專利名稱：產(chǎn)甘油釀酒酵母nau-zh-gy1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl及其應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，是利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)甘油，適用于反芻動物飼料添加劑的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
反芻動物的圍產(chǎn)期是指妊娠后期(產(chǎn)前2 3周)至泌乳初期(產(chǎn)后2 3周) 這一階段，亦稱為過渡期，由于妊娠后期采食量下降，干物質(zhì)攝入減少，滿足不了胎兒生長發(fā)育和自身能量代謝的需要，而產(chǎn)后泌乳高峰(產(chǎn)后4 6周)先于干物質(zhì)攝入高峰(產(chǎn)后8 10周)，使機(jī)體處于能量負(fù)平衡這樣一種營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)。研究表明，妊娠后期胎兒消耗的葡萄糖可占母體所產(chǎn)生葡萄糖的46%，而泌乳高峰期消耗的葡萄糖則高達(dá)85%，因此常易導(dǎo)致能量代謝障礙，引發(fā)酮病、脂肪肝、產(chǎn)乳熱等一系列圍產(chǎn)期疾病，嚴(yán)重影響牛、羊等反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。由于高產(chǎn)品種的引進(jìn)、培育，高能飼料的開發(fā)、利用，規(guī)?；曫B(yǎng)程度的提高等原因，圍產(chǎn)期能量代謝障礙疾病的發(fā)病率長期以來一直居高不下。我國奶牛酮病的發(fā)病率占泌乳牛的15.0% 30.0%，印度為14. 7%，美國為5.0%，日本高達(dá)43. 1%。我國奶牛脂肪肝的發(fā)病率超過30. 0 %，美國為35. 0 % 66. 0 %。據(jù)國外報道，1頭酮病奶牛僅治療藥物及奶產(chǎn)量下降所造成的損失即達(dá)151 312美元。除此以外，奶牛酮病、脂肪肝還因其常常誘發(fā)真胃變位、胎衣不下及生產(chǎn)癱瘓等圍產(chǎn)期其他的疾病，給奶牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，防控高產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期能量代謝障礙疾病是確保奶牛高效安全生產(chǎn)的重要任務(wù)之一。盡管這方面的研究報道很多，但始終未找到理想的解決方法。反芻動物體內(nèi)大部分葡萄糖是通過糖異生途徑獲取，糖異生作用是指各種生糖前體轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃蚱咸烟堑倪^程，對圍產(chǎn)期的反芻動物有重要意義，是調(diào)節(jié)能量代謝障礙的重要途徑。由于反芻動物主要靠瘤胃中微生物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸提供能量，葡萄糖或其他碳水化合物難以直接進(jìn)入血液或糖異生途徑。甘油是一種生糖先質(zhì)， 它具有優(yōu)于其他生糖先質(zhì)的糖異生途徑，在糖異生過程中通過甘油激酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖，而不依賴于限速酶丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。已有人將甘油作為生糖前體添加到圍產(chǎn)期奶牛的日糧中，研究表明，甘油可以提高圍產(chǎn)期奶牛的血糖，提高泌乳性能，調(diào)節(jié)血液代謝，降低酮體含量，起到緩解能量負(fù)平衡的作用。目前用作圍產(chǎn)期奶牛能量補(bǔ)充物的甘油主要來自生物柴油生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物或工業(yè)合成，其加工過程中會引入工業(yè)有害物質(zhì)，對奶牛食欲產(chǎn)生不良影響或?qū)C(jī)體產(chǎn)生有害刺激；而高純度甘油則成本高，限制了甘油的推廣運(yùn)用。近年來，隨著生物技術(shù)、微生物菌種、發(fā)酵工藝和提取分離等各方面技術(shù)的進(jìn)展， 使得發(fā)酵甘油生產(chǎn)變得具有可能，發(fā)酵法產(chǎn)甘油是利用微生物發(fā)酵淀粉質(zhì)原料(玉米、紅薯等)或糖蜜等原料物質(zhì)產(chǎn)生甘油，是一種天然的甘油，克服了工業(yè)生產(chǎn)甘油的缺點(diǎn)。工業(yè)上常用的微生物有粉狀畢赤酵母、產(chǎn)甘油假絲酵母等。但目前還未見有將發(fā)酵法生產(chǎn)的甘油用作飼料添加劑的報道，而且傳統(tǒng)使用的產(chǎn)甘油酵母并非益生菌。
益生菌是指投入后通過改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主(人和動物)健康水平和健康佳態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物，主要包括乳酸菌、雙歧桿菌、放線菌、酵母菌。在飼料工業(yè)中，益生菌添加劑是利用生物技術(shù)生產(chǎn)的微生物添加劑的一種，常用的酵母類益生菌有釀酒酵母。在美國，酵母添加劑已作為一種常規(guī)的飼料成分得到廣泛的應(yīng)用。其作用機(jī)制通常認(rèn)為有(1)酵母作為活菌，進(jìn)入胃腸道后繁殖并活力增強(qiáng)，促進(jìn)微生物繁殖和增強(qiáng)活性，能有效抑制病原微生物的繁殖，調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡， 參與病原微生物菌群的生存競爭，排斥病原菌在胃腸道粘膜表面的附著，協(xié)助機(jī)體消除毒素及其代謝產(chǎn)物。( 提高動物腸道消化酶活性。通過改善胃腸道環(huán)境和菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)控胃腸發(fā)酵。減少乳酸鹽的產(chǎn)生，提高PH值穩(wěn)定性，促進(jìn)有益菌群繁殖及活力的提高，增加有益菌的有效濃度，促進(jìn)胃腸對營養(yǎng)物質(zhì)的分解、合成、消化、吸收和利用，從而增加采食量， 改善動物對飼料的利用率，提高生產(chǎn)性能；提高動物對纖維素和礦物質(zhì)的消化率；C3)增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病力，防止毒素和廢物的吸收，對動物消化系統(tǒng)起到保健作用；對幼年動物則可刺激胃腸道發(fā)育，保障動物健康；(4)酵母分泌的多種消化酶和未知生長因子，維生素、SOD、活性肽、輔酶等營養(yǎng)成分具有促生長作用，分泌的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，參與飼料的降解、消化，提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，而且還有降解飼料中復(fù)雜碳水化合物 (如果膠、葡聚糖、纖維素等)的酶，其中很多是動物本身不具有的酶。一些研究認(rèn)為，酵母類飼料的作用是基于其提供重要的、能刺激微生物活性的營養(yǎng)因子。綜上所述，以特定的益生菌為菌種，利用各種淀粉質(zhì)原料或糖蜜作為底物發(fā)酵生產(chǎn)甘油，將益生菌的發(fā)酵培養(yǎng)物作為圍產(chǎn)期反芻動物飼料添加劑，可同時發(fā)揮甘油和益生菌的作用，甘油可作為能量補(bǔ)充物緩解能量負(fù)平衡；酵母菌和氨基酸、維生素等微生物代謝物質(zhì)，可調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群，拮抗病原微生物，提高機(jī)體免疫力，并促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化吸收，提高生產(chǎn)性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能生產(chǎn)甘油以及其他有益微生物代謝物質(zhì)的釀酒酵母NAU-ZH-GY1，本發(fā)明的另一目的在于提供該釀酒酵母 NAU-ZH-GYl在發(fā)酵產(chǎn)甘油的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供該產(chǎn)甘油釀酒酵母在發(fā)酵產(chǎn)甘油中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供該產(chǎn)甘油釀酒酵母在生產(chǎn)反芻動物飼料添加劑中的應(yīng)用。通過工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)形成綠色、營養(yǎng)、安全、性價比高的新型反芻動物飼料添加劑。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供一種產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GY1，該菌株分類命名為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，2011年1月13日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號CGMCC No. 4551。主要生物學(xué)特性顯微鏡下觀察，菌株細(xì)胞為近圓形，大小(4. 1-8.2)微米 *(5. 2-9. 5)微米，不產(chǎn)生醭膜；以多端芽殖進(jìn)行無性繁殖；無假菌絲，有子囊孢子產(chǎn)生；瓊脂平板上30°C培養(yǎng)對_3他后，菌落乳白色、隆起、表明光滑濕潤，有光澤、質(zhì)地均勻、邊緣較整齊。最適生長溫度30°C，pH5.0。
能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖，不能發(fā)酵乳糖、纖維二糖、菊糖；不能同化硝酸鉀、亞硝酸鈉。該菌株的^S rDNA D1/D2區(qū)域具有SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，與Genbank現(xiàn)有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同一區(qū)域堿基序列同源性均達(dá)到99%。產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl發(fā)酵產(chǎn)甘油的方法，其過程如下1)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不調(diào)pH，115°C滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖200，尿素4，玉米漿干粉5，氯化鈉20，硫酸鎂0.5，氯化鈣 0.1,調(diào)節(jié) pH 5. 0，115°C滅菌 20min。2)培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng)為搖瓶發(fā)酵，用500ml三角瓶裝種子培養(yǎng)基100ml，將產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl接入種子培養(yǎng)基中，30°C，150rpm搖床培養(yǎng)M小時。二級種子培養(yǎng)10L種子發(fā)酵罐裝種子培養(yǎng)基6L，接種量5%，3(TC，150rpm搖床培養(yǎng)24小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)100L全自動攪拌發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基60L，由種子罐流加接種， 320C，接種量 10%，pH 5. 0，300rpm,通氣量 0. 5vvm,培養(yǎng) 48h。上述的產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl在發(fā)酵產(chǎn)甘油中的應(yīng)用。上述的產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl在生產(chǎn)反芻動物飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GY1。本發(fā)明還提供了產(chǎn)甘油釀酒酵母 NAU-ZH-GYl的發(fā)酵方法，所產(chǎn)甘油達(dá)35. 6g/L，活菌數(shù)量達(dá)到3X 109CFU/mL。本發(fā)明中涉及的酵母菌為釀酒酵母，是農(nóng)業(yè)部允許的可直接用于飼喂的益生菌， 其發(fā)酵所產(chǎn)甘油天然、無毒副作用、安全可靠。該酵母應(yīng)用于反芻動物圍產(chǎn)期飼料添加劑生產(chǎn)，發(fā)酵后無需提取甘油，生產(chǎn)工藝簡單，對環(huán)境無污染，所產(chǎn)甘油能補(bǔ)充動物能量，緩解動物能量負(fù)平衡，糾正能量代謝障礙；培養(yǎng)物中大量釀酒酵母活菌，以及豐富的氨基酸、維生素等有益微生物生理代謝物質(zhì)，可調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群，拮抗病原微生物，提高機(jī)體免疫力和抗病力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和吸收，提高生產(chǎn)性能，將是一種綠色、營養(yǎng)、安全、性價比高的新型飼料添加劑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 產(chǎn)甘油菌株的分離稱量樣品(未加工的蜂蜜)10g，放入盛有90mL無菌生理鹽水的三角燒瓶中，振蕩 20min,制成菌懸液，吸取0. ImL菌懸液接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)Mh。
挑選出酵母菌，分別進(jìn)行產(chǎn)甘油發(fā)酵培養(yǎng)，搖床150rpm，溫度，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖200，尿素2，腿2 040 . 4，不調(diào)？!1，1151滅菌20111土11。篩選得到一株甘油產(chǎn)量較高的菌，命名為NAU-ZH-GY1，經(jīng)鑒定為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，2011年1月13日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號CGMCC No. 4551。主要生物學(xué)特性顯微鏡下觀察，菌株細(xì)胞為近圓形，大小(4. 1-8.2)微米*(5. 2-9. 5)微米，不產(chǎn)生醭膜；以多端芽殖進(jìn)行無性繁殖；無假菌絲，有子囊孢子產(chǎn)生；瓊脂平板上30°C培養(yǎng)24-3 后，菌落乳白色、隆起、表明光滑濕潤，有光澤、質(zhì)地均勻、邊緣較整齊；最適生長溫度30°C，pH5. 0 ；能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖，不能發(fā)酵乳糖、纖維二糖、菊糖；不能同化硝酸鉀、亞硝酸鈉。該菌株的^S rDNA D1/D2區(qū)域具有序列1所示的堿基序列，與Genbank現(xiàn)有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同一區(qū)域堿基序列同源性均達(dá)到99%。實(shí)施例2 利用產(chǎn)甘油菌株NAU-ZH-GYl發(fā)酵產(chǎn)甘油1)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不調(diào)pH，115°C滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖200，尿素4，玉米漿干粉5，氯化鈉20，硫酸鎂0. 5，氯化鈣 0.1,調(diào)節(jié) pH 5. 0，115°C滅菌 20min。2)培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng)為搖瓶發(fā)酵，用500ml三角瓶裝種子培養(yǎng)基100ml，將產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl接入種子培養(yǎng)基中，30°C，150rpm搖床培養(yǎng)M小時。二級種子培養(yǎng)10L種子發(fā)酵罐裝種子培養(yǎng)基6L，接種量5%，3(TC，150rpm搖床培養(yǎng)24小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)100L全自動攪拌發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基60L，由種子罐流加接種， 320C，接種量 10%，pH 5. 0，300rpm,通氣量 0. 5vvm,培養(yǎng) 48h。3)發(fā)酵結(jié)果甘油35. 6g/L，活菌數(shù)量3X 109CFU/mL。動物試驗(yàn)1.試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理8只本地成年雄性(去勢)2 3歲健康山羊，平均體重18. 76士0.94kg，編號為 1 8。手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管。試驗(yàn)期間試驗(yàn)動物采用單欄舍飼，基礎(chǔ)日糧組成為精料和苜蓿干(基礎(chǔ)精粗比為1 2)，精料每次飼喂90g/只(精料為玉米、豆粕和麩皮按質(zhì)量比65 25 10混合而成)，苜蓿草180g/只，每天8:00和17:00各飼喂一次，保證充足飲水。苜蓿干草的主要成分(％，質(zhì)量百分比)干物質(zhì)90. 54，粗蛋白17. 52，粗脂肪2. 62，粗纖維 29. 05，鈣 1. 64，磷 0. 36。2.試驗(yàn)設(shè)計試驗(yàn)采用4X4完全拉丁方試驗(yàn)設(shè)計，將8只瘺管羊隨機(jī)分為4組。將試驗(yàn)分為4 期，每期預(yù)試驗(yàn)7天，正式試驗(yàn)15天。對照組C飼喂基礎(chǔ)日糧；低劑量組L飼喂基礎(chǔ)日糧+ 酵母培養(yǎng)物(含甘油30g和酵母菌2. 07 X IO9CFU) /頭 天；中劑量組M飼喂基礎(chǔ)日糧+酵母培養(yǎng)物(含甘油60g和酵母菌4. 04 X IO9CFU) /頭 天；高劑量組H飼喂基礎(chǔ)日糧+酵母培養(yǎng)物(含甘油90g和酵母菌6. 07X IO9CFU)/頭 天。每天8:00將酵母培養(yǎng)物經(jīng)瘤胃瘺管直接添加到瘤胃中。所有動物于正式試驗(yàn)的第16天清晨空腹，采集瘤胃液樣品檢測微生物蛋白、氨氮和揮發(fā)性脂肪酸，采集頸靜脈血液樣品檢測血漿葡萄糖。3.樣品檢測
3.1瘤胃微生物蛋白瘤胃微生物蛋白(MCP)參照Malckar分步離心法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，考馬斯亮藍(lán) (G250)比色法測定蛋白含量，使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，含量為96% 99% Albumin(Sigma)。(1)試劑配制考馬斯亮蘭溶液的配制稱取IOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90%乙醇中(保證充分溶解)，加入85% (W/V)的磷酸溶液IOOmL,最后用蒸餾水定容到1000mL。過夜攪拌后，過濾使用，保質(zhì)期一周。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制將制備好的Img · mL-1牛血清蛋白(BSA)母液用雙蒸水逐級稀釋十個濃度點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品分析瘤胃液取出解凍用渦旋器渦旋振蕩4 Imin(使微生物和食糜分離)在 IOOOr · HiirT1轉(zhuǎn)速下離心5min。吸取上清1. 5mL于2mL離心管中在低溫冷凍離心機(jī)中以 12000r · HiirT1的轉(zhuǎn)速離心30min。取出樣品棄上清，向底物中加入0. 8mL 0. 25mol · Γ1的 NaOH，混勻后在100°C水浴鍋中水浴20min。反應(yīng)完全后于12000r .mirT1低溫)離心 30min,然后吸取上清100 μ L，加入5mL制備好的考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻后于波長595nm處用 721分光光度計比色。3. 2 氨氮以硫酸銨為標(biāo)準(zhǔn)品，采用酚-次氯酸比色法。具體步驟如下(1)試劑配制A試劑準(zhǔn)確稱取0. 0126g亞硝基鐵氰化鈉，加50mL ddH20溶解后移入250mL的容量瓶中(戴手套)然后加入2.5058g苯酚(在50 60°C水浴中化開，再用小燒杯稱量)， 混勻后用雙蒸水定溶到250mL，搖勻，棕色瓶4°C保存。B試劑準(zhǔn)確稱取1. 2505g氫氧化鈉加入IOOmL雙蒸水，溶解后加12. 6645g的 Na2HPO4 · 12H20溫?zé)釘嚢枞芙?，冷卻至室溫后加入12. 5mL 5. 25%次氯酸鈉混勻，然后加雙蒸水到250mL定容后用濾紙過濾，濾液放置在塑料瓶中4°C避光保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)儲備液即5mmol/L (NH4) 2S04溶液配置前將(NH4) 2S0480°C烘干2h。準(zhǔn)確稱取
0.066g烘干的(NH4)2SO4溶于IOOmL 0. Imol · Γ1鹽酸(0. 56mL濃鹽酸定容到IOOmL)中即得標(biāo)準(zhǔn)儲備液。把上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用雙蒸水稀釋到Immol · L—1作為母液，然后逐級稀釋為十個濃度點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品分析將瘤胃液取出解凍，按3000r · mirT1的轉(zhuǎn)速離心IOmin以便除去食糜顆粒。離心后吸取0. 2mL上層液(必要時應(yīng)適當(dāng)稀釋)至IOmL塑料管中，先加入1.5mL A液，再加入
1.5mL B液，用渦旋混合儀混勻后放置在75 85°C水浴鍋中反應(yīng)15min。待反應(yīng)完全用冰水冷卻至室溫，用分光光度計在630nm下比色。3. 3揮發(fā)性脂肪酸 以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)用氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸
用5mmol · L-I的巴豆酸作為內(nèi)標(biāo)校正，以乙酸(Acetate，Α)、丙酸(Propionate， P)、丁酸(Butyrate，B)的標(biāo)準(zhǔn)品各自的保留時間來定性，以三種酸的面積與濃度回歸直線方程來定量。然后上樣，建立三種酸的面積與濃度回歸直線方程。(1)試劑配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用5級梯度色譜標(biāo)準(zhǔn)混合建立回歸直線。用移液槍準(zhǔn)確吸取344 μ L乙酸、373 μ L丙酸、184 μ L正丁酸和43. 6mg的巴豆酸置于IOOmL的容量瓶中，用氯仿定容，即得混合標(biāo)準(zhǔn)液。其濃度分別為乙酸60mmol · L—1、丙酸50mmol · L—1、正丁酸20mmol · L—1、巴豆酸5mmol · L—1。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)液依次倍比稀釋， 配制成5級梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合液。酸性吸附劑的配制按重量比30 1 20準(zhǔn)確稱取無水硫酸鈉、50%硫酸(V/V) 及硅藻土混勻而成。配制時先將無水硫酸鈉研碎，然后加入50 %的硫酸，最后加入硅藻土研磨混勻。制備好的酸吸附劑要密封保存，防止吸水變潮，影響測量結(jié)果。(2)色譜分析條件具體為色譜柱為Agilentl9091F_413 HP-FFAP毛細(xì)管柱 (30. OmX320 μ mX0.25 μ m)；柱箱程序升溫，柱箱溫度 140°C (4min)至 240°C (2min), 50 °C (Imin) 0分流比為30 1，進(jìn)樣量為lyL。檢測器FID溫度為250°C。(3)瘤胃液預(yù)處理將瘤胃液取出解凍，在IOOOr ^irT1轉(zhuǎn)速下離心5min。取離心后的瘤胃液上清ImL 至事先加有3mL 0. 5mM%巴豆酸氯仿溶液和2. 4g酸性吸附劑的IOmL具有塞的玻璃管中。 立即加塞，混勻后吸取0. 5mL上清至Agilent GC瓶，準(zhǔn)備測定。3. 4血漿葡萄糖采用BECKMAN全白動生化儀分析。4.試驗(yàn)結(jié)果由表1可得飼喂不同劑量含甘油的酵母培養(yǎng)物，H組丙酸含量顯著高于對照組(P < 0. 05)，H組乙酸丙酸比例極顯著低于對照組(P < 0. 01) ；H組氨氮濃度顯著低于對照組 (P < 0. 05)；實(shí)驗(yàn)組微生物蛋白含量均顯著高于對照組(P < 0. 05) ；H組血漿葡萄糖濃度顯著高于對照組(P < 0. 05)。表1圍產(chǎn)期飼喂含甘油的酵母培養(yǎng)物對山羊瘤胃發(fā)酵和血漿葡萄糖的影響
項(xiàng)目組別CLMH乙酸(mmol/L)38.17 士 5.1239.20 士 5.4038.44 士 5.2438.03 士 4.67丙酸(mmol/L)20.01 ±2.9422.57±2.7721.23±3.7330.43 ±1.04*
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GY1，該菌株分類命名為釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)，2011年1月13日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號CGMCC No. 4551。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GY1，其特征在于所述菌株的 26S rDNADl/D2區(qū)域具有SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，其與Genbank現(xiàn)有釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)同一區(qū)域堿基序列同源性均達(dá)到99%。
3.利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GYl發(fā)酵產(chǎn)甘油的方法，其特征在于過程如下1)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不調(diào)pH，115°C滅菌20min ；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖200，尿素4，玉米漿干粉5，氯化鈉20，硫酸鎂0.5，氯化鈣 0. 1，調(diào)節(jié) pH 5. 0，115°C滅菌 20min ；2)培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng)為搖瓶發(fā)酵，用500ml三角瓶裝種子培養(yǎng)基100ml，將產(chǎn)甘油釀酒酵母 NAU-ZH-GYl接入種子培養(yǎng)基中，300C，150rpm搖床培養(yǎng)M小時；二級種子培養(yǎng)IOL種子發(fā)酵罐裝種子培養(yǎng)基6L，接種量5 %，30°C，150rpm搖床培養(yǎng) 24小時；發(fā)酵罐培養(yǎng)100L全自動攪拌發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基60L，由種子罐流加接種，32°C，接種量 10%，pH 5. 0，300rpm，通氣量 0. 5vvm，培養(yǎng) 48h。
4.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甘油釀酒酵母在發(fā)酵產(chǎn)甘油中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甘油釀酒酵母在生產(chǎn)反芻動物飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種產(chǎn)甘油釀酒酵母NAU-ZH-GY1及其應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，該菌是從未加工的蜂蜜中分離得到，經(jīng)鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏編號CGMCC No.4551。該菌株通過液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)物中富含有甘油，大量酵母活菌，以及豐富的氨基酸、維生素等微生物代謝物質(zhì)，應(yīng)用于反芻動物圍產(chǎn)期飼料添加劑生產(chǎn)，甘油可作為能量補(bǔ)充物緩解能量負(fù)平衡；酵母菌和氨基酸、維生素等微生物代謝物質(zhì)，可調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群，拮抗病原微生物，提高機(jī)體免疫力，并促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化吸收，提高生產(chǎn)性能，將是一種綠色、營養(yǎng)、安全、性價比高的新型飼料添加劑。
文檔編號A23K1/16GK102174421SQ201110057770
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者劉永杰, 劉瑾, 葉耿坪, 朱永興, 李靈恩, 黃克和 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)