專利名稱：一種植物無菌苗培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物無菌苗培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用。特別適合小種子植物，如模式植 物擬南芥、藥用植物黃花蒿、果蔬西紅柿、辣椒等。因排除環(huán)境中其他微生物的干擾，特別適 合于研究植物與微生物相互作用。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)70、80年代以來，隨著分子生物學(xué)的興起，生物學(xué)家開始尋找一種適于 在遺傳及分子生物學(xué)水平做精細(xì)研究的模式植物，十字花科顯花植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)被發(fā)現(xiàn)很適合用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究。近年來植物相 關(guān)研究領(lǐng)域中許多重要發(fā)現(xiàn)，如根的生長、開花、激素調(diào)控及植物對環(huán)境刺激(包括生物因 子、非生物因子)反應(yīng)機(jī)制等，幾乎都是以擬南芥作為實(shí)驗(yàn)材料，因此擬南芥被譽(yù)為植物界 的“果蠅”。擬南芥在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中作為模式植物的地位，是由其特點(diǎn)所決定的生長 周期短(6周左右可產(chǎn)第一粒種子)；植株小、占地少，可采用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化程序培養(yǎng)；產(chǎn)生 種子數(shù)量多、每株每代可產(chǎn)數(shù)千粒種子；全基因組已經(jīng)測序、遺傳背景清楚；有可獲得的一 系列遺傳突變體等。擬南芥在植物科學(xué)相關(guān)研究中越來越受到研究者的青睞。國外文獻(xiàn)廣 泛報道擬南芥可在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)無菌苗，但幾乎都是在以植物凝膠作為凝固劑的培養(yǎng) 基質(zhì)中。植物凝膠(Phytagel agar)是進(jìn)口產(chǎn)品、價格高于普通瓊脂粉的10多倍(瓊脂粉 250g-68. 00元，植物凝膠250g-800. 00元)。另外，擬南芥種子很小(比沙粒還小)、種皮較 薄，在水溶液中容易聚集在一塊。若使用強(qiáng)力消毒劑如0. I1^HgCl2、或如文獻(xiàn)報道的2%次 氯酸鈉溶液，消毒劑會通過種皮滲透進(jìn)去，不易水洗除去，消毒劑殘留會對種子萌發(fā)造成不 良影響，不僅極大地降低出苗率，而且消毒劑殘留可能會干擾后續(xù)植物的生長，不利于研究 擬南芥對環(huán)境因子(如重金屬離子、高鹽等)的反應(yīng)機(jī)制。MS 是 MS 培養(yǎng)基發(fā)明人 Murashige and Skoog 的縮寫。[1’2][l]Murashige T and Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue cultures.Physiol Plant 15(3) :473497.[2]陳因良，陳志宏編著.細(xì)胞培養(yǎng)工程.上海華東化工學(xué)院出版社，P254， 1992.

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)不足而提出的簡便、 高效的植物無菌苗培養(yǎng)方法，成本低廉，無消毒劑殘留，保證后續(xù)科研結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確 性。技術(shù)方案本發(fā)明的一種植物無菌苗培養(yǎng)方法包括種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基 質(zhì)的制備、植物種子表面消毒方法、植物種子萌發(fā)；a.種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基質(zhì)的制備采用組培用瓊脂粉，添加MS大量營養(yǎng)元素母液、MS微量營養(yǎng)元素母液和MS鐵鹽母液，調(diào)pH至5. 8，高壓滅菌121°C，20分鐘，營 養(yǎng)瓊脂凝固后備用；b.植物種子表面消毒方法植物種子置于微型離心管中，先后用75%、95%乙醇 溶液以及無水乙醇消毒、輔以無菌水清洗后，播撒于營養(yǎng)基質(zhì)上；c.植物種子萌發(fā)種子萌發(fā)的營養(yǎng)基質(zhì)制備后分裝于無菌廣口瓶中，每瓶裝 20-25mL，將表面消毒后的植物種子以無菌操作程序播于營養(yǎng)基質(zhì)上；播種后的廣口瓶置組 培間22-23°C，每天16小時光照周期培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)成幼苗。所述的營養(yǎng)基質(zhì)為MS瓊脂，每升培養(yǎng)基質(zhì)添加MS大量營養(yǎng)元素母液40-60毫升、 MS微量營養(yǎng)元素母液4-6mL、MS鐵鹽母液4_6mL，其余為水，調(diào)pH至5. 8 ；再在每升MS培養(yǎng) 液中加入瓊脂粉8g，高壓滅菌，20分鐘，成為MS瓊脂。所述的MS大量營養(yǎng)元素母液為濃縮20倍的MS大量營養(yǎng)元素溶液稱取NH4NO3 :33g ；KNO3 :38g ；CaCl2 · 2H20 :8. 8g ；Mg SO4 ·7Η20 :7. 4g ;KH2P04 :3. 4g ；溶于 800mL d H2O 中，定容至 lOOOmL，即為 MS 大
量營養(yǎng)元素母液。所述的MS微量營養(yǎng)元素母液為濃縮200倍的MS微量營養(yǎng)元素溶液稱取KI 0. 166g ；H3BO3 1. 24g ；MnSO4 · 4H20 :4. 46g ；ZnSO4 · 7H20 :1. 72g ；Na2MoO4 · 2H20 :0. 05g ；CuSO4 · 5H20 :0. 005g ；CoCl2 · 6H20 0. 005g ；溶于 800mL dd H2O 中，定容至 lOOOmL，即為 MS微量營養(yǎng)元素母液。所述的MS鐵鹽母液為濃縮200倍的MS鐵鹽溶液稱取Fe SO4 · 7H20 :5. 56g ；Na2EDTA · 2H20 :7. 46g ；溶于 800mLdd H2O中，定容至lOOOmL，即為MS鐵鹽母液。有益效果本發(fā)明采用無糖MS瓊脂作為培養(yǎng)無菌苗的培養(yǎng)基，在降低成本基礎(chǔ)上 出苗率較高，獲得的擬南芥無菌苗質(zhì)量好，有利于得到準(zhǔn)確可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。再者，因采用 溫和表面消毒劑乙醇，極大減低了消毒劑滲透種皮對胚和胚乳的毒性，從而提高種子萌發(fā) 率。具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)(1)采用無糖MS瓊脂作為培養(yǎng)無菌苗的培養(yǎng)基，在降低成本的基礎(chǔ)上出苗率較 高，獲得的擬南芥無菌苗根系發(fā)達(dá)、莖葉長勢好，而且避免空氣中雜菌污染、蟲咬之虞，有利 于后續(xù)引入實(shí)驗(yàn)處理因子，得到準(zhǔn)確可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)采用溫和表面消毒劑乙醇，在實(shí)驗(yàn)中僅加入不同濃度的乙醇溶液，輔以3-4次 水洗，徹底洗去了消毒劑，降低了消毒劑滲透種皮后對胚和胚乳的毒性，不僅提高種子萌發(fā) 率，而且避免消毒劑殘留(如氯化汞或次氯酸鈉中的Hg2+，Na+)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)(植物抗重金 屬離子、抗鹽性相關(guān)研究)的干擾。(3)在實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的乙醇溶液消毒時，因乙醇溶液比重小于擬南芥種子，種 子容易下沉至微型離心管底，有助于傾倒廢液，更換新的乙醇溶液。(4)末次水洗后的種子，懸浮在0. 15%滅菌瓊脂溶液中，用槍頭吸取種子懸浮液， 均勻播撒于MS瓊脂上[前述方法(ii)]，可獲得很好的萌發(fā)出苗效果，與前述方法(i)[將 消毒種子于無菌濾紙上晾干，用接種環(huán)均勻播于MS培養(yǎng)基]取得的效果相當(dāng)，在實(shí)際操作 中，方法(ii)即0. 15%瓊脂懸浮法，更為簡便、高效、省時。
(5)本發(fā)明技術(shù)還可用于擬南芥突變體eds5，NahG無菌苗的培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)稍有 改良，在前述培養(yǎng)基質(zhì)中加入蔗糖即可。


圖1是本發(fā)明的植物無菌苗培養(yǎng)技術(shù)示意圖。
具體實(shí)施例方式為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的具體實(shí)施方法是a.種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基質(zhì)的制備采用組培用瓊脂粉，添加MS (MS是MS 培養(yǎng)基發(fā)明人Murashige and Skoog的縮寫，下同)大量營養(yǎng)元素母液、MS微量營養(yǎng)元素 母液和MS鐵鹽母液，調(diào)pH至5. 8，高壓滅菌121°C，20分鐘，營養(yǎng)瓊脂凝固后備用；b.植物種子表面消毒方法植物種子置于微型離心管中，先后用75%、95%乙醇 溶液以及無水乙醇消毒、輔以無菌水清洗后，播撒于營養(yǎng)基質(zhì)上；-3-c.植物種子萌發(fā)種子萌發(fā)的營養(yǎng)基質(zhì)制備后分裝于無菌廣口瓶(規(guī)格250mL) 中，每瓶裝20-25mL，將表面消毒后的植物種子以無菌操作程序播于營養(yǎng)基質(zhì)上。播種后的 廣口瓶，置組培間22-23°C，每天16小時光照周期培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)成幼苗。所述的營養(yǎng)基質(zhì)中，每升培養(yǎng)基質(zhì)添加的MS大量營養(yǎng)元素母液40-60毫升、MS微 量營養(yǎng)元素母液4-6mL、MS鐵鹽母液4_6mL，其余為水，調(diào)pH至5. 8，此為MS培養(yǎng)液；再在每 升MS培養(yǎng)液中加入瓊脂粉8g，高壓滅菌，20分鐘，此為MS瓊脂。所述的MS大量營養(yǎng)元素母液為為濃縮20倍的MS大量營養(yǎng)元素溶液稱取NH4NO3 :33g ；KNO3 :38g ；CaCl2 · 2H20 :8. 8g ；MgSO4 ·7Η20 :7. 4g ；KH2PO4 :3. 4g ；溶于 800mL dH20 中，定容至 IOOOmL,即為 MS 大量
營養(yǎng)元素母液(濃縮20倍)。所述的MS微量營養(yǎng)元素母液為濃縮200倍的MS微量營養(yǎng)元素溶液稱取KI 0. 166g ；H3BO3 1. 24g ；MnSO4 · 4H20 :4. 46g ；ZnSO4 · 7H20 :1. 72g ； Na2MoO4 · 2H20 :0. 05g ；CuSO4 · 5H20 :0. 005g ；CoCl2 · 6H20 :0. 005g ；溶于 800mLddH20 中，定容 至lOOOmL，即為MS微量營養(yǎng)元素母液(濃縮200倍)。 所述的MS鐵鹽母液為濃縮200倍的MS鐵鹽溶液為稱取FeSO4 · 7H20 :5. 56g ；Na2EDTA · 2H20 :7. 46g ；溶于 800mL ddH20 中，定容至 IOOOmL,即為MS鐵鹽母液(濃縮200倍)。(1)采用普通瓊脂粉作為MS培養(yǎng)基的凝固劑，并且MS培養(yǎng)基中不加碳源(糖類)， 因?yàn)榉N子的胚乳中含有種子萌發(fā)和幼苗生長所需的全部營養(yǎng)。即采用無糖MS瓊脂作為培
養(yǎng)無菌苗的培養(yǎng)基。(2)擬南芥種子預(yù)先低溫)、避光處理2-3天，以獲得種子萌發(fā)的同步化。將上 述擬南芥種子置于無菌微量離心管(即Eppendorf管，簡稱Ep管)中，先用加有幾滴10% 吐溫-20的75%乙醇溶液ImL處理，脫色搖床上振搖lOmin。然后換用ImL 95%乙醇溶液 消毒三次，每次lmin。無菌水清洗3-4次，加入300 μ L無水乙醇迅速吸出。接下來，(i)將 消毒種子于無菌濾紙上晾干，用接種環(huán)均勻播于MS培養(yǎng)基；或者，(ii)再用無菌水清洗2-3次，去水后，將消毒種子懸浮于0. 15 %瓊脂溶液中，用槍頭吸取種子懸浮液，均勻播撒于MS 培養(yǎng)基上。置植物組培間22-23°C，16小時光照周期培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)成幼苗。所述植物無菌苗培養(yǎng)技術(shù)是針對顯花植物，特別是小種子植物，適于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn) 行植物抗逆性、植物與微生物相互作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究之用；也可用于生態(tài) 學(xué)相關(guān)研究，先在室內(nèi)無菌苗培養(yǎng)，然后移植到溫室土培中，必要時移至大田進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所述植物無菌苗培養(yǎng)技術(shù)特別適用于小種子植物無菌苗培養(yǎng)，因其種子小、種皮 薄，用現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作難于達(dá)到既徹底消毒又無消毒劑殘留之目的，而采用本發(fā)明所述 的無菌苗培養(yǎng)技術(shù)能解決此難題。
權(quán)利要求
1.一種植物無菌苗培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基質(zhì) 的制備、植物種子表面消毒方法、植物種子萌發(fā)；a.種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基質(zhì)的制備采用組培用瓊脂粉，添加MS大量營養(yǎng)元素 母液、MS微量營養(yǎng)元素母液和MS鐵鹽母液，調(diào)pH至5. 8，高壓滅菌121°C，20分鐘，營養(yǎng)瓊 脂凝固后備用；b.植物種子表面消毒方法植物種子置于微型離心管中，先后用75%、95%乙醇溶液 以及無水乙醇消毒、輔以無菌水清洗后，播撒于營養(yǎng)基質(zhì)上；c.植物種子萌發(fā)種子萌發(fā)的營養(yǎng)基質(zhì)制備后分裝于無菌廣口瓶中，每瓶裝20-25mL， 將表面消毒后的植物種子以無菌操作程序播于營養(yǎng)基質(zhì)上；播種后的廣口瓶置組培間 22-23°C，每天16小時光照周期培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)成幼苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物無菌苗培養(yǎng)方法，其特征在于所述的營養(yǎng)基質(zhì)為MS瓊 脂，每升培養(yǎng)基質(zhì)添加MS大量營養(yǎng)元素母液40-60毫升、MS微量營養(yǎng)元素母液4-6mL、MS 鐵鹽母液4-6mL，其余為水，調(diào)pH至5. 8 ；再在每升MS培養(yǎng)液中加入瓊脂粉8g，高壓滅菌， 20分鐘，成為MS瓊脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物無菌苗培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS大量營養(yǎng)元素母 液為濃縮20倍的MS大量營養(yǎng)元素溶液稱取 NH4NO3 :33g ；KNO3 :38g ；CaCl2 · 2H20 :8. 8g ；Mg SO4 ·7Η20 :7. 4g ;KH2P04 :3. 4g ；溶于 800mL d H2O 中，定容至 lOOOmL，即為 MS 大量營養(yǎng)元素母液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物無菌苗培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS微量營養(yǎng)元素母 液為濃縮200倍的MS微量營養(yǎng)元素溶液稱取 Kl 0. 166g ；H3BO3 1. 24g ；MnSO4 · 4H20 :4. 46g ；ZnSO4 · 7H20 :1. 72g ；Na2MoO4 · 2H20 :0. 05g ；CuSO4 · 5H20 :0. 005g ；CoCl2 · 6H20 :0. 005g ； 溶于800mL dd H2O中，定容至lOOOmL，即為MS微量營養(yǎng)元素母液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物無菌苗培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS鐵鹽母液為濃縮 200倍的MS鐵鹽溶液稱取 Fe SO4 ·7Η20 5. 56g ；Na2EDTA ·2Η20 :7. 46g ；溶于 800mLdd H2O 中，定容至 IOOOmL, 即為MS鐵鹽母液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物無菌苗培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用，特別適合小種子植物，如模式植物擬南芥、藥用植物黃花蒿、果蔬西紅柿、辣椒等。因排除環(huán)境中其他微生物的干擾，特別適合于研究植物與微生物相互作用。該方法包括種子萌發(fā)和幼苗生長的營養(yǎng)基質(zhì)的制備、植物種子表面消毒方法、植物種子萌發(fā)；該方法是一種簡便、高效的植物無菌苗培養(yǎng)方法，成本低廉，無消毒劑殘留，保證后續(xù)科研結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。
文檔編號A01H4/00GK102119658SQ201010577478
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者林嵐 申請人:東南大學(xué)