專利名稱：一種鮑魚育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水貝類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鮑魚育苗方法，特別涉及一種利用 光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria, PSB)和芽孢桿菌(Bacillus)提高育苗過程中鮑魚 幼苗成活率的方法。
背景技術(shù)：
鮑魚是傳統(tǒng)的名貴食材，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，素稱“海味之冠”，是海產(chǎn)八珍之一， 也是四大海味之首。近年來，隨著人們生活水平的提高，市場對鮑魚的需求量在增加，鮑魚 育苗也成為了水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中倍受人們關(guān)注的環(huán)節(jié)。但是目前在鮑魚的育苗過程中存在著 很多問題，如水體中致病菌、有害物質(zhì)的大量富集導(dǎo)致幼苗殼長及體重增長緩慢，各種病害 的增加也使得幼苗成活率低，育苗成本增加，從而給養(yǎng)殖戶帶來了消極的影響。流水養(yǎng)殖是較普遍的生產(chǎn)模式，但這種養(yǎng)殖模式對飼料及藥品的耗費都較大，需 要消耗大量的海水及能源，而且一旦出現(xiàn)災(zāi)害性天氣(如雨季_造成低密度海水、風(fēng)暴等) 或海況惡化(赤潮等)，則即使有足夠的設(shè)備也難以保證正常供水，甚至連續(xù)幾天無法抽 水，影響了育苗車間的正常運轉(zhuǎn)。全封閉式養(yǎng)殖雖然耗水少，且不易污染海洋環(huán)境，但不利于廢物的排出，在一定程 度上限制了鮑苗生長率的提高。同時，投資大，運行成本高，不易被廣大養(yǎng)殖戶所接受。各種新型配合飼料的研制和抗生素的使用也是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)較為常用的養(yǎng)殖 模式，但是抗生素的使用會在鮑魚中有殘留，而配合飼料卻見效慢、生產(chǎn)效率低、容易污染 養(yǎng)殖水域，這些都直接影響了育苗的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種能提高鮑魚幼苗免疫力 與成活率的育苗方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種鮑魚育苗方法，包含以下步驟(1)制備復(fù)合菌液分別將光合細(xì)菌和芽孢桿菌活化，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心， 取沉淀，然后用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀，分別得到光合細(xì)菌溶液和芽孢桿菌溶液，將二者 混合，得到復(fù)合菌液；(2)選池培藻對育苗池進(jìn)行消毒處理，加裝遮光裝置和曝氣裝置，在布卵前開始 培藻；(3)布卵與育苗往育苗池中布卵，育苗過程中每過5 40天換一次水，并往養(yǎng)殖 水體中添加營養(yǎng)鹽和步驟(1)制備得到的復(fù)合菌液；(4)采收經(jīng)過培育，剝離稚孢，得到鮑魚苗。步驟(1)中所述光合細(xì)菌為紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.，保藏編 號為CGMCC1. 2193，購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心)或沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris,保藏編號為CGMCC1. 2349，購買于中國普通微 生物菌種保藏管理中心)中的至少一種；所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis(Ehrenberg)C0hn，保藏編號為GIM1. 136，購買于廣東省微生物研究所)；步驟(1)中所述光合細(xì)菌活化的方法為將光合細(xì)菌按體積百分比0. 接種到 RCVBN液體培養(yǎng)基中，于30°C、光照強度為30001x下光照厭氧培養(yǎng)48h，得到活化的光合細(xì) 菌菌液；所述芽孢桿菌活化的方法為將芽孢桿菌按體積百分比0. 接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基中，于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)18h，得到活化的芽孢桿菌菌液；步驟(1)中所述光合細(xì)菌培養(yǎng)的方法為將活化的光合細(xì)菌菌液按體積百分比 10%接種到RCVBN培養(yǎng)基中，光照厭氧發(fā)酵培養(yǎng)48 96h，期間攪拌，然后5000 8000rpm 離心5 15min后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度為108 1012cfu/ml的光合細(xì)菌菌液；所述芽孢桿菌培養(yǎng)的方法為將活化的芽孢桿菌菌液按體積百 分比10%接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)24h，然后5000 8000rpm 離心5 15min后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度為108 1012cfu/ml的芽孢桿菌菌液；步驟(1)中所述復(fù)合菌液是由等菌液濃度等體積的光合細(xì)菌溶液與芽孢桿菌溶 液混合得到；步驟(2)中所述對育苗池的消毒處理是指將育苗池徹底洗刷干凈后，采用質(zhì)量百 分比為10%的高錳酸鉀溶液消毒；步驟(2)中所述加裝遮光裝置是在育苗池上方蓋一層遮光率為60%的黑色遮陽 網(wǎng)，使光照率為3500 50001uX ；所述加裝曝氣裝置是在育苗池池兩邊等距離對稱放置輸 氣管各4條；步驟⑵所述培藻是在布卵前40 45天開始培藻；步驟⑵所述培藻的條件和方法為育苗池水溫控制在15 20°C，均勻投放藻種 到附著基上，將附著基均勻排放在養(yǎng)殖池中培養(yǎng)，曝氣，培藻過程中不斷地將附著基上的老 化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培養(yǎng)十天再布卵，所述附著基為黃色 聚乙烯波紋板。步驟(3)中所述布卵是布鮑魚卵，布卵密度為每立方米水體中布卵10000 30000 粒；步驟(3)中所述營養(yǎng)鹽是指硅藻營養(yǎng)元素(N P Si Fe = 5 1 1 1)， 育苗過程中營養(yǎng)鹽每2 4天添加一次，每次投放量為3 5g/m3養(yǎng)殖水體；步驟(3)中所述育苗條件是光照控制在2200 3000lux，水溫控制在20 25°C ；步驟(3)中所述添加復(fù)合菌液是每次換水后都加入步驟(1)制備得到的復(fù)合菌 液，使水體中混合菌液終濃度達(dá)到102 108cfu/ml ；步驟⑷中所述的培育，其培育時間為35 45天。光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria, PSB)細(xì)胞含有62%蛋白質(zhì)，豐富的VB1、 VB2.VB3和能促進(jìn)動物生長的生物素，而且無毒、易消化，是優(yōu)良的飼料添加劑，有利于增強 鮑魚的免疫功能和抗病力；此外，光合細(xì)菌能凈化氨氮、亞硝基氨及降解有機物，能將養(yǎng)殖 水域的水質(zhì)保持在一個清潔的水平。芽孢桿菌(Bacillus)是常用的益生菌之一，可以抑制 病原微生物的生長。光合細(xì)菌與芽孢桿菌的協(xié)同使用能夠提高水產(chǎn)動物的生長率和成活率，還能夠達(dá)到改善水質(zhì)，減少病害的目的。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明復(fù)合菌液的制備方法簡單，工序少，可有效降低成本。2、本發(fā)明復(fù)合菌液可提高鮑魚的免疫力，使鮑苗成活率顯著提高，同時能促進(jìn)鮑 魚快速生長，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。3、本發(fā)明的鮑魚育苗方法能避免濫用抗生素所帶來的副作用，以及使用配合飼料 所帶來的海水污染問題。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例本發(fā)明的具體實施地點為山東省某育苗場，實施時間85天，試驗地海域的具體水 源水質(zhì)符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)要求，海水經(jīng)過砂濾、沉 淀處理后進(jìn)入養(yǎng)殖池，符合農(nóng)業(yè)部《無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。 鮑魚的養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚內(nèi)，育苗池的規(guī)格為2. 5X2X0. 75m3。育苗依照以下步驟進(jìn)行(1)制備復(fù)合菌液取紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.)(購于中國普通微生物菌種保藏管理中 心，保藏編號為CGMCC1. 2193)，按體積百分比0. 1 %接種到RCVBN液體培養(yǎng)基中，于30°C、光 照強度為30001x下光照厭氧培養(yǎng)48h，得到活化的紅假單胞菌菌液；將活化的紅假單胞菌 菌液按體積百分比10 %接種到RCVBN培養(yǎng)基中，光照厭氧發(fā)酵培養(yǎng)72h，期間加以攪拌，然 后6500rpm離心lOmin后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度 為108 1012cfu/ml的紅假單胞菌菌液；取枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis (Ehrenberg) Cohn)(購于廣東省微生物研究 所，保藏編號GIM1. 136)，按體積百分比0. 接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏 粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0.2，下同)中，于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)18h，得到活化的枯草 芽孢桿菌菌液；將活化的枯草芽孢桿菌菌液按體積百分比10%接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 置于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)24h，然后6500rpm離心lOmin后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸 浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度為108 1012cfu/ml的枯草芽孢桿菌菌液；將等菌液濃度等體積的紅假單胞菌溶液與枯草芽孢桿菌溶液混合，得到復(fù)合菌 液。(2)選池培藻將育苗池徹底洗刷干凈后，采用質(zhì)量百分比為10%的高錳酸鉀溶液消毒，再用水 沖洗干凈。在育苗池上方蓋一層遮光率為60%的黑色遮陽網(wǎng)，使光照率為3500 50001UX， 在育苗池兩邊等距離對稱放置輸氣管各4條。在布卵前45天開始培藻，水溫控制在15 20°C，附著基為黃色聚乙烯波紋板，投 放藻(藻種由山東煙臺龍口黃山館永和育苗場保存并提供)到波紋板上，將波紋板均勻排 放在養(yǎng)殖池中培養(yǎng)，適度曝氣，曝氣量為10 100L/h/m3，培藻過程中不斷地將附著基上的 老化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培養(yǎng)十天再布卵。
(3)布卵與育苗鮑苗為皺紋盤鮑，每池布卵5萬粒。根據(jù)藻的生長狀態(tài)，添加硅藻營養(yǎng)元素(購于 廈門健成水產(chǎn)科技研究所)，2 4天添加一次，每次投放量為3 5g/m3養(yǎng)殖水體。育苗過 程中，光照控制在2200 30001uX，水溫控制在20 25°C，每過5 40天換一次水，每次 換水后都加入步驟(1)制備得到的復(fù)合菌液，使水體中混合菌液終濃度達(dá)到102 108cfu/ ml。(4)采收經(jīng)過40天的培育，此時波紋板上的藻類已部分老化，少數(shù)板上的藻已被吃光，稚 鮑體長已長至3. 89-5. 69mm，前期育苗結(jié)束，將稚鮑從波紋板上剝離。試驗結(jié)束時分別進(jìn)行鮑魚苗的生長指標(biāo)，免疫力相關(guān)酶指標(biāo)的檢測。育苗階段采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，分為3個試驗組(A C)，每組2個重復(fù)。三個 實驗組的分配如下A組采用流水育苗，勻速流水，日換水量為池水量的2倍，不添加菌液；B組不流水，不加菌液，定期換水；C組不流水，定期換水，且每次換水之后向育苗水體中加入不同濃度的復(fù)合菌 液。B組分為B1 B8組，其中B1組為不加菌液，5天換一次水；B2組為不加菌液，10天換一次水；B3組為不加菌液，15天換一次水；B4組為不加菌液，20天換一次水；B5組為不加菌液，25天換一次水；B6組為不加菌液，30天換一次水；B7組為不加菌液，35天換一次水；B8組為不加菌液，40天換一次水。C 組也分為 C1 C8 組，C1 再分為 Cl-1，Cl-2，Cl-3，C1-4 組；C2 則分為 C2-1， C2-2, C2-3, C2-4 組；C3 分為 C3-1，C3-2，C3-3，C3-4 組...C8 分為 C8-1，C8-2，C8-3，C8-4組。C1，C2，C3. . .C7，C8同B組的換水頻率，分別指以5天，10天，15天.. 35天，40天 換一次水。而C1分成的四組Cl-1，Cl-2，Cl-3，C1-4分別指代以下的設(shè)置組C1-1 5天換水，加入102cfu/ml的復(fù)合菌液；C1-2 5天換水，加入104cfu/ml的復(fù)合菌液；C1-3 5天換水，加入106cfu/ml的復(fù)合菌液；C1-4 5天換水，加入108cfu/ml的復(fù)合菌液。同理C2-1 10天換水，加入102cfu/ml的復(fù)合菌液；C2-2 10天換水，加入104cfu/ml的復(fù)合菌液；C2-3 10天換水，加入106cfu/ml的復(fù)合菌液；C2-4 10天換水，加入108cfu/ml的復(fù)合菌液。
.........C8-1 40天換水，加入102cfu/ml的復(fù)合菌液；C8-2 40天換水，加入104cfu/ml的復(fù)合菌液；C8-3 40天換水，加入106cfu/ml的復(fù)合菌液；C8-4 40天換水，加入108cfu/ml的復(fù)合菌液。一、鮑魚苗的生長指標(biāo)檢測測定方法如下(1)平均殼長的測定每組中隨機抽取50粒鮑苗，采用精密度為1mm的游標(biāo)卡尺
度量測量殼長，取平均值。(2)殼長平均日增長量收苗平均殼長，取40天的平均值。(3)鮑苗平均個體重量隨機抽取50粒鮑苗，稱其總重后取平均值。(4)收苗量稱取5g鮑苗，計算其粒數(shù)，將收集的鮑苗稱其總重，后估算鮑苗的粒 數(shù)。(5)成活率試驗結(jié)束時鮑苗量占該階段投苗量的百分率。結(jié)果如下表一流水工業(yè)生產(chǎn)A組與對照組B組生長指標(biāo)的檢測
權(quán)利要求
一種鮑魚育苗方法，其特征在于包含以下步驟(1)制備復(fù)合菌液分別將光合細(xì)菌和芽孢桿菌活化，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心，取沉淀，然后用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀，分別得到光合細(xì)菌溶液和芽孢桿菌溶液，將二者混合，得到復(fù)合菌液；(2)選池培藻對育苗池進(jìn)行消毒處理，加裝遮光裝置和曝氣裝置，在布卵前開始培藻；(3)布卵與育苗往育苗池中布卵，育苗過程中每過5～40天換一次水，并往養(yǎng)殖水體中添加營養(yǎng)鹽和步驟(1)制備得到的復(fù)合菌液；(4)采收經(jīng)過培育，剝離稚孢，得到鮑魚苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(1)中所述光合細(xì)菌為紅假單胞菌Rhodopseudomonas sp.或沼澤紅假單胞菌 Rhodopseudomonas palustris 中的至少一種；步驟(1)中所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(1)中所述光合細(xì)菌活化的方法為將光合細(xì)菌按體積百分比0. 接種到RCVBN 液體培養(yǎng)基中，于30°C、光照強度為30001x下光照厭氧培養(yǎng)48h，得到活化的光合細(xì)菌菌 液；步驟(1)中所述芽孢桿菌活化的方法為將芽孢桿菌按體積百分比0. 接種到營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基中，于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)18h，得到活化的芽孢桿菌菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(1)中所述光合細(xì)菌培養(yǎng)的方法為將活化的光合細(xì)菌菌液按體積百分比10% 接種到RCVBN培養(yǎng)基中，光照厭氧發(fā)酵培養(yǎng)48 96h，期間攪拌，然后5000 8000rpm離 心5 15min后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度為108 1012cfu/ml的光合細(xì)菌菌液；步驟(1)中所述芽孢桿菌培養(yǎng)的方法為將活化的芽孢桿菌菌液按體積百分比10%接 種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C、250rpm搖床培養(yǎng)24h，然后5000 8000rpm離心5 15min后取沉淀，用磷酸鹽緩沖溶液懸浮沉淀獲得處于對數(shù)生長期的濃度為108 1012cfu/ ml的芽孢桿菌菌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(1)中所述復(fù)合菌液是由 等菌液濃度等體積的光合細(xì)菌溶液與芽孢桿菌溶液混合得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(2)中所述對育苗池的消毒處理是指將育苗池徹底洗刷干凈后，采用質(zhì)量百分比 為10%的高錳酸鉀溶液消毒；步驟(2)中所述加裝遮光裝置是在育苗池上方蓋一層遮光率為60%的黑色遮陽網(wǎng)，使 光照率為3500 50001UX ；所述加裝曝氣裝置是在育苗池池兩邊等距離對稱放置輸氣管各 4條。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(2)所述培藻是在布卵前40 45天開始培藻；步驟⑵所述培藻的條件和方法為育苗池水溫控制在15 20°C，均勻投放藻種到附著基上，將附著基均勻排放在養(yǎng)殖池中培養(yǎng)，曝氣，培藻過程中不斷地將附著基上的老化藻 搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培養(yǎng)十天再布卵，所述附著基為黃色聚乙 烯波紋板。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(3)中所述布卵是布鮑魚卵，布卵密度為每立方米水體中布卵10000 30000粒； 步驟(3)中所述營養(yǎng)鹽是指硅藻營養(yǎng)元素，育苗過程中營養(yǎng)鹽每2 4天添加一次，每 次投放量為3 5g/m3養(yǎng)殖水體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(3)中所述育苗條件是光照控制在2200 30001uX，水溫控制在20 25°C ； 步驟(3)中所述添加復(fù)合菌液是每次換水后都加入步驟(1)制備得到的復(fù)合菌液，使 水體中復(fù)合菌液終濃度達(dá)到102 108cfu/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑魚育苗方法，其特征在于步驟(4)中所述的培育，其培 育時間為35 45天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鮑魚育苗方法。該方法是在育苗過程中，每過5～40天將養(yǎng)殖水體更換一次，并同時向養(yǎng)殖水體中添加由光合細(xì)菌和芽孢桿菌組成的復(fù)合菌液，使水體中復(fù)合菌液終濃度達(dá)到102～108cfu/ml。本發(fā)明的方法能提高鮑苗的免疫力，使鮑苗成活率顯著提高，同時能促進(jìn)鮑魚快速生長，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，從而克服了目前流水養(yǎng)殖模式對能源和資源的巨大耗費、全封閉養(yǎng)殖中鮑苗生長率不高、采用配合飼料和抗生素飼養(yǎng)所造成的養(yǎng)殖水域污染，抗生素在鮑魚中殘留等問題。
文檔編號A23K1/18GK101946734SQ20101027076
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者李娜, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)