葉片誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，按下述步驟進(jìn)行處理(1)體胞胚誘導(dǎo)以月季未成熟葉片為外植體，將所述的外植體在體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚；(2)轉(zhuǎn)化受體的繼代增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚繼代增殖培養(yǎng)基中，為遺傳轉(zhuǎn)化提供轉(zhuǎn)化受體材料；(3)遺傳轉(zhuǎn)化將經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)的體細(xì)胞胚作為轉(zhuǎn)化受體材料轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌制備的菌液中進(jìn)行侵染，所述侵染時間為40-45min ；(4)然后將侵染后的體細(xì)胞胚進(jìn)行共培養(yǎng)，選擇增殖培養(yǎng)、選擇萌發(fā)培養(yǎng)、選擇成苗培養(yǎng)并最終得到月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株。
2.如權(quán)利要求1所述的獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于所述步驟 (1)中的體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括MS基本培養(yǎng)基、2，4-D 3.0-4.0!^/1、葡萄糖30.(^/ L、GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 lL、pH 6.0。
3.如權(quán)利要求1所述的獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于所述步驟(2)中體細(xì)胞胚繼代增殖培養(yǎng)基成分包括MS基本培養(yǎng)基、2，4-D 1.0mg/L、6-BA 0. 01-0. 05mg/L、葡萄糖 45. 0-60. 0g/L、GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至 lL，pH 6. 0，每 4 周更新一次培養(yǎng)基，并用在更新的繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 2周的體細(xì)胞胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
4.如權(quán)利要求1所述的獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于所述步驟 (3)中浸染時間為40。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于所述步驟(4)中，先將侵染后的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在24士2°C黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇增殖培養(yǎng)8周，每兩周更新一次培養(yǎng)基，篩選得到抗性體細(xì)胞胚；所述選擇萌發(fā)培養(yǎng)為將篩選得到的抗性體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞選擇萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周，每兩周更新一次培養(yǎng)基，篩選得到抗性芽；然后將篩選得到的抗性芽接種到選擇成苗培養(yǎng)基中，每四周更新一次培養(yǎng)基，最終獲得月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株。
6.如權(quán)利要求5所述的獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于所述步驟(4)中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，2，4-D 1.0mg/L，6-BA 0. 01mg/L, ASlOO μ mol/L,葡萄糖45. Og/L, GEL 2. 5mg/L,加蒸餾水至1L，pH 6. 0 ；所述體細(xì)胞胚選擇增殖培養(yǎng)基成份包括MS基本培養(yǎng)基，2，4-D 1. 0mg/L,6-BA0. 01mg/L, Km80-100mg/L, Cef300mg/L,葡萄糖45. Og/L, GEL 2. 5mg/L,加蒸餾水至1L，pH 6. 0 ；所述體細(xì)胞選擇萌發(fā)培養(yǎng)基成份包括 MS 基本培養(yǎng)基，BAl. 0mg/L, NAA 0. lmg/L, GA3O. 5mg/L, Km50_75mg/L， Cef300mg/L，葡萄糖30. Og/L, GEL 2. 5mg/L，加蒸餾水至1L，pH 6. 0 ；所述選擇成苗培養(yǎng)基成份包括MS 基本培養(yǎng)基，BAl. 0mg/L, NAA 0. lmg/L, GA3O. 5mg/L, Km0_30mg/L，Cef300mg/ L，葡萄糖 30. Og/L, GEL2. 5mg/L，加蒸餾水至 1L，pH 6. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的方法，以月季‘薩曼莎’未成熟葉片誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，經(jīng)體胞胚誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化受體的繼代增殖培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)，選擇增殖培養(yǎng)、選擇萌發(fā)培養(yǎng)、選擇成苗培養(yǎng)并最終得到月季‘薩曼莎’的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明方法簡單，培養(yǎng)周期較短，成功實現(xiàn)月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的培育，填補(bǔ)了目前無法實現(xiàn)月季‘薩曼莎’轉(zhuǎn)基因植株的培育的空白。
文檔編號A01H5/00GK102220372SQ20111009981
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者劉國鋒, 包滿珠, 包穎, 寧國貴, 施雪萍, 邢文 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)