專利名稱：一種胰島凍存保護(hù)劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物 技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰島凍存保護(hù)劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
糖尿病嚴(yán)重影響人們的身體健康，糖尿病分為I型和II型兩種。I型糖尿病是胰島素依賴型，大約10%的糖尿病患者為I型糖尿病。約30%的II型糖尿病患者至中、晚期 (病程20年以上)也會(huì)發(fā)展成為胰島素依賴型。注射胰島素是目前控制糖尿病患者血糖的有效手段，但外源性胰島素不能達(dá)到生理性調(diào)節(jié)血糖的目的，因此不能制止糖尿病并發(fā)癥如腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜病變以及心血管病等的發(fā)生和發(fā)展，從而大大降低患者生活質(zhì)量，最終導(dǎo)致死亡。有研究發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞移植的患者比注射胰島素的患者糖尿病和視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率下降，出現(xiàn)時(shí)間延遲，尤其是在移植后的前6年差別更為顯著。這說明胰島細(xì)胞移植可以使糖尿病慢性并發(fā)癥延緩6年以上。這對(duì)于提高糖尿病患者的生活質(zhì)量非常重要。因此， 胰島細(xì)胞移植治療糖尿病如同腎移植治療終末期腎功能衰竭一樣，將成為糖尿病的最有效治療手段。2000年Edmonton治療方案的成功，推動(dòng)了世界成人胰島細(xì)胞移植治療1型糖尿病的迅速發(fā)展。在胰島細(xì)胞移植的實(shí)施過程中，最關(guān)鍵的就是獲得足夠量的胰島細(xì)胞。然而胰島細(xì)胞分離純化是一個(gè)復(fù)雜的、技術(shù)性強(qiáng)的過程，往往需要2個(gè)以上供體胰腺才夠滿足一個(gè)病人的使用。要同時(shí)滿足2個(gè)以上血型相符的供體才能進(jìn)行該移植，使得胰島細(xì)胞的保存顯得尤為重要，甚至影響到胰島細(xì)胞移植技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用及推廣。常規(guī)的細(xì)胞凍存保存劑為DMSO 10%+FBS 10-20%+細(xì)胞培養(yǎng)液(主要有 DMEM, PRIM1640等)，它主要是適用于單細(xì)胞懸液的凍存保護(hù)劑。但胰島細(xì)胞不同于普通的細(xì)胞，它是由β、α、Y、θ等細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖水平的作用。用常規(guī)單細(xì)胞懸液的凍存保護(hù)劑及其凍存方法并不能有效的保護(hù)胰島細(xì)胞團(tuán)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種用于有效地保存分離獲得的胰島細(xì)胞，避免其受冷凍損傷，以供臨床應(yīng)用的胰島凍存保護(hù)劑及其使用方法。本發(fā)明的胰島凍存保護(hù)劑，包括A液、B液、C液和D液，組成如下
A液為基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基，組成為Μ-199培養(yǎng)基50% 70%，AB血清30% 50%，IM Hepes 1 3%，烏司他丁 100 200IU/ml ；B液為2M DMSO凍存培養(yǎng)基，含DMS014. 2%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基85. 8% ；C液為3M DMSO凍存培養(yǎng)基，含DMSO 21. 3%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基78. 7% ；D液為異丙醇；上述百分比均表示體積百分比。所述的胰島凍存保護(hù)劑的使用方法，具體步驟如下
1)胰島細(xì)胞的準(zhǔn)備按常規(guī)方法分離胰島細(xì)胞；
2)將胰島細(xì)胞裝入離心管中，在280Xg的離心力下離心1分鐘；
3)吸棄上清液；4)在離心管內(nèi)加入l(T20ml的A液，在280Xg的離心力下離心1分鐘，吸棄上清，再加入A液l(Tl5ml重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞凍存袋；
5)在細(xì)胞凍存袋中加入B液5 10ml；
6)室溫下預(yù)孵育細(xì)胞;Γ5分鐘；
7)再次加入5 IOmlB液；
8)室溫下孵育5 10分鐘；
9)加入2(T30mlC液，室溫下孵育5 10分鐘；
10)將細(xì)胞凍存袋置于D液中，放入4°C冰箱5 15分鐘；
11)將細(xì)胞凍存袋移出4°C冰箱，連同D液一起放入-80°C超低溫冰箱中12 16小
時(shí)；
12)取出細(xì)胞凍存袋，將細(xì)胞凍存袋置入液氮中長期保存。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
1)在凍存保護(hù)劑中添加高濃度AB血清，替代胎牛血清，可用于臨床治療應(yīng)用，同時(shí)可以抑制消化胰島時(shí)殘留的消化酶作用。2)加入的烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑，可以抑制殘留的胰蛋白酶對(duì)胰島的降解作用。3)加入的!fepes是一種緩沖體系，可以提供一個(gè)穩(wěn)定的pH緩沖環(huán)境。4)本發(fā)明凍存保護(hù)劑的使用方法主要是通過用高濃度血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸胰島，然后逐步遞增式的加入不同濃度的DMSO凍存液，使DMSO滲透到胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)。并用異丙醇做凍存介質(zhì)，起到緩慢降溫的作用。


圖1為使用本發(fā)明的胰島凍存保護(hù)劑凍存的胰島復(fù)蘇Α0/ΡΙ活性染色，熒光顯微鏡下活性胰島發(fā)綠色熒光(白色箭頭所示)，紅色為凋亡胰島(黑色箭頭所示)。圖2為使用傳統(tǒng)單細(xì)胞凍存保護(hù)劑凍存的胰島復(fù)蘇Α0/ΡΙ活性染色，熒光顯微鏡下活性胰島發(fā)綠色熒光(白色箭頭所示)，紅色為凋亡胰島(黑色箭頭所示)。圖3為高糖刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素試驗(yàn)圖。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)例，進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實(shí)施例1 試劑來源
M-199培養(yǎng)基為商品化產(chǎn)品購自HYCL0NE ； AB血清來自血庫健康人血清；IM Hepes為商 品化產(chǎn)品，購自美國Mediatech Cellgro公司；烏司他丁為臨床所用藥品注射用烏司他丁 ；DMSO為臨床使用級(jí)商品，購自美國Sigma;異丙醇為分析純級(jí)化學(xué)商品，購自上?；瘜W(xué)試劑廠。試劑配制
本發(fā)明的胰島凍存保護(hù)劑，包括A液、B液、C液和D液，組成如下 A液基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基(500ml)最終濃度體積
M-199 培養(yǎng)基 -337. 5ml
AB 血清 30%150ml
H印es (IM) 25mM12.5ml
烏司他丁 200IU/ml10 萬 IU B 液2M DMSO 培養(yǎng)基(100ml)
最終濃度體積
DMSO 2M14. 2ml
A 液 -85.8ml C 液3M DMSO 培養(yǎng)基(100ml)
最終濃度體積 DMSO 3M 2 1. 3ml
A 液 -78. 7ml D液異丙醇(分析純)200ml
使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的胰島凍存保護(hù)劑的使用方法，具體操作步驟如下 1)胰島細(xì)胞的準(zhǔn)備按常規(guī)方法分離胰島細(xì)胞。2)將胰島細(xì)胞裝入離心管中，在280Xg的離心力下離心1分鐘。3)吸棄上清液。4)在離心管內(nèi)加入IOml的上述凍存A液，洗滌1次，在^OXg的離心力下離心 1分鐘，吸棄上清。再加入上述凍存A液12. 5ml重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移入細(xì)胞凍存袋。5)加入凍存 B 液 6. 25ml。6)室溫下預(yù)孵育細(xì)胞5分鐘。7)再次加入6. 25ml凍存B液。8)室溫下孵育10分鐘。9)加入25ml凍存C液，室溫下孵育10分鐘。10)將細(xì)胞凍存袋放入D液中，放入4°C冰箱10分鐘。11)放入_80°C超低溫冰箱中過夜。12)將細(xì)胞凍存袋置入液氮中長期保存。傳統(tǒng)細(xì)胞凍存操作步驟
1.將胰島細(xì)胞裝入離心管中，在^OXg的離心力下離心1分鐘。2.吸棄上清液。3.加入70%RPMI1640+20%FBS+10%DMS0配成的凍存保護(hù)劑。轉(zhuǎn)移入細(xì)胞凍存袋。4.放入-20°C 30 分鐘。5.放入-80°C超低溫冰箱過夜。6.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入液氮中長期保存。凍存胰島復(fù)蘇
迅速將液氮中的細(xì)胞凍存袋置入38°C水浴中，迅速復(fù)溫。280Xg的離心力下離心1 分鐘，吸棄上清，加A液，洗滌一次，280 X g的離心力下離心1分鐘去上清，加新鮮培養(yǎng)基(RPMI1066, 10%人白蛋白)重懸細(xì)胞，備用。胰島細(xì)胞活性的鑒定
取復(fù)蘇的胰島細(xì)胞懸液，采用吖啶橙(acridin orange, AO)與碘丙啶(propidium iodide, PI)熒光染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)紅綠染色的細(xì)胞數(shù)，活的胰島呈綠色熒光，凋亡的胰島呈紅色熒光，計(jì)算細(xì)胞的活性。經(jīng)AO-PI染色在熒光顯微鏡下用490 nm激發(fā)光濾光片， 510 nm光柵濾光片觀察，如圖1所示，可見使用本發(fā)明的凍存保護(hù)劑和凍存方法的復(fù)蘇胰島呈現(xiàn)較多綠色熒光，而用傳統(tǒng)凍存細(xì)胞的方法凍存的胰島，復(fù)蘇的結(jié)果大部分的胰島呈紅色熒光(圖幻。顯示經(jīng)過本發(fā)明的凍存保護(hù)劑凍存復(fù)蘇的胰島細(xì)胞可以保持70%的活率。胰島細(xì)胞功能鑒定
采用高糖刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素試驗(yàn)，取復(fù)蘇的胰島細(xì)胞懸液在1640無糖培養(yǎng)基中于37°C、C02濃度5 %環(huán)境下孵育M h，分別加入含有2. 8mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基和含有20 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基2 ml進(jìn)行培養(yǎng)各2 h，收集上清液，檢測(cè)胰島素含量。胰島素釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示傳統(tǒng)的凍存保護(hù)劑凍存的胰島細(xì)胞在低糖刺激釋放胰島素平均為 (99. 6 士 10. 9)IU/L，在20 mmol/L高糖刺激下釋放胰島素平均為(123. 1 士 14. 1) IU/L。而使用本發(fā)明的胰島細(xì)胞凍存保護(hù)劑及凍存方法凍存的胰島細(xì)胞在低糖低糖刺激釋放胰島素平均為(98. 9 士 15. 6) IU/L，在20 mmol/L高糖刺激下釋放胰島素平均為(292. 9 士 35. 6) IU/L。如圖3所示，使用本發(fā)明的凍存保護(hù)劑凍存復(fù)蘇的胰島細(xì)胞還具有良好的胰島素分泌功能。
權(quán)利要求
1.一種胰島凍存保護(hù)劑，其特征在于所述胰島凍存保護(hù)劑包括A液、B液、C液和D液， 組成如下A液為基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基，組成為M-199培養(yǎng)基50% 70%，AB血清30% 50%，IM Hepes 1 3%，烏司他丁 100 200IU/ml ；B液為2M DMSO凍存培養(yǎng)基，含DMS014. 2%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基85. 8% ；C液為3M DMSO凍存培養(yǎng)基，含DMSO 21. 3%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基78. 7% ；D液為異丙醇；上述百分比均表示體積百分比。
2.一種如權(quán)利要求1所述的胰島凍存保護(hù)劑的使用方法，其特征在于所述使用方法的具體步驟如下1)胰島細(xì)胞的準(zhǔn)備按常規(guī)方法分離胰島細(xì)胞；2)將胰島細(xì)胞裝入離心管中，在^OXg的離心力下離心1分鐘；3)吸棄上清液；4)在離心管內(nèi)加入10 20ml的A液，在^OXg的離心力下離心1分鐘，吸棄上清， 再加入A液10 15ml重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞凍存袋；5)在細(xì)胞凍存袋中加入B液5 IOml；6)室溫下預(yù)孵育細(xì)胞3 5分鐘；7)再次加入5 IOmlB液；8)室溫下孵育5 10分鐘；9)加入20 30ml C液，室溫下孵育5 10分鐘；10)將細(xì)胞凍存袋置于D液中，放入4°C冰箱5 15分鐘；11)將細(xì)胞凍存袋移出4°C冰箱，連同D液一起放入_80°C超低溫冰箱中12 16小時(shí)；12)取出細(xì)胞凍存袋，將細(xì)胞凍存袋置入液氮中長期保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胰島凍存保護(hù)劑及其使用方法。所述胰島凍存保護(hù)劑包括A液、B液、C液和D液，其中A液為基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基，組成為M-199培養(yǎng)基50%～70%,AB血清30%～50%，1MHepes1～3%，烏司他丁100～200IU/ml；B液為2MDMSO凍存培養(yǎng)基，含DMSO14.2%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基85.8%；C液為3MDMSO凍存培養(yǎng)基，含DMSO21.3%，基礎(chǔ)凍存培養(yǎng)基78.7%；D液為異丙醇；上述百分比均表示體積百分比。通過用高濃度血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸胰島，然后逐步遞增式的加入不同濃度的DMSO凍存液，使DMSO滲透到胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)。并用異丙醇做凍存介質(zhì)，起到緩慢降溫的作用。本發(fā)明提供的胰島凍存保護(hù)劑用于有效地保存分離獲得的胰島細(xì)胞，避免其受冷凍損傷，以供臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102197802SQ20111007267
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者王慶華, 譚建明, 陳津, 馬予潔, 黃梁滸 申請(qǐng)人:中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院