專利名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備及應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生態(tài)制劑的制備及應用方法，具體涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌 微生態(tài)制劑的制備及應用方法。
背景技術：
粘細菌作為微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面的應用，其最重要的特性就是粘細菌作 為一種捕食性微生物，能夠吞噬大腸桿菌及其它一些革蘭氏陰性菌，它分泌的胞外活性物 質(zhì)對真菌和細菌具有較強的抗性，因此具有以菌治菌的生物防治作用；粘細菌還能產(chǎn)生消 化酶將蛋白質(zhì)、核酸、酯類等大分子物質(zhì)分解，有利于飼料消化率的提高；粘細菌及其酶，從 菌來說，未發(fā)現(xiàn)其有害作用，從酶來說，化學成分是蛋白質(zhì)，故不會產(chǎn)生對環(huán)境的污染和對 人體健康的危害。利用粘細菌作為飼料添加劑，將在防病抗病、提高水產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)力方面 發(fā)揮巨大的潛能，并有利于綠色環(huán)保型水產(chǎn)品的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備及應用方 法，本發(fā)明制備的水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑針可抑制水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的病原微生物 生長，提高飼料利用率，降低病死率。本發(fā)明的技術解決方案是該水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備方法包括 以下步驟
(1)菌株提取取一株橙色粘球菌(Mxxococcusfulvus) JCH-04，保藏號為CGMCC No. 2893,菌株在CY培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中30°C、ISOrpm搖瓶培養(yǎng)5天，該菌 株16S rDNA的GenBank登錄號為FJ826620 ；所述的CY培養(yǎng)基為酪素水解蛋白胨3g，酵母 膏l(xiāng)g，氯化鈣lg，去離子水定溶至1000mL，pH7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉IOg，黃豆 粉 15g，葡萄糖 2. 5g，酵母膏 0. 5g，CaCl2 lg, MgSO4JH2O 0. 5g，去離子水定溶至 IOOOmL, pH 7. 4 ；
(2)菌株活化從斜面挑取一環(huán)菌種接種于CY液體培養(yǎng)基中試管30°C培養(yǎng)3天，再將 接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基試管中30°C培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/mL，反復3次；
(3)菌株擴培將步驟(2)的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中30°C、180rpm搖 瓶培養(yǎng)5天，接種量為106CFU/mL ；
(4)菌株收集濃縮在無菌條件下，將步驟(3)的搖瓶培養(yǎng)菌液用0.2Mm微濾膜過濾濃 縮成500億CFU/mL菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。其中，上述橙色粘球菌微生態(tài)制劑的應用方法采用外噴涂低溫烘干添加到飼料 中，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖飼料中微生態(tài)制劑的添加量為107_8CFU/g。本發(fā)明的優(yōu)點在于1、提供了橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)新菌株JCH-04保 藏號為CGMCC No. 2893，該菌株16S rDNA的GenBank登錄號為FJ擬6620，它具有良好的培 養(yǎng)特性，其發(fā)酵液具有良好的抑菌和多種酶解能力，可作為優(yōu)良的微生態(tài)飼料添加劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領域；2、一株橙色粘球菌a^zococcM fulvus) JCH-04易于富集培養(yǎng)，制備發(fā)酵 工藝操作簡單，對其進行毒理試驗表明可安全使用于動物飼料中，可有效的抑制水產(chǎn)品養(yǎng) 殖病原微生物生長，降低病死率；3、該菌株可產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，當該菌在動物的 腸道存活時，就有可能分泌消化酶，輔助消化，提高飼料的消化率，進而提高飼料利用率；4、 在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中添加橙色粘球菌微生態(tài)制劑于飼料中，提高飼料利用率，所述的水產(chǎn)品養(yǎng) 殖中的病原微生物為大腸桿菌{Escherichia cWi)，霍亂弧菌、Vibri cholera)，次副溶 血性弧菌{Vibrio parahaemolyticus),嗜水氣單胞菌(Aeromonas Aj^roMih),銅綠假單 胞菌(Pseudomons aeruginosa),lif {Flavobacterium aquatile) 0
具體實施例方式實施例1 菌種篩選與保藏
(1)本菌株是從土壤中分離得到的對病原微生物具有較強抑菌作用的菌株，將菌株培 養(yǎng)，得到菌株培養(yǎng)液，觀察培養(yǎng)液對水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的6種病原微生物抑菌能力，同時測定培 養(yǎng)液中的產(chǎn)各種消化酶的能力；
(2)該菌株根據(jù)GeneBank比對結果，將其命名為橙色粘球菌JCH-04亞種Qfyxococcus fulvus subsp JCH-04),保藏號為 CGMCC No. 2893，該菌株 16S rDNA 的 GenBank 登錄號 為 FJ826620。實施例2 橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04對病原微生物抑菌實驗
(1)實驗用病原微生物指示菌為大腸桿菌(EscherichiacWi)，次副溶血性弧菌 {Vibrio ^araAaefflo^Fii^As)，霍舌匕弧菌{Vibri cAc^era)，嗜水氣單胞菌{Aeromonas hydrophila)，f同參錄{段單胞菌(Pseudomons aeruginosa)，7_Κ 生黃木干菌{Fla vobac terium aquatile)；
(2)培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(ΜΗ):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，去離子水定溶至 IOOOmL, pH7. 2-7. 4 ；培養(yǎng)次副溶血性弧菌MH培養(yǎng)基中加鹽量為3%，培養(yǎng)霍亂弧菌MH培養(yǎng) 基中pH為8. 8，其它不變，同MH培養(yǎng)基；其它指示菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基同MH培養(yǎng)基；
(3)實驗方法將指示菌用無菌生理鹽水稀釋成不同梯度，測定0D_并涂平板，確定 不同細菌最適涂布濃度OD6tltl為0.02-0. 03，將不同指示菌O.aiil均勻涂于直徑為9cm平 板表面，晾干，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，再將培養(yǎng)濃縮得到的橙色粘 球菌Qfyxococcus fulvus) JCH-04菌液，用無菌槍頭吸取200 μ 1加于牛津杯，牛津杯直 徑5mm，在37°C下培養(yǎng)16-24小時，觀察抑菌圈；抑菌圈直徑均大于10mm，說明橙色粘球菌 (Myxococcus fulvus) JCH-04對所列6種病原微生物指示菌具有較強的抑菌作用。實施例3 橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04安全性試驗
將橙色粘球菌CKrxococcm fulvus) JCH-04培養(yǎng)，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液的濃度分別為 108、109、101QCFU/mL ；試驗開始前24h停止投喂，對南美白對蝦(體長5cm-6cm/尾)，采用注 射的方法，劑量為50μ 7尾，每組用蝦30尾，以同濃度的副溶血弧菌和生理鹽水做對照，每 組設6個重復，記錄觀察7d累計死亡情況；對幼銀鯽魚(體重20g左右/尾)，采用灌服的方 法，劑量為0. 5mL/尾，每組魚30尾，以同濃度的嗜水氣單胞菌和生理鹽水做對照，每組設6 個重復，記錄觀察20d累計死亡情況。結果表明，注射IO8UO9UOiciCfuAiL副溶血弧菌的南美白對蝦全部死亡；灌服108、109、101QCFU/mL嗜水氣單胞菌的幼銀鯽魚死亡率分別為89.67%,97. 67%, 100%,將銀 鯽魚屠宰取肝和脾臟，做電鏡切片觀察，肝、脾細胞形態(tài)異常，病變特征明顯；注射108、
109、10lclCFU/mLMyxococcus fulvus JCH-04 的南美白對蝦、灌服 ΙΟ8、109、10lclCFU/mL Myxococcus /WmsJCH-04的銀鯽魚和空白對照組在試驗期間采食和生長均正常，無死 亡；將銀鯽魚屠宰取肝和脾臟，做電鏡切片觀察，肝、脾細胞形態(tài)正常，未見病變特征。說明 Myxococcus fulvus JCH-04菌株對南美白對蝦和銀鯽魚安全無毒，可以作為在水產(chǎn)品養(yǎng)殖 中具有安全性和潛在應用價值的外源益生菌使用。實施例4 微生態(tài)制劑的制備
(1)菌株提取取一株橙色粘球菌U&xococcusfulvus) JCH-04，保藏號為CGMCC No. 2893,菌株在CY培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中30°C、ISOrpm搖瓶培養(yǎng)5天，該菌 株16S rDNA的GenBank登錄號為FJ826620 ；所述的CY培養(yǎng)基為酪素水解蛋白胨3g，酵母 膏l(xiāng)g，氯化鈣lg，去離子水定溶至1000mL，pH7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉IOg，黃豆 粉 15g，葡萄糖 2. 5g，酵母膏 0. 5g，CaCl2 lg, MgSO4JH2O 0. 5g，去離子水定溶至 IOOOmL, pH 7. 4 ；
(2)菌株活化從斜面挑取一環(huán)菌種接種于CY液體培養(yǎng)基中試管30°C培養(yǎng)3天，再將 接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基試管中30°C培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/mL，反復3次；
(3)菌株擴培將步驟(2)的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中30°C、180rpm搖 瓶培養(yǎng)5天，接種量為106CFU/mL ；
(4)菌株收集濃縮在無菌條件下，將步驟(3)的搖瓶培養(yǎng)菌液用0.2Mm微濾膜過濾濃 縮成500億CFU/mL菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。實施例5 橙色粘球菌Qfyxococcus fulvus) JCH-04產(chǎn)各種消化酶的能力測定 將實施例4中獲得的搖瓶懸液，離心分離，測清液中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性。測定發(fā)酵液中淀粉酶活力為3148 . 8U/mL，蛋白酶活力為78. 5 U/mL和脂肪酶活力 為48. 4 U/mL ；益生菌能產(chǎn)生胞外酶，分泌到周圍環(huán)境中，尤其是在動物的腸道中，往往是益 生菌發(fā)揮營養(yǎng)作用的原因之一；該菌株可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，因此，當該菌在 動物的腸道存活時，就有可能分泌消化酶輔助消化，進而提高飼料的消化率。實施例6 在水產(chǎn)品養(yǎng)殖飼料中的應用
鯽魚飼料配方魚粉12%，花生粕20%，豆粕1596，膨化大豆粉5%，麩皮15%，棉粕11%，次 粉8%，維生素預混料0. 6%，礦物質(zhì)預混料2%，植物油1. 4%。對蝦飼料配方豆粕30%，魚粉32%，次粉15%，礦劑0. 8%，酵母粉10%，復合維生素
0. 2%ο菌劑加入方法將魚飼料制成直徑為5mm的顆粒料，蝦飼料制成直徑0. 5 mm微 粒料，用噴涂機采用外噴涂方法，等菌液浸入到顆粒料內(nèi)再低溫烘干；魚飼料菌劑加入量為 108CFU/g，蝦飼料加入量為107CFU/g。用本發(fā)明制備的橙色粘球菌CKrxococcm fulvus) JCH_04微生態(tài)制劑添加到水 產(chǎn)飼料中，經(jīng)飼喂實驗證明飼料轉化率魚達到1. 84%，蝦達到1. 90%，成活率魚達到96. 2%， 蝦達到93. 0%，魚死亡率減低了 27. 7%，蝦死亡率減低了 26. 5% ；對其免疫保護率也有一定的 提高；從生長性能的指表反映，菌劑的添加可改善魚蝦生長性能；同時對魚、蝦體內(nèi)消化酶 指標測定表明菌劑的添加可顯著提高魚和蝦淀粉酶活性，對脂肪酶和蛋白酶活性也有一定提尚。
權利要求
1.水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下 步驟(1)菌株提取取一株橙色粘球菌JCH-04，保藏號為CGMCCNo. 2893，菌株在CY培養(yǎng)基 上30°C培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中30°C、180rpm搖瓶培養(yǎng)5天，該菌株16S rDNA的GenBank 登錄號為FJ826620 ；所述的CY培養(yǎng)基為酪素水解蛋白胨3g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈣lg，去離子 水定溶至1000mL，pH7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉IOg，黃豆粉15g，葡萄糖2. 5g，酵母 膏 0.5g，CaCl2 lg, MgSO4. 7Η20 0. 5g，去離子水定溶至 lOOOmL，pH 7. 4 ；(2)菌株活化從斜面挑取一環(huán)菌種接種于CY液體培養(yǎng)基中試管30°C培養(yǎng)3天，再將 接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基試管中30°C培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/mL，反復3次；(3)菌株擴培將步驟(2)的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中30°C、180rpm搖 瓶培養(yǎng)5天，接種量為106CFU/mL ；(4)菌株收集濃縮在無菌條件下，將步驟(3)的搖瓶培養(yǎng)菌液用0.2Mm微濾膜過濾濃 縮成500億CFU/mL菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。
2.水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的應用方法，其特征在于該橙色粘球菌微生態(tài) 制劑的應用方法是采用外噴涂低溫烘干添加到飼料中，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖飼料中微生態(tài)制劑 的添加量為107_8CFU/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了水產(chǎn)養(yǎng)殖用橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備及應用方法，(1)取一株橙色粘球菌JCH-04，保藏號為CGMCC No.2893，菌株在CY培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、180rpm搖瓶培養(yǎng)5天；(2)從斜面挑取一環(huán)菌種接種于CY液體培養(yǎng)基中試管30℃培養(yǎng)3天，再將接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基試管中30℃培養(yǎng)3天；(3)將步驟(2)的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中30℃、180rpm搖瓶培養(yǎng)5天；(4)將步驟(3)的搖瓶培養(yǎng)菌液用0.2μm微濾膜過濾濃縮成500億CFU/mL菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。本發(fā)明橙色粘球菌微生態(tài)制劑可抑制水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的病原微生物生長，提高飼料利用率，降低病死率。
文檔編號A23K1/18GK102132788SQ20111006910
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權日2011年3月22日
發(fā)明者賈建波 申請人:淮陰工學院