專利名稱：大黃魚β-肌動蛋白啟動子序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種啟動子，尤其是涉及一種大黃魚β -肌動蛋白(beta-actin)啟動 子序列及其應用。
背景技術：
Beta-肌動蛋白的5，端調控序列(英文名Beta-actin 5，-regy Iatory sequence)。肌動蛋在真核生物中廣泛存在，是構成肌小節(jié)和細胞骨架的主要成分([1] SHETERLINE P, SPARROWJ. Protein profile actin[Μ]. London =London Academic Press。 1994 1-62)。單體肌動蛋白為球蛋白，一般由375 377個氨基酸殘基組成，分子量約為 42000。肌動蛋白具有重要的生理功能，幾乎參與了真核細胞的所有生理過程([2]TOLCH M D。 H0LTZMAN D A, DRMBIND G. The yeast actin cytoskcleton[J]. Cμ rr Opin Cell Biol, 1994,6 110-119 ； [3]STAIGERC J, SCHLIffA M. Actin localization and function in higher plants [J]. Protoplasm, 1987,141 :1-2)，如細胞分裂、染色體運動、細胞器運 動、細胞激化、胞質流動等。高等動物細胞內的肌動蛋白分為α，β，Y三類([4]MIWA Τ, MANABE Y, KMROKAffA K, et al. Str μ ct μ re, chromasome location, and expression of the human smooth my scle (enteric type) - y -actin gene :evol μ tion of six human actin genes [J], Mol Cell Biol, 1991,11 =3296-3306) 肌動蛋白非常保守，各種生物間 氨基酸序列的同源性(Identity)高達 70% 以上([5] HM S. YAN L. Actin ande μ karyotic evoly tion[J].Acta Zoolngi—Ca Sinica. 1999. 45 :440_447)，在魚類中 β-肌動蛋白的 同原性更高。自20世紀80年代Perler建立了氨基酸取代與保守蛋白基因進化年代的線性 關系后，β-肌動蛋白作為一種進化上的分子標記被廣泛采用([6]PERLER F,EFSTRATIADIS A,LOMEDICO P,et al. The evolμ tion of genes :the chicken preproins μ Iin gene[J]· Cell,1980, 20 555~566 ； [7]HWANG G，RAHMAN M A，RAZAK s，et al.Isolation and characterization oftilapia β —actin promoter and comparison of its activity with carp β-actin promoter[J]. BiochimieaBiophysiea Acta, 2003,1625 :11_18 ; [8] TAKAGI S, SASADO T, TAMIYA G,et al. An efficientexpression vector for transgenic medaka constr μ ction [J]. Mol Mar Biol Bioteehnol，1994，3 :192-199 ; [9] w μ J，LIM T, HE F. A discussion about the genesis and existing significance of intronsin animal genes[J]. Acta Genefica Sinica, 1998，25 :409_415 ; [10]ZHOM R，LIM L，GM0Y，et al.Similar gone str μ ct μ re of two Soxga genes and their expression patterns d μ ring gonadaldifierenti · ation in a teleost fish, rice field eel(Monopter μ s alby s) [J]. Mol Reprod Dev，2003，66 (3) :211_217) β-actin啟動子序列能高效，穩(wěn)定，廣 泛的啟動活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供大黃魚肌動蛋白啟動子序列。
本發(fā)明的目的之二在于提供大黃魚肌動蛋白啟動子的克隆方法。本發(fā)明的目的之三在于提供大黃魚肌動蛋白啟動子的應用。本發(fā)明所述大黃魚β -肌動蛋白啟動子序列為CTGGGCCCACCTTTTTTAATTTATTTATATTTCCTTATCACAGAAATGCAGCTTTATCATGAATTTAAA GTTTTAGGGCTGACAGGTTACACAGGTACAAATAAAGTTTGAGATTTGACCCTTAATGGTGCGATTAAAGACCTGTA AATCAATAAGTGGGCCCAGTAGACCTTTGGTCCCCCTTCCTCATGTCCATAAACTAACTGAGAGCGTCTATATGAGC ACAGAGTCAAACTCAAGATCTGAAATATGTTACACAAGTCATTGTCAGCTTTCCACATGATAAAAGTCACTGAGGTG ACTCTAATTTAAAGGGGGGAGGTCACACGACAACAATAATGTCCTTTTAAAGTCAACTGCAACAGCATGAATGAACACGAGGAAAAGAAGAAAGAGAG AGAGAAAAAAACTGATACATAGGAGTTGATGCAACTGAGAGGAAAGGGAAGTGGTAAAGGAGGAACAGAAGAAGTT GCTGAATGTCTCAGGGTGTGCAGTTAAAGCTTTTAAATGGCACCGAGGGCCGCCCAGTCATTCAAACACTCATGG TTTAGGGGCATAAAACGTATAAAAGTGTGCGCCAGATGTTATATATTAAAAGAAAGATGGGTAGAAGATAGATGG TGGACGTATGGGAGAGGTGGGAAGGGGCTTAAAGAAAGAAGAAATTCATTTCACTGCAGCATAATTAATGATAATGATTTAGTGAATCAAGAATGTA AATTTTTTACAAGCCTAGCCTAAAAATCTTTAGTCTGAGATTGTGTCACATGGGCCTCATTAGTCAGGATGTGAATG CCCCCCAAtGCTTTCCACTTTTACGGTaATGCAGCACAATCAGGAAGTGGTACTAGGAGTGGTGTGTGTCTTATGTG TGTGTTTTATTTAATAAAGAGATGTTAAACCAAGGAGATAAAGGCCAGCACGTCCTGTTTCATGACATAGCCATATGATTGAACGGTGGCTGAAAC AGCAACTGAAAACCCCTGGGGTACTTTCACTCATCTAAGAAGAGGGTAAACTCTCCTTTTAACACAACATCTAGTGC ACTGCAAGCAGTCCATGCTACCAAATAACATCCTGTATCTGAAGGCAGTGAACGAGCAGAGATATTCAGGAGGACAT GTGGCCACAAAGCACAAATACTTGATCAATAAATCAACATTATCAGCGAGCTGGCCTACAGTAAGTGCCTCAGCCTG TGTCTTAGCCTGTGGCAGCTTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTATGTATGTCATGTGTTTGACCCGGTGATGCA GTCCCA CTGAACTGTTTTTTGTTGTTTTTTTCAAAGCAACATCAGCATCAACACCAACAACCTACTGTCATGTCTG AAATACATCAAATAATGTGAGATTAATTAAGATATAGGCTTTAGGACGACAGCAGGGAGGAGTCCTGGGTGCAAAGC TCTTCCAGTTATCATAGAAGTATGAGTCTTAGAGCAGGTGCAGGCAGGCGCGTTCACACGTATTAAAGTTTATATAT CATTTAAAATGTATATAACACAGTATATGAAGAGATTAAGCTCACTAGGCCT CACAGCATCAATCCCTTCCCTCTTCTTCTCTCCAATCCTTCGCTATCATCGCCTCCCTCTCTCTCTCTG TCCCTCAAATCGCGAGCGCCCAGTGCACCACAGCGTGCACGCGACGTGCCCCAGTGCATGACGCCGGACCAATCAGAGAGCGC CATTCCGAAAGTTTACCTTTTATGGCTAGAGCCGGGCAACTGACGCGGTATAAAAGGCGAGCGCCCACAGCCAACA GATTCACTCTGAGCGCCGTCACACGCAGCTTTGTGCGGGATATCATTTGCCTGAAACCGGTTCCCTTAAAGCGAAAAGCCCCCCCA CCCAAAGGTAAGAAGGACTGAAAACATTTGCATTTTTCTAATTTTGGAACGATATTCATCAAGTAAACAATGAGTTG AGTTGTTTTTTGACTGTAGCCGTTGACGAAATTTGTGAATTTGAATATAAAAGATGGCGTGGACCACGAGGGTCTTT GTCTTGGCATTACACCACTGTACTGCTAATTTAAATTAAATTTAAAAAAAGATGTAATGATTAAAAACTGTCAGATT CTGCTTGTCTTATAATGAATGCAGTATTAACGATCAGAAACCGTTATTAACCGTTGCCATTAACTGGCGACAGGTGC CTTTTTTTTTTTACCGGCTTATAATAATGAAAGTGAACGTTCGTCTACAAATTAGACTGTCAGCGTGTAGTTGTGCA ACATTTTGCTGTCTTACCTCCTTCCCCCTCCTCCACCTCTTCCACCCAAGCAAGTATTTAGTTTTTGAAAGAGGCTT TTGAGTTGAGGTCGTCTGGATCCCGGCTGCTCCCTCCTTTGTGCGCCCGATGCGGCGGGGTGTGACCTACTTTAGCATATTAGCCTAGCCACGCCAGGCTAaCGCCGCCcTTCAGACtTTGAAGCAAAATACTAAAAACAAGATTtCCTcCCTT CATGCACACTGGAGGGAGGCTCTTTAAATGCCTCAtTTTCTTAAGAATAATTCATTCACTTTTAAAGTGGAAGTCTT TATAAAGACTCAAGTACATGAGGCCTCTAAAAAAAAAGCACTAATTGTTTAAACTAACAAACGGTTTTGCTGTGATT TTGTCTTTTCACGGCTCACTTGTAAAAAAAAAAAAAGGGTAAATTTCGAGTGACTACTCTTTTAGAAAAGGCGTGGC TTTCAGGAAATGGGAGCATCAGTCAAGGACTTGTGACCATTCATGAGTCAACACGAGTTCATTATGCAACTTTTTAT TTCTCTCTCTCATAACGCAACCCCCAACGGCTGATTTTTGAAAAATGTCCGTTACAGCCTGGCAGCGGTGTCAATGA ATGAAAGCGGCTGGTTATGACGCAGTGGTATTGAAGCGAGGCGTTCTTGTCGGGTATCAAACCCCAGTGATTGAGCA ACAATAGGAGGGTGGGGTGGTTGGGGGGTGGGGGGGGTATATCTGGAGGAAGTTAACTGTAGTGGGAGTGGTCGCGA GGCGCCGGGTCTGATAATGTCGAATGTACGCTCTGGCCGCGCGCCATGGCGCCGGTAGCCGCAAAGCTGCTCAAAGC CCGAACCATGTCCTTATATGGTAATAACAGAATGCAGCGCCACTTTTTGTCTGGCTTCGCGCGGAATGTGGCGGCAC GAGCGCCACCCAGTGGTTGAGCGCGTGAACTGCCTTTAGGATTTTTTATTTTTTTTAAACAGGAAGTGGGAGCTCGA GTCGGGCTGATGTTGGGAGGAAGTGAATGTAAGACTCTTTGCAGTGTCTTTAACGGGTTTTTGTTTTTTGTCTTATC AACAGTTCAGCC。本發(fā)明所述大黃魚β-肌動蛋白啟動子的克隆方法，包括以下步驟一、大黃魚beta-actin 5，調控序列分離1)米用 Clontech 公 司(www. Clontech. com)的 Genomeffalker Universal Kit (CatalogNo. 638904)構建酶(Dra I，EcoR V, Pv μ II & St μ I)四個 DNA 核酸內切酶 庫；具體操作為(1)基因組純度分析A 取1 μ 1基因組DNA在0. 6 %的瓊脂糖凝膠上電泳；B:用 Dra I 酶去試切，體系為5 μ 1 實驗基因組 DNA，1. 6 μ 1 Dra Ι，2μ1 IOXDra I 1311 61~，11.4“1雙蒸餾無菌!120，總體系為2(^1 ；(2)基因組酶切消化A 標記5個1. 5ml的EP管DL1，DL2，DL3，DL4和一個陽性對照；B 加入酶切體系，組分為25μ 1基因組DNA(0. lyg/μ 1)，8μ 1限制內切 酶(lOunits/μ 1)，10μ 1限制內切酶buffer (10 X)，57 μ 1雙蒸餾無菌H2O,總體系為
100μ 1 ，
C輕柔混合均勻，并瞬時離心，37°C消化2h ；
D低速渦旋5 IOs并瞬時離心，37度。C過夜消化；
(3)基因組純化。
A在每一個反應管中加入等體積的苯酚；
B低速渦旋5 IOs并瞬時離心；
C把上層水相轉移至另外一個1. 5ml EP管中，并加入等體積的氯仿；
D低速渦旋5 IOs并瞬時離心，轉移上層水相至另外一個新的EP 1豪中，并向水相中加入2倍體積冰冷的95%的乙醇，1/10體積的乙酸鈉(PH = 4. 5)和20 μg的糖苷
E低速渦旋 5 IOs 并離心(14000rpm, 15min，4°C )；
F棄上清并用100 μ 1冰冷的80%乙醇洗滌，離心(14000rpm，10min,4°C )
G棄上清并在空氣中干燥后用20 μ 1 ΤΕ(10/1ρΗ = 7. 5)溶解；
7
(4) Adaptor連接到消化后的基因組上A 連接體系4 μ 1消化并純化后的基因組DNA，1. 9 μ 1 Genome Walker Adaptor (25 μ Μ)，1· 6 μ 1 連接 buffer (10 X)，0· 5 μ 1 Τ4 DNA 連接酶(6units/ μ 1)；B:連接條件16°C過夜連接；C 終止連接條件70C 5min ；D 加入:75μ 1 TE (10/1 ρΗ = 7. 5)；2)采用兩輪toy ch-down-PCR方法克隆出5，-端序列，具體步驟與Genome Walker MniversalKit 一致，具體步驟如下(1)第一輪 to μ ch-down PCR 體系
a 第一輪 PCRmix 配置40 μ 1無菌雙蒸餾水；5μ 1 IOXAdvantage 2 PCR buffer (clontech Advantage2 PCE Enzyme System)；1 μ 1 dNTP (每個 IOmM) (clontech Ad碰tage2 PCE Enzyme System)；1μ 1 API (10 μ Μ)；1 μ 1 Advantage 2 Polymerase mix (50 X) (clontech Advantage2 PCK Enzyme System)；1 μ 1 基因特異的 Primer (GSPl)；1 μ 1 酶切文庫 DNA ；總體系50μ1;b:PCR 程序7 個循環(huán) 940C 25s 72°C 3min ；32 個循環(huán) 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ；(2)第二輪to μ nch-down PCR組分以第一輪的PCR產物為模板，槽式引物(AP2 和GPS2)體系跟第一輪一樣；程序5個循環(huán) 94°C 25s 72°C 3min ；20 個循環(huán) 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ；二、擴增出來的PCR產物連接到pMD18T-Simple vector (TaKaRa)進行回收并測序。(Invitrogen 上海)本發(fā)明所述大黃魚β-肌動蛋白啟動子的應用如下。1)大黃魚β-肌動蛋白啟動子可以應用于外源基因真核表達。2)大黃魚β-肌動蛋白啟動子可以應用于轉基因魚以及轉基因“全魚”。本發(fā)明的突出優(yōu)點和技術效果如下本發(fā)明克隆的大黃魚肌動蛋白啟動子具有啟動活性強，能夠恒定廣泛地表達 于各個組織的優(yōu)點，所使用的克隆技術穩(wěn)定可靠。


圖1為轉染有大黃魚β-肌動蛋白啟動子驅動的報告基因(綠色熒光蛋白)EPC細 胞熒光和對應的光鏡圖。在圖1中，A為轉染有大黃魚β-肌動蛋白啟動子驅動的報告基因 (綠色熒光蛋白)EPC細胞熒光圖(10Χ) ；B為轉染有大黃魚β-肌動蛋白啟動子驅動的報 告基因(綠色熒光蛋白)EPC細胞光鏡圖(10Χ) ；pEGFPl-beta-actin-pro質粒轉染入草魚EPC細胞系中，草魚EPC細胞接入24孔細胞培養(yǎng)板(1 X IO5個/ml)，過夜培養(yǎng)后，把0. 4 μ g 的質粒和1 μ 1的LipOfectamineTM2000 (Invitrogen)轉染試劑混合(具體方法按照轉染試 劑說明說進行)加入到24孔板中，4h后更換新鮮L15 (5% FBS)培養(yǎng)基；轉染后48h倒置熒 光顯微鏡下觀察。圖2為不同濃度的LPS和Poly(I:C)刺激轉染有大黃魚beta-actin啟動子驅動的 熒光素酶活變化。在圖2中，大黃魚beta-actin啟動子插入到無啟動子載體pGL-3-Basic 中，構建好的載體pGL-3-Basic-beta-actin-pro (0. 4 μ g/孔)轉染草魚EPC細胞，24h后 加入脂多糖(LPS) 1 μ /ml 禾口 2 μ g/ml 和病毒 RNA 模擬物 poly (I C) 100ng/ml 和.1 μ g/ml 進行刺激；24h后收獲細胞并進行酶活性測定，其中質粒pSV-ii-GalactosidaseO). 2μ g/ 孔)與pGL-3-Basic-beta-actin-pro共轉染進入EPC細胞作為內參，M為沒有刺激轉染 有beta-actin啟動子載體的EPC細胞，LPS-I用1 μ g/ml LPS刺激轉染有beta-actin啟 動子載體的EPC細胞，LPS-2用2 μ g/ml LPS刺激轉染有beta-actin啟動子載體的EPC細 胞，poly(I:C)-100，用 100ng/ml poly(I:C)刺激轉染有 beta-actin 啟動子載體的 EPC 細 胞，poly (I: O-I用1 μ g/ml poly (I: C)刺激轉染有beta-actin啟動子載體的EPC細胞； pGL-3-Basic空載質粒。
具體實施例方式pGL-3-Basic-lyc beta-actin-pro 禾口 pEGFP 1-lyc beta-actin-pro 構建1. Beta-actin 5，調控序列 PCR 擴增1)合成帶有 Small (5‘ -AAGGTACCCTGGGCCCACCTTTTTTA-3‘)和 Kpn 1(5' -AAC CCGGGAATCTGTAGTTTTAATTCATTGTG-3 ‘)核酸內切酶位點。用 Clontech 保真酶 Platin μ m Taq polymerase High Fidelity 進行 PCR 擴增。體系為10XHighFidelty PCR buffer :5μ 110-mM dNTP mixt μ re 1 μ 150mMMgS04 :2μ 1primer Mix(IOmM) 1 μ 1Genomic DNA template (100ng/ul) 0. 5μ 1Platin μ m Taq High Fidelity :0·2 μ 1 (6units/μ 1)無菌雙蒸餾水至50 μ 1反應條件為95°C2min。2)用膠回收試劑盒(Promega 100次)，進行PCR回收。3)回收后的PCR產物和無啟動子的空載(PEGFPl(Clontech)/ pGL-3-Basic (Promega))進行雙酶切(Kpnl 和 Small)，37°C過夜。4)再膠回收酶切產物，并16°C過夜。連接體系1μ 1 雙酶切后的空載(pEGFPl (Clontech)/pGL-3-Basic (Promega))7. 5μ 1雙酶切后的PCR產物片段1μ 1 連接酶 buffer (IOX) 0. 5 μ 1 T4DNA 連接酶(6units/ μ 1) 5)挑取陽性單克隆，用小量質粒試劑盒(Promega)提取質粒，并雙酶切鑒定和測序。2.細胞轉染，酶活分析和熒光顯微鏡觀察1) 1 X IO5個/ml 500 μ 1 EPC細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板(Costar)上，于生化培 養(yǎng)箱25 °C過夜培養(yǎng)。2) A 對于 Luciferase 酶活分析，構建好的質粒(pGL-3-Basic-actin-pro) 0. 4 μ g 以及內對照質粒(pSV-beta-galctosidase) 0. 1 μ g，用 Lipofectamine 2000 轉染試劑 (Invitrogen)共轉染進入EPC細胞，pGL-3-Basic同時轉染作為陰性對照。對于熒光觀察， 0. 4 μ g pEGFPl-actin-pro 質粒轉染進 EPC 細胞。B :4h后把培養(yǎng)基換成新鮮完全培養(yǎng)基(5 % (Clontech)胎牛血清 L15 (Invitrogen)培養(yǎng)基)。C:在轉染 24h 后，加入 LPS (Sigma)和 Poly (I: C) (Invitrogen)刺激劑于轉染有 Iuciferase報告基因的EPC細胞中。4)轉染48h后收獲細胞或者熒光顯微鏡觀察。對于Iuciferase酶活測定，步驟參 考Iuciferase酶活分析試劑盒(Promega Catalog μ e No. E4030)已經半乳糖苷酶活分析 試劑盒(Promega Catalog μ e No. E2000)方法。具體步驟為A 用1 XPBS洗滌轉染48h的EPC細胞兩次，盡量吸干剩余液體。B:加入 160μ1 IXReporter Lysis Buffer 于孔中，常溫裂解 15min，并搖動幾 次。C:吹打細胞裂解液，轉移至1.5ml的EP管中，振蕩15s并12000g常溫離心15s。D 取上清用于Iuciferase酶活和半乳糖苷酶活性測定。對于分析Luciferase酶活性，取20 μ 1步驟D中上清加入100 μ 1 Iuciferase酶 底物，振蕩混合立即用luminatOer20/20進行檢測。對于分析半乳糖苷酶活性，去100 μ 1步驟D中上清，再加入50 μ 1 IXReporter LysisBuffer0加入150 μ 1半乳糖苷酶底物，37度反應30min，取出立即加入IM Na2CO3取100 μ 1 反應液于分光光度計上測定吸光值(0D420)。5) Luciferase酶活性用用半乳糖苷酶的活性校正(每個樣品重復3次)。
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權利要求
大黃魚β 肌動蛋白啟動子，其序列為CTGGGCCCACCTTTTTTAATTTATTTATATTTCCTTATCACAGAAATGCAGCTTTATCATGAATTTAAAGTTTTAGGGCTGACAGGTTACACAGGTACAAATAAAGTTTGAGATTTGACCCTTAATGGTGCGATTAAAGACCTGTAAATCAATAAGTGGGCCCAGTAGACCTTTGGTCCCCCTTCCTCATGTCCATAAACTAACTGAGAGCGTCTATATGAGCACAGAGTCAAACTCAAGATCTGAAATATGTTACACAAGTCATTGTCAGCTTTCCACATGATAAAAGTCACTGAGGTGACTCTAATTTAAAGGGGGGAGGTCACACGACAACAATAATGTCCTTTTAAAGTCAACTGCAACAGCATGAATGAACACGAGGAAAAGAAGAAAGAGAGAGAGAAAAAAACTGATACATAGGAGTTGATGCAACTGAGAGGAAAGGGAAGTGGTAAAGGAGGAACAGAAGAAGTTGCTGAATGTCTCAGGGTGTGCAGTTAAAGCTTTTAAATGGCACCGAGGGCCGCCCAGTCATTCAAACACTCATGGTTTAGGGGCATAAAACGTATAAAAGTGTGCGCCAGATGTTATATATTAAAAGAAAGATGGGTAGAAGATAGATGGTGGACGTATGGGAGAGGTGGGAAGGGGCTTAAAGAAAGAAGAAATTCATTTCACTGCAGCATAATTAATGATAATGATTTAGTGAATCAAGAATGTAAATTTTTTACAAGCCTAGCCTAAAAATCTTTAGTCTGAGATTGTGTCACATGGGCCTCATTAGTCAGGATGTGAATGCCCCCCAAtGCTTTCCACTTTTACGGTaATGCAGCACAATCAGGAAGTGGTACTAGGAGTGGTGTGTGTCTTATGTGTGTGTTTTATTTAATAAAGAGATGTTAAACCAAGGAGATAAAGGCCAGCACGTCCTGTTTCATGACATAGCCATATGATTGAACGGTGGCTGAAACAGCAACTGAAAACCCCTGGGGTACTTTCACTCATCTAAGAAGAGGGTAAACTCTCCTTTTAACACAACATCTAGTGCACTGCAAGCAGTCCATGCTACCAAATAACATCCTGTATCTGAAGGCAGTGAACGAGCAGAGATATTCAGGAGGACATGTGGCCACAAAGCACAAATACTTGATCAATAAATCAACATTATCAGCGAGCTGGCCTACAGTAAGTGCCTCAGCCTGTGTCTTAGCCTGTGGCAGCTTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTATGTATGTCATGTGTTTGACCCGGTGATGCAGTCCCACTGAACTGTTTTTTGTTGTTTTTTTCAAAGCAACATCAGCATCAACACCAACAACCTACTGTCATGTCTGAAATACATCAAATAATGTGAGATTAATTAAGATATAGGCTTTAGGACGACAGCAGGGAGGAGTCCTGGGTGCAAAGCTCTTCCAGTTATCATAGAAGTATGAGTCTTAGAGCAGGTGCAGGCAGGCGCGTTCACACGTATTAAAGTTTATATATCATTTAAAATGTATATAACACAGTATATGAAGAGATTAAGCTCACTAGGCCTCACAGCATCAATCCCTTCCCTCTTCTTCTCTCCAATCCTTCGCTATCATCGCCTCCCTCTCTCTCTCTGTCCCTCAAATCGCGAGCGCCCAGTGCACCACAGCGTGCACGCGACGTGCCCCAGTGCATGACGCCGGACCAATCAGAGAGCGCCATTCCGAAAGTTTACCTTTTATGGCTAGAGCCGGGCAACTGACGCGGTATAAAAGGCGAGCGCCCACAGCCAACAGATTCACTCTGAGCGCCGTCACACGCAGCTTTGTGCGGGATATCATTTGCCTGAAACCGGTTCCCTTAAAGCGAAAAGCCCCCCCACCCAAAGGTAAGAAGGACTGAAAACATTTGCATTTTTCTAATTTTGGAACGATATTCATCAAGTAAACAATGAGTTGAGTTGTTTTTTGACTGTAGCCGTTGACGAAATTTGTGAATTTGAATATAAAAGATGGCGTGGACCACGAGGGTCTTTGTCTTGGCATTACACCACTGTACTGCTAATTTAAATTAAATTTAAAAAAAGATGTAATGATTAAAAACTGTCAGATTCTGCTTGTCTTATAATGAATGCAGTATTAACGATCAGAAACCGTTATTAACCGTTGCCATTAACTGGCGACAGGTGCCTTTTTTTTTTTACCGGCTTATAATAATGAAAGTGAACGTTCGTCTACAAATTAGACTGTCAGCGTGTAGTTGTGCAACATTTTGCTGTCTTACCTCCTTCCCCCTCCTCCACCTCTTCCACCCAAGCAAGTATTTAGTTTTTGAAAGAGGCTTTTGAGTTGAGGTCGTCTGGATCCCGGCTGCTCCCTCCTTTGTGCGCCCGATGCGGCGGGGTGTGACCTACTTTAGCATATTAGCCTAGCCACGCCAGGCTAaCGCCGCCcTTCAGACtTTGAAGCAAAATACTAAAAACAAGATTtCCTcCCTTCATGCACACTGGAGGGAGGCTCTTTAAATGCCTCAtTTTCTTAAGAATAATTCATTCACTTTTAAAGTGGAAGTCTTTATAAAGACTCAAGTACATGAGGCCTCTAAAAAAAAAGCACTAATTGTTTAAACTAACAAACGGTTTTGCTGTGATTTTGTCTTTTCACGGCTCACTTGTAAAAAAAAAAAAAGGGTAAATTTCGAGTGACTACTCTTTTAGAAAAGGCGTGGCTTTCAGGAAATGGGAGCATCAGTCAAGGACTTGTGACCATTCATGAGTCAACACGAGTTCATTATGCAACTTTTTATTTCTCTCTCTCATAACGCAACCCCCAACGGCTGATTTTTGAAAAATGTCCGTTACAGCCTGGCAGCGGTGTCAATGAATGAAAGCGGCTGGTTATGACGCAGTGGTATTGAAGCGAGGCGTTCTTGTCGGGTATCAAACCCCAGTGATTGAGCAACAATAGGAGGGTGGGGTGGTTGGGGGGTGGGGGGGGTATATCTGGAGGAAGTTAACTGTAGTGGGAGTGGTCGCGAGGCGCCGGGTCTGATAATGTCGAATGTACGCTCTGGCCGCGCGCCATGGCGCCGGTAGCCGCAAAGCTGCTCAAAGCCCGAACCATGTCCTTATATGGTAATAACAGAATGCAGCGCCACTTTTTGTCTGGCTTCGCGCGGAATGTGGCGGCACGAGCGCCACCCAGTGGTTGAGCGCGTGAACTGCCTTTAGGATTTTTTATTTTTTTTAAACAGGAAGTGGGAGCTCGAGTCGGGCTGATGTTGGGAGGAAGTGAATGTAAGACTCTTTGCAGTGTCTTTAACGGGTTTTTGTTTTTTGTCTTATCAACAGTTCAGCC。
2.如權利要求1所述大黃魚肌動蛋白啟動子的克隆方法，其特征在于包括以下步驟一、大黃魚beta-actin 5’調控序列分離1)采用 Clontech 公司的 Genome Walker Universal Kit (Catalog No. 638904)構建酶 (Dra I，EcoR V, Pv μ II & St μ I)四個 DNA 核酸內切酶庫； 具體操作為(1)基因組純度分析A 取1 μ 1基因組DNA在0. 6%的瓊脂糖凝膠上電泳；B:用Dra I酶去試切，體系為5 μ 1實驗基因組DNA，1. 6 μ 1 Dra Ι，2μ1 IOXDra I buffer, 11. 4 μ 1雙蒸餾無菌H2O,總體系為20 μ 1 ；(2)基因組酶切消化A 標記5個1. 5ml的EP管DL1，DL2，DL3，DL4和一個陽性對照； B 加入酶切體系，組分為25μ 1基因組DNA，8y 1限制內切酶，10 μ 1限制內切酶 buffer (10 X)，57 μ 1雙蒸餾無菌H2O,總體系為100 μ 1 ； C 輕柔混合均勻，并瞬時離心，37°C消化2h ； D 低速渦旋5 IOs并瞬時離心，37度。C過夜消化；(3)基因組純化A 在每一個反應管中加入等體積的苯酚； B 低速渦旋5 IOs并瞬時離心；C 把上層水相轉移至另外一個1. 5ml EP管中，并加入等體積的氯仿； D 低速渦旋5 IOs并瞬時離心，轉移上層水相至另外一個新的EP管中，并向水相中 加入2倍體積冰冷的95%的乙醇，1/10體積的乙酸鈉和20 μ g的糖苷 E 低速渦旋5 IOs并離心； F 棄上清并用100 μ 1冰冷的80%乙醇洗滌，離心； G 棄上清并在空氣中干燥后用20 μ 1 TE溶解；(4)Adaptor連接到消化后的基因組上A 連接體系4μ 1消化并純化后的基因組DNA，1.9y 1 Genome Walker Adaptor, 1· 6 μ 1 連接 buffer (10X) ,0. 5μ 1 T4 DNA 連接酶；3B:連接條件16°C過夜連接； C 終止連接條件70°C 5min ； D 加入 75 μ 1 TE ；(2)采用兩輪to μ ch-down-PCR方法克隆出5’ -端序列，具體步驟如下(1)第一輪to μ ch-down PCR 體系 a 第一輪PCR mix配置(40 μ 1無菌雙蒸餾水；(5 U 1 IOX Advantage 2 PCRbuffer(clontech Advantage2 PCR Enzyme System)；(1 μ 1 dNTP ( "S^^h IOmM) (aontech Advantage2 PCE Enzyme System)；(1 μ 1 API (10 μ Μ)；Ιμ Advantage 2 Polymerase mix (50 X) (clontech Advantage2 PCIi Enzyme System)； 1 μ 1 基因特異的 Primer (GSPl)； 1 μ 1酶切文庫DNA ； 總體系50μ 1 ；b:PCR 程序7 個循環(huán) 94°C 25s 72°C 3min ；(32 個循環(huán) 94°C 25s 67°C 3min 67"C 7min ；(2)第二輪toynch-downPCR組分以第一輪的PCR產物為模板，槽式引物(AP2和 GPS2)體系跟第一輪一樣；程序5 個循環(huán) 94°C 25s 72°C 3min ；(20 個循環(huán) 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ； 二、擴增出來的PCR產物連接到pMD18T-Simple vector (TaKaRa)進行回收并測序。
3.如權利要求1所述的大黃魚肌動蛋白啟動子應用于外源基因真核表達。
4.如權利要求1所述的大黃魚β-肌動蛋白啟動子應用于轉基因魚以及轉基因“全
全文摘要
大黃魚β-肌動蛋白啟動子序列及其應用，涉及一種啟動子。本發(fā)明提供大黃魚β-肌動蛋白啟動子序列及其克隆方法與應用。克隆方法1、大黃魚beta-actin 5’調控序列分離構建酶四個DNA核酸內切酶庫；基因組酶切消化；基因組純化；Adaptor連接到消化后的基因組上；采用兩輪touch-down-PCR方法克隆出5’-端序列，具體步驟與Genome Walker Mniversal Kit一致。2、擴增出來的PCR產物連接到pMD18T-Simple vector(TaKaRa)，進行回收并測序。大黃魚β-肌動蛋白啟動子可以應用于外源基因真核表達、轉基因魚以及轉基因“全魚”。
文檔編號A01K67/027GK101914535SQ201010218110
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權日2010年7月2日
發(fā)明者敖敬群, 肖小強, 陳新華 申請人:國家海洋局第三海洋研究所