專利名稱：控制水稻不定根伸長和葉片顏色基因OsCHR4及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種圖位克隆技術(shù)克隆的水稻0sCHR4 (chromatin remodeling 4)基因的CDS序列，該CDS編碼的蛋白與人類皮肌炎自身抗原Mi-2同源，屬于CHD蛋白家族。轉(zhuǎn)基因功能恢復(fù)實驗結(jié)果確證該基因同時控制不定根伸長和地上部葉肉細(xì)胞中葉綠體的形成。
背景技術(shù)：
水稻屬于須根系單子葉植物，主根不發(fā)達(dá)，早期即停止生長或枯萎，后期生長發(fā)育所需要的水分和養(yǎng)分都是靠不斷生長的不定根吸收的。不定根(主要指禾本科作物)是胚后發(fā)生的器官，水稻節(jié)位產(chǎn)生的大量不定根組成了水稻地下部的主要部分。不定根的發(fā)育過程可以劃分為不定根原基的起始和不定根的伸長(Hochholdinger and Zimmermann, 2008)，每個階段發(fā)育受阻都會造成不定根生長發(fā)育異常。大多數(shù)雙子葉植物的葉片具有柵欄組織和海綿組織的分化，即具有背腹性，被稱為兩面葉。而禾本科植物的葉肉組織是單一形態(tài)的，沒有背腹性，這種葉被稱為等面葉。近年來植物葉片發(fā)育極性方面的研究取得了很大進(jìn)展，但是主要集中在雙子葉模式植物擬南芥的相關(guān)突變體展開的(Xu et al.，2003)，而以水稻為模式植物的禾本科植物的葉肉細(xì)胞極性發(fā)育機(jī)制的研究還很少，水稻葉色突變體的研究為探索單子葉植物的葉綠體發(fā)育機(jī)制和葉肉細(xì)胞的極性發(fā)育奠定了良好基礎(chǔ)?！叭旧|(zhì)重塑”普遍地被用來描述蛋白質(zhì)-DNA之間相互作用和結(jié)構(gòu)的改變，基因轉(zhuǎn)錄也正是通過改變DNA的包裝結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)調(diào)控元件與DNA的可接近性而被調(diào)節(jié)。Mi-2最早是從皮肌炎患者血清中分離得到的一種自身抗原，體現(xiàn)了皮肌炎患者的一種自身免疫現(xiàn)象 (Seelig et al.，1995)。Mi_2屬于高度保守的CHD(Qiromodomain helicase DNA-binding) 蛋白亞家族，該家族含有兩個PHD鋅指基序；兩個chromo結(jié)構(gòu)域，是染色質(zhì)識別修飾的結(jié)構(gòu)域；一個隸屬于SWI2/SNF2家族的ATPase/helicase功能域和一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Geelig et al. , 1995 ；Woodage et al.，1997)，該家族蛋白是一個ATP依賴的染色質(zhì)調(diào)控因子，介導(dǎo)蛋白質(zhì)與DNA或者蛋白與蛋白之間的相互作用(Brehm et al.，2004)。該家族蛋白在生物進(jìn)化過程中是非常保守的，Mi-2-like蛋白已經(jīng)在脊椎動物、果蠅、線蟲、酵母和擬南芥中報道了(Delmas et al.，1993 ；Woodge et al.，1997 ；Kehle et al.，1998 ；Eshed et al.， 1999 ；Zelewsky et al.，2000)。另外，Mi_2蛋白是ATP依賴的核小體重塑和組蛋白去乙酉先基化復(fù)合體 NuRD (ATP-dependent Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex)的一個核心成分，該復(fù)合體與組蛋白的去乙?；约盎蜣D(zhuǎn)錄沉默之間可能有聯(lián)系(Wade et al.，1999)。關(guān)于水稻Mi_21ike基因還未見報道，該基因突變產(chǎn)生的水稻突變體表型和控制植株發(fā)育的機(jī)制也是未知的。參考文獻(xiàn)如下1、Brehm, A.，Tufteland, K. 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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種同時控制水稻不定根伸長和葉綠體形成的新基因0sCHR4，如SEQ ID NO 1所示的⑶S序列，也包括與SEQ ID NO 1所示的⑶S序列至少有80%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ IDNO :2所示的蛋白質(zhì)屬于CHD家族，包括其中進(jìn)行一個或幾個氨基酸替換、插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID NO 1中取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種控制水稻不定根伸長和葉片顏色基因 0sCHR4編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其具有SEQ ID NO :2 (即序列表中的序列2)所示的氨
基酸序列。作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的改進(jìn)氨基酸序列還包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。本發(fā)明還同時提供編碼上述蛋白質(zhì)的基因，其具有SEQ ID NO :1(即序列表中的序列1)所示的核苷酸序列。作為本發(fā)明的基因的改進(jìn)核苷酸序列還包括在SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。本發(fā)明還同時提供了上述基因的用途用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明還同時提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，為包含本發(fā)明所述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用0sCHR4基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列片段的載體。本發(fā)明的具體實施內(nèi)容如下
從本實驗室發(fā)展的EMS(ethyl methylsulfonate)誘變的粳稻(Oryza Sativa L. ssp japonica)地方品種SSBM突變體庫中篩選到一個水稻不定根伸長受抑和葉片上表面白化的突變體0schr4(命名參照克隆到的突變基因的注釋信息，圖1A)，不定根長度和葉綠素含量測定結(jié)果顯示在突變體中都有明顯降低(圖1B)。葉片的組織學(xué)觀察和透射電鏡分析，發(fā)現(xiàn)突變體葉肉上表面細(xì)胞中的葉綠體不能正常發(fā)育(圖1C，D)，這就是葉片上表面白化的原因。在植株生長后期，突變體葉片發(fā)生明顯的向上卷曲，不定根發(fā)育受阻和分蘗數(shù)顯著減少(圖1E)。本發(fā)明采用圖位克隆方法獲得了突變體表型控制基因0sCHR4。首先創(chuàng)建了一個 F2定位群體，由純合突變體為母本，秈稻野生型Kasalath為父本雜交獲得F1雜合體，以F1 自交后代F2中突變體性狀的個體作為基因的定位群體。通過對遺傳群體分析(F2中野生型和突變體表型的個體比例約為3 1)，確定該突變體是一個符合單基因控制的孟德爾遺傳規(guī)律的隱性突變體。首先，利用實驗室通用的SSR(Simple Sequence Repeats)分子標(biāo)記進(jìn)行粗定位，將突變基因定位在第七條染色體長臂上RM1135和RM3404兩個標(biāo)記之間(圖 2A)。然后對這兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析比較，發(fā)展新的STSGequence Tagged Site) 標(biāo)記將突變基因精細(xì)定位于0J1457_D07和0J1197_D06上STS3和STS5分子標(biāo)記之間，即 STS4分子標(biāo)記附近。該區(qū)間的物理距離為211Λ，根據(jù)水稻基因注釋信息，該區(qū)間包含3個基因。序列分析表明突變體表型是由于L0C_07g31450基因座上一個T堿基缺失造成的，這個缺失突變導(dǎo)致終止密碼子前移，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。該基因編碼一個染色質(zhì)重塑因子4(CHR0MATINREM0DELING 4)，MI-2LIKE蛋白，由此將基因命名為0sCHR4，將突變體命名為0schr4。通過對該基因cDNA序列(SEQ ID NO 1)和基因組序列比對確定了該基因結(jié)構(gòu) (圖2B)，并將T堿基的缺失定位于該基因最后一個外顯子上。并且利用pfam網(wǎng)站(http // pfam. sanger. ac. uk)，分析了 0sCHR4 蛋白(SEQ IDNO 2)的保守結(jié)構(gòu)域(圖 2B)。為了確證突變體表型是由0sCHR4基因突變引起的。我們對突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因恢復(fù)驗證。將由0sCHR4基因自身啟動子驅(qū)動的完整的⑶S序列(SEQ ID NO 1)克隆到雙元植物轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1300-sGFP的多克隆位點BamHI位點，得到Pfeaffi4: 0sCHR4 sGFP 恢復(fù)載體。將構(gòu)建好的恢復(fù)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化突變體愈傷，經(jīng)過抗性愈傷誘導(dǎo)進(jìn)而分化成轉(zhuǎn)基因苗。轉(zhuǎn)化了外源0sCHR4基因的突變體(即轉(zhuǎn)基因陽性株系) 的不定根長度恢復(fù)到野生型，葉片上表面顏色復(fù)綠。圖3為兩個T1轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系結(jié)合野生型和突變體的表型(圖3A-C)和相應(yīng)的生物學(xué)統(tǒng)計結(jié)果(圖3D-E)，葉綠素的含量和不定根的長度都能恢復(fù)到野生型的水平。轉(zhuǎn)基因恢復(fù)試驗確證了突變體表型是由0sCHR4基因突變引起的，表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常功能的轉(zhuǎn)基因水稻。為了觀察0sCHR4蛋白(SEQ ID NO 2)的亞細(xì)胞定位功能，將0sCHR4基因的CDS 序列(SEQ ID NO 1)構(gòu)建到35S: :sGFP表達(dá)載體內(nèi)，得到35S: 0sCHR4 sGFP融合表達(dá)載體。用洋蔥的瞬時表達(dá)系統(tǒng)觀察0sCHR4(SEQ ID NO :2)的蛋白表達(dá)。首先，提取融合表達(dá)載體35S: :0sCHR4::sGFP及無基因融合空載體35S: :sGFP的質(zhì)粒，用金粉分別包裹后， 基因槍轟擊至洋蔥表皮細(xì)胞。暗環(huán)境下培養(yǎng)16小時后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，無基因融合的對照載體35S::sGFP的綠色熒光均勻地表達(dá)于整個洋蔥表皮細(xì)胞，而 35S: :0sCHR4: :sGFP融合蛋白則特異性地分布于細(xì)胞核內(nèi)(圖4)。進(jìn)一步，對轉(zhuǎn)基因恢復(fù)水稻中GFP熒光信號進(jìn)行了檢測，結(jié)果也表明0sCHR4(SEQ ID NO 2)是一種核定位蛋白(圖5)。這些結(jié)果表明，我們克隆的水稻0sCHR4基因具有一定的應(yīng)用價值。我們可以通過利用該基因?qū)ψ魑锲贩N進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，獲得外源基因能正確表達(dá)的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株。同時也表明通過基因工程手段，該基因具有改良葉色及根發(fā)生能力的潛力。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并非對發(fā)明作限定。圖1是水稻不定根伸長缺陷和葉色白化突變體0schr4的表型圖；A為水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)8天的植株表型，左邊為野生型(SSBM)，右邊為突變體 (0schr4)，bar = 2cm ；B為SSBM和0schr4的不定根長度和葉綠素含量測定結(jié)果；C為葉片組織學(xué)觀察結(jié)果，bar = 100 μ m，左邊為SSBM的葉片，右邊為0schr4的葉片；D為葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，左邊為SSBM的葉綠體，中間為0schr4上表面的葉綠體，右面為0schr4下表面的葉綠體，bar = 0. 5μπι;Ε為SSBM (左邊)和0schr4(右邊)植株生長后期表型，突變體 0schr4表現(xiàn)為葉片卷曲、不定根伸長受阻、分蘗數(shù)減少，bar = 6cm。圖2是0sCHR4基因在水稻第七條染色體上的圖位克隆和基因結(jié)構(gòu)圖；A為0sCHR4基因的定位圖；B為0sCHR4基因結(jié)構(gòu)和0sCHR4蛋白結(jié)構(gòu)圖。圖3是轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系的表型圖；A為SSBM(左一)、0schr4(左二)和兩個轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系(左三和左四)在水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)8天的植株表型，bar = 2cm ；B和C分別為葉片上表面和葉片下表面表型，葉片順序排列從左到右為SSBM、0schr4和兩個轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系；D和E分別為它們的不定根長度和葉綠素含量測定結(jié)果。圖4是35S: :0sCHR4::sGFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)結(jié)果圖；上行為 35S::sGFP空載體的定位結(jié)果，下行為35S: :0sCHR4: sGFP融合載體的定位結(jié)果；左邊為白光圖，中間為GFP熒光圖，右邊為前二者的融合圖。圖5是在T1轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株根部和葉片中的GFP熒光檢測結(jié)果圖；左列為PI染色或者葉綠體自發(fā)熒光；中間列為GFP的檢測信號；右列為前兩者的融合。在轉(zhuǎn)基因植株中 0sCHR4表現(xiàn)為細(xì)胞核定位，根部圖片中bar = 100 μ m，葉片圖片中bar = 50 μ m。圖6是轉(zhuǎn)基因恢復(fù)載體pCAMBIA1300_sGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7是亞細(xì)胞定位載體35S: :sGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1、突變體篩選和表型以EMS誘變的水稻地方品種SSBM突變體庫為突變體篩選對象，M2種子(誘變處理前為M。，處理后為MnM2種子為M1的自交后代)用蒸餾水沖洗干凈，0. 67%稀ΗΝ03(質(zhì)量濃度)破休眠處理18小時，37°C暗處催芽至露白。將露白的種子播于水稻培養(yǎng)液(培養(yǎng)液配方為國際水稻所的標(biāo)準(zhǔn)配方，具體參考^shida et al. ,1976)上浮著的尼龍網(wǎng)紗上面，在溫度為30/22°C (晝/夜)左右、光照12小時條件下培養(yǎng)8天，以不定根構(gòu)型(包括長度、數(shù)量等)的改變?yōu)楹Y選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行突變體的篩選，從中篩選到一個不定根縮短的突變體， 并且該突變體葉片上表面發(fā)生白化而下表面表現(xiàn)正常(圖1A)。該突變體不定根長度和葉片葉綠素含量顯著降低(圖1B)。該突變體的地上部的株高及根部的主根長度、側(cè)根長度和數(shù)量與野生型SSBM之間都沒有顯著性差異(圖1A)。為了進(jìn)一步明確突變體葉片上表面白化的原因，對葉片進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)突變體上表面2-3層葉肉細(xì)胞不能被0. 1 %的亞甲基藍(lán)染料著色(圖1C)；通過葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)突變體上表面葉綠體不能進(jìn)行正常發(fā)育，而葉片下表面的葉綠體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)是正常的(圖1D)。在成熟期階段，突變體表現(xiàn)出分蘗數(shù)和不定根數(shù)目顯著減少以及葉片內(nèi)卷特征(圖1E)。上述篩選到的突變體命名為0schr4。實施例2、基因定位F2定位群體來自于純合突變體(0schr4)和秈稻品種Kasalath雜交后代，由雜合子&自交獲得，共篩選出觀50個具有突變表型的F2個體(其突變表型具體為葉片上表面白化且不定根短小)，從水稻葉片中提取基因組DNA。取大約0. Ig水稻幼嫩葉片于1. 5ml 的離心管中用組織磨樣器將葉片打成粉末，提取總DNA，獲得的DNA溶解于200 μ 1無菌水中作為DNA樣品，每個PCR反應(yīng)用0. 5 μ 1 DNA樣品作為模板。在0sCHR4基因的粗定位試驗中，用30個具有突變表型的F2個體進(jìn)行分析。根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的146個SSR 引物，SSR引物來源于Gramene (http://www. gramene. org/)網(wǎng)站提供的已經(jīng)公知的標(biāo)記， 用到的各染色體上的SSR引物名稱如下水稻1號染色體(17個)RM1282, RM1167, RM272, RM243, RM600, RM3412, RM8115, RM329, RM5638, RM6716, RM1349, RM1297, RM3411, RM6547, RM1198, RM165, RM6141水稻2號染色體(12個)RM6938, RM279, RM6378, RMl74, RM5699, RM1358, RM7426, RM341, RM3688, RM6, RM425, RM5607水稻3號染色體(13個)RM523, RM6038, RM1022, RM157A, RM5551, RM1164, RM6881, RM6266, RM347, RM1350, RM5813, RM143, RM148水稻4號染色體(13個)RM25054, RM3471, RM2416, RM16604, RM5688, RM1100, RM1359, RM6997, RM3866, RM2441, RM348, RM567, RM3648水稻5號染色體(9個)RM3334, RM267, RM3193, RM3381, RM6645, RM1237, RM3573, RM334, RM3170 水稻 6 號染色體(14個)RM170, RM190, RM584, RM276, RM50, RM3183, RM6536, RM3, RM3187, RM5371, RM7434, RM6458, RM5307, RM5814水稻7號染色體(13個)RM5344, RM82, RM125, RM1186, RM3755, RM1135, RM3404, RM346, RM3826, RM7564,RM3589, RM1209, RM3555水稻8號染色體(12個)RM1235, RM8018, RM1376, RM310, RM6429, RM3395, RM325A, RM8264, RM556, RM334, RM3120, RM3754水稻9號染色體(10個)RM5688, RM2855, RM444, RM7390, RM105, RM409, RM3700, RM257, RM328, RM6174水稻10號染色體(9個)RM474, RM7545, RM25185, RM3311, RM25369, RM271, RM1108, RM5666, RM228水稻11號染色體(13個)RM286, RM7557, RM1124, RM552, RM3701, RM4862, RM3428, RM6272, RM254, RM144, RM5349, RM4601, RM2191水稻12號染色體(11個)RM628, RM3455, RM83,12_9528k，RM7102, RM1261, RM101, RM1246, RM1103, RM3739, RM1296然后按照引物要求的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系如下)。通過6%的聚丙烯酰胺凝膠(凝膠配置方法如下)電泳分離，通過檢測條帶的多態(tài)性，將基因粗定位到水稻第七條染色體上的分子標(biāo)記RMl 135和RM3404之間。PCR反應(yīng)體系
DNA模板Ιμ
10XPCR BufferΙμ
dNTP (2.5mM)0.6μ1上游引物(ΙΟμΜ) 0.2μ1
下游引物(ΙΟμΜ) 0.2μ1 Taq 酶(5U L) 0.2μ1 ddHzO_6.8μ1聚丙烯酰胺凝膠(6% )配方
尿素4.
5 χ TBE6ml 注40% Arc-Bis (丙烯酰胺38g和亞甲基雙丙烯酰胺2g溶于IOOml水所得)聚丙烯酰胺凝膠顯色液配方Na3(BO4)40.152g
NaOH12g甲醛3.2mlddH,0至 800ml注甲醛是臨用前現(xiàn)加，其他三個按相應(yīng)量提前配好。然后我們擴(kuò)大F2個體到200個，繼續(xù)縮小定位區(qū)間至分子標(biāo)記STSl和STS2 (設(shè)計的引物序列如下)之間。最后將F2定位群體擴(kuò)大到觀50個進(jìn)行精細(xì)定位，根據(jù)網(wǎng)上公布的 Nipponbare BAC末端序列，再設(shè)計3個分子標(biāo)記，分別命名為STS3，STS4，STS5(引物序列如下)。利用這三個分子標(biāo)記對觀50個F2個體進(jìn)行連鎖分析，將目的基因卡定在STS3和 STS5分子標(biāo)記之間，STS4分子標(biāo)記附近21kb范圍之內(nèi)。這5個STS分子標(biāo)記的引物序列(包括上下游)為STS1U-5，GTTCCCATCATTCTAATATGCT 3’ ；STS1L-5’ CGTTCCCACAGGTCTCAAC 3’STS2U-5，ACGGTGACTCAAACAGCAT 3’ ； STS2L-5，TGGAGAGGCATAAATGTGCTAT 3’STS3U-5，CGTGAAAGAGGAATTCATAT 3’ ； STS3L-5，GGACAGGCTCTATGCTTAGT 3’STS4U-5，GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’ ； STS4L-5，GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’STS5U-5，ATAGAGTTCTCCTGAGTATT 3’ ； STS5L-5，CTGAAAAATGACTATGTTAG 3’實施例3、基因預(yù)測和序列分析根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果，0sCHR4基因位于BAC克隆0J1457_D07和0J1197_D06上STS4 分子標(biāo)記附近 21kb 范圍之內(nèi)(圖 2A)。根據(jù) TIGR(http://www. tigr. org/tdb/e2kl/osal/) 的水稻基因注釋信息和EST數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)，對此染色體區(qū)段內(nèi)的3個基因進(jìn)行測序分析。這3個基因分別是0s07g31430 (phosphate-induced protein 1) ；0s07g31440 (expressed protein) ；0s07g31450 (CHR4/MI-2-LIKE)。對這 3 個候選基因在野生型(SSBM)和突變體(0schr4)的cDNA模板下進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過測序和序列比對分析， 發(fā)現(xiàn)0s07g31450基因在突變體中的CDS序列(SEQ ID NO 1)起始密碼子ATG后M73bp處缺失一個堿基T，導(dǎo)致終止密碼子前移，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)。然后通過該基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1)和基因組序列比對分析確定了基因結(jié)構(gòu)，利用0sCHR4的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，得到其保守結(jié)構(gòu)域(圖2B)。實施例4、0sCHR4遺傳恢復(fù)載體的構(gòu)建由于0sCHR4基因組序列較大，啟動子和0sCHR4基因組融合的PCR擴(kuò)增很困難， 因此構(gòu)建恢復(fù)載體時，選擇使用0sCHR4基因的啟動子接其全長CDS序列(SEQ ID NO :1)。 首先分別構(gòu)建0sCHR4基因啟動子的克隆和0sCHR4基因全長CDS的克隆，測序后確定序列正確的克隆，然后用I^rimeSTAR高保真酶(TaKaRa生物公司)和以擴(kuò)增啟動子的上游引物 Pro-F (引物序列如下，帶恢復(fù)載體上的酶切位點BamHI和保護(hù)堿基)、以擴(kuò)增0sCHR4基因全長CDS的下游引物CDS-R(引物序列如下，帶恢復(fù)載體上的酶切位點BamHI和保護(hù)堿基) 作為引物對進(jìn)行兩片段融合PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如下。融合片段經(jīng)過限制性酶切后與同樣經(jīng)過BamHI酶切過的pCAMBIA1300_SGFP載體(終載體)連接，得到恢復(fù)載體 P。sCHR4: :0sCHR4: :sGFP。
PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種控制水稻不定根伸長和葉片顏色基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制水稻不定根伸長和葉片顏色基因徹以/擬編碼的蛋白質(zhì)， 其特征在于所述氨基酸序列還包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)的基因，其特征在于其具有SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列還包括在SEQID NO 1 所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
5.如權(quán)利要求3或4所述基因的用途用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。
6.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其特征在于包含權(quán)利要求3或4所述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制水稻不定根伸長和葉片顏色基因OsCHR4編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的基因能用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明還同時公開了一種包含本發(fā)明所述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
文檔編號A01H5/00GK102153638SQ20111007122
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者劉紹軍, 吳平, 張帆, 毛傳澡, 王曉飛, 趙春芳 申請人:浙江大學(xué)