專利名稱:小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于竹類組織培養(yǎng)技術(shù),具體地說是涉及一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組 合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
/jN^tt (Drepanostachyum Luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f. )
亞科鐮序竹屬竹種,又名“藤竹”,是中國特有種,在《中國物種紅色名錄》中被列為極危種。 目前只在貴州的羅甸、平塘及長順有栽培或有野生分布,常成片生長于海拔600 1000m的 石灰?guī)r裸露石山上。它的竹材柔韌可編涼椅和農(nóng)具,也可作為造紙?jiān)?;形態(tài)優(yōu)美,是良好 的園林綠化竹種,并在環(huán)境惡劣的喀斯特地區(qū)生長良好,能耐干旱和瘠薄,對增強(qiáng)土壤的固 土、保水、保肥能力效果十分顯著,是喀斯特地區(qū)的適生性物種,在喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中對水 源涵養(yǎng)、水土保持、養(yǎng)分平衡等生態(tài)功能發(fā)揮著重要作用,具有很高的生態(tài)效益。竹類的生殖周期長,很少開花結(jié)實(shí),難以獲得大規(guī)模繁殖的種子。而傳統(tǒng)的移竹、 埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗種竹多、種苗運(yùn)輸不便、勞動強(qiáng)度大、繁殖系數(shù)低等問 題。采用組織培養(yǎng)的方法效率高,條件可控,生長快,周期短,重復(fù)性強(qiáng),可進(jìn)行周年試驗(yàn)或 生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),可以快速繁殖苗,適合竹子的工廠化育苗。迄今為止,國內(nèi)外竹子組織培養(yǎng)工作取得了很大的進(jìn)展,但還是存在著許多的問 題,培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合就是關(guān)鍵問題。培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最重要的 基質(zhì),選擇合適的培養(yǎng)基對培養(yǎng)成功與否關(guān)系很大。目前適合不同外植體組織培養(yǎng)的基礎(chǔ) 培養(yǎng)基多達(dá)數(shù)十種,人們針對不同外植體材料的生物學(xué)特性和培養(yǎng)目的,設(shè)計(jì)建立了各種 類型的培養(yǎng)基,目前常用的類型有MS、N6、sH、ws等培養(yǎng)基,這些培養(yǎng)基均是在植物組織培 養(yǎng)發(fā)展過程中,根據(jù)人們的認(rèn)識和培養(yǎng)的需要,不斷改進(jìn)產(chǎn)生的。大量研究表明,竹子組織 培養(yǎng)較為適用的培養(yǎng)基主要為MS培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基。植物生長調(diào)節(jié)劑對植物組織培 養(yǎng)的誘導(dǎo)與分化過程具有重要作用。用于組織培養(yǎng)誘導(dǎo)階段誘導(dǎo)與分化的植物生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)通常為細(xì)胞分裂素和生長素,細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化,延遲組織衰老,促進(jìn)側(cè)芽 生長,常用的有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)和KT(6-糠氨基嘌呤);生長素主要誘導(dǎo)愈傷組織 的形成,體細(xì)胞胚的發(fā)生及試管苗的生根,常用的有2,4-D(2,4-二氯苯基乙酸)、NAA(萘 乙酸)和IBA(吲哚丁酸)等。同一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同濃度及不同植物生長調(diào)節(jié) 物質(zhì)間的配比對植物的誘導(dǎo)與分化會產(chǎn)生重要影響,提高細(xì)胞分裂素的濃度有利于芽的誘 導(dǎo),提高生長素的濃度有利于組織和器官的生長。因此,探索細(xì)胞分裂素和生長素的優(yōu)選組 合,保證試管苗既有較高的增殖率又有較好的長勢,對于提高種苗質(zhì)量和實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn) 具有很重要的意義。目前國內(nèi)對小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落結(jié)構(gòu)、多樣性、水土保持功能、土壤 種子庫、葉面積指數(shù)以及其栽培技術(shù)研究應(yīng)用等領(lǐng)域,而在組織培養(yǎng)方面的研究還是空白。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應(yīng) 用,以克服小蓬竹繁殖困難,誘導(dǎo)難的問題。上述目的可通過如下措施實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物,是由基本培養(yǎng)基MS、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瓊脂 和蔗糖配制而成,所指誘導(dǎo)培養(yǎng)基為細(xì)胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物,在每 升的MS基本培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA l-5mg,或同時含細(xì)胞分裂素6_BA l_5mg與激動 素KT 0. 5mg,含瓊脂7g,含蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。試驗(yàn)證明,當(dāng)所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA 3mg, 含瓊脂7g和含蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8時,小蓬竹組織培養(yǎng)的成活率最高。同樣試驗(yàn)證明,當(dāng)所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA 2mg和激動素KT 0. 5mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8時,小蓬竹 組織培養(yǎng)的成活率也很好。將所述的培養(yǎng)基組合物用于小蓬竹的組織培養(yǎng),培養(yǎng)條件溫度25 27°C,光照 時間12h/d,光照強(qiáng)度1200Lx。本發(fā)明的有益效果是解決了小蓬竹繁殖困難,克服了傳統(tǒng)的母竹移栽、竹鞭移栽 等繁殖方法耗費(fèi)資源、對生境破壞大、培植時間長、效率低、運(yùn)輸成本高等缺點(diǎn),且不受季節(jié) 的限制,為小蓬竹大面積的推廣與利用,充分發(fā)揮其生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益提供了快速且充 足供應(yīng)的有效途徑。本發(fā)明所述的“MS培養(yǎng)基”是指Murashige和Skoog研制的培養(yǎng)基,其成分配方見表1。本發(fā)明所述的“1/2MS培養(yǎng)基”和“1/4MS培養(yǎng)基”是指大量元素用量分別為MS培 養(yǎng)基中大量元素用量的1/2量和1/4量,其他成分用量與MS培養(yǎng)基相同。表IMS培養(yǎng)基成分 以下通過具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合較佳實(shí)施例,對依據(jù)本發(fā)明提出的一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物 的具體實(shí)施方式
、特征及其功效,詳細(xì)說明如后。一、試驗(yàn)材料供試的材料采自從羅甸移栽于貴州大學(xué)苗圃、成活了的且生長健壯 的小蓬竹植株,外植體選用當(dāng)年生枝芽飽滿的半木質(zhì)化枝條。二、試驗(yàn)方法小蓬竹組織培養(yǎng)過程按以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)基的配制和滅菌,本發(fā)明試驗(yàn)所用的 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基組合物,是由基本培養(yǎng)基MS、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成,所指誘導(dǎo) 培養(yǎng)基為細(xì)胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物,在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細(xì) 胞分裂素6-BA l_5mg,或同時含細(xì)胞分裂素6-BA l_5mg與激動素KT 0. 5mg,含瓊脂7g,含 蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。本發(fā)明試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基以基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS或1/2MS和1/4MS為參照對比試驗(yàn)效 果,所述1/2MS和1/4MS是指MS中大量元素用量分別為MS基本培養(yǎng)基中大量元素的1/2量或1/4量,其他成分用量與MS相同。 本發(fā)明試驗(yàn)所用的細(xì)胞分裂素6-BA,化學(xué)名稱6_芐氨基嘌呤,分子式為C12H11N5, 本發(fā)明試驗(yàn)所用的激動素KT,化學(xué)名稱N6-呋喃甲氨基嘌呤,分子式=CltlH9ON5結(jié)構(gòu)式 培養(yǎng)基組合物試驗(yàn)共做10個,試驗(yàn)序號分別為1-10,每個培養(yǎng)基組合物是在1升 的MS基本培養(yǎng)基溶液中加入不同量的6-BA,或不同量的6-BA和KT,在相同試驗(yàn)條件下測 定外植體成活率,如表3,與相同條件試驗(yàn)的基本培養(yǎng)基MS或1/2MS或1/4MS成活率結(jié)果如 表2比較。1、培養(yǎng)基配制后在24h內(nèi)必須進(jìn)行滅菌,通常采用的滅菌方法為高壓滅菌法,其 原理是通過加熱,在密閉的高壓鍋內(nèi)隨著水蒸氣壓力的不斷上升,使水的沸點(diǎn)不斷提高,從 而鍋內(nèi)溫度也隨之升高。2、外植體的處理和消毒小蓬竹外植體采用生長健壯的半木質(zhì)化枝條,用洗潔精溶液浸泡30min,然后 用自來水浸泡30min,流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生,用濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺上把已 沖洗干凈的外植體浸入75%酒精中消毒lmin,用無菌水沖洗3 4(期間不斷搖動)次后, 采用0. 升汞溶液處理外植體10分鐘,無菌水沖洗5次,用無菌濾紙吸干表面水分,剪取 長約1. 5cm帶芽的節(jié)枝,將外植體接種到上述MS、1/2MS、1/4MS和試驗(yàn)序號1_10培養(yǎng)基上。3、外植體接種無菌操作實(shí)驗(yàn)室中使用的無菌操作設(shè)備是超凈工作臺。接種前應(yīng)進(jìn)行地面的清潔 衛(wèi)生工作,用75%乙醇噴霧噴灑接種室,擦拭超凈工作臺臺面,培養(yǎng)皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺上,一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手,操作中要 經(jīng)常用酒精擦洗手。不準(zhǔn)講話,亦不準(zhǔn)對著操作區(qū)呼吸,以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養(yǎng)基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶,放入95%的酒精,以便對操作工 具進(jìn)行消毒。在無菌操作時,把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具,待冷卻后在酒精燈附近打開培養(yǎng)基瓶口,立即將所取 的外植體迅速置入固體培養(yǎng)基中。在接種時,不能用生銹的解剖刀,動作要敏捷,隨切隨接, 減少傷口在空氣中暴露的時間。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下,再將蓋子也在火焰上 燒一下,然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。4、培養(yǎng)條件溫度25 27°C,光照時間12h/d,光照強(qiáng)度1200Lx。表2不同濃度基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)結(jié)果 表3在一升基本培養(yǎng)基中加不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基及培養(yǎng)結(jié)果 三、觀察試驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果分析小蓬竹外植體最優(yōu)消毒方法為0. 升汞處理lOmin。由表2可以看出,不同類型的誘導(dǎo)培養(yǎng)基本培養(yǎng)基對小蓬竹成活率的影響不同。 采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基時,芽的成活率可達(dá)到73. 0%;1/2MS培養(yǎng)基的成活率較低,為 27.0% ;1/4MS培養(yǎng)基的成活率最低,僅為23.0%。綜合以上數(shù)據(jù)可知,足夠的大量元素是 外植體誘導(dǎo)的保障,誘導(dǎo)小蓬竹外植體的最佳基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。由表3可以看出,在一升MS培養(yǎng)基中不加入KT時,隨著6-BA濃度的升高,芽的 成活率增高,當(dāng)6-BA濃度為3. Omg/L時,成活率最高,若6-BA濃度再升高,則成活率下降; 當(dāng)在一升MS培養(yǎng)基中加入含量為0. 5mg/L的KT時,成活率在6-BA濃度為2. Omg/L時達(dá) 到最高,為89. 7 %,繼續(xù)提高6-BA濃度則成活率呈下降趨勢,說明KT對小蓬竹的誘導(dǎo)具 有促進(jìn)作用,但促進(jìn)效果沒有6-BA顯著。綜合考慮如上試驗(yàn)結(jié)果可知,適宜小蓬竹誘導(dǎo) 的培養(yǎng)基為上述10種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA3. Omg/L和6-BA2. 0mg/L+KT0. 5mg/L,最佳為 MS+6-BA3. 0mg/L。以上所述,僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并非對本發(fā)明作任何形式上的限制,任 何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容,依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修 改、等同變化與修飾,均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物,其特征是是由基本培養(yǎng)基MS、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成,所指誘導(dǎo)培養(yǎng)基為細(xì)胞分裂素6 BA或6 BA與激動素KT的混合物,在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6 BA1 5mg,或同時含細(xì)胞分裂素6 BA 1 5mg與激動素KT 0.5mg,含瓊脂7g,含蔗糖30g;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5.8。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合物,其特征是所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培 養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA 3mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合物,其特征在于所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本 培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA 2mg和激動素KTO. 5mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ;培養(yǎng)基組合 物溶液pH值5. 8。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合物的應(yīng)用,其特征在于將所述的培養(yǎng)基組合物用 于小蓬竹的組織培養(yǎng),培養(yǎng)條件溫度25 27°C,光照時間12h/d,光照強(qiáng)度1200Lx。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應(yīng)用,是由基本培養(yǎng)基MS、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成,所指誘導(dǎo)培養(yǎng)基為細(xì)胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物,在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細(xì)胞分裂素6-BA 1-5mg,或同時含細(xì)胞分裂素6-BA 1-5mg與激動素KT0.5mg,含瓊脂7g,含蔗糖30g;培養(yǎng)基組合物溶液pH值5.8;用于小蓬竹的組織培養(yǎng),培養(yǎng)條件溫度25~27℃,光照時間12h/d,光照強(qiáng)度1200Lx。本發(fā)明填補(bǔ)了小蓬竹組織培養(yǎng)快速繁殖的空白,為小蓬竹的園林栽種、大面積綠化、喀斯特石漠化的恢復(fù),奠定了迅速且充足供應(yīng)的基礎(chǔ),為小蓬竹的工廠化大規(guī)模生產(chǎn)提供了可行的方案。
文檔編號A01H4/00GK101926286SQ20101026879
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者何緒, 劉濟(jì)明, 孫運(yùn)剛, 廖小鋒, 張東凱, 徐國瑞, 徐雪嬌, 李敏進(jìn) 申請人:貴州大學(xué)