專利名稱：一種生產(chǎn)鐵皮石斛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，具體涉及運(yùn)用植物組 織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)鐵皮石斛的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum Wall, ex Lindl.)為蘭科(Orchidaceae)石斛 屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，又名黑節(jié)草，是我國瀕危珍稀的中藥材。早在東漢 時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中已記載石斛“主傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞贏瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸 胃”。成書于一千多年前的道家醫(yī)學(xué)經(jīng)典《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首，有 “千金草”之稱?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛含有的多種有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、 降血壓、降血脂，以及抗氧化和抗誘變等作用。由于鐵皮石斛屬于附生藥材，植株20 30cm高，生長十分緩慢，在自然條件下種 子萌發(fā)率低于5%。因此，在通常的栽培條件下，鐵皮石斛由種子到開花需要3 4年，而且 需要與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難有實(shí)生苗栽培。而傳統(tǒng)的分株扦插等無性繁殖方式的 成活率低、生長速度慢、繁殖率低，加之近年來人們對野生鐵皮石斛資源的掠奪式采挖，其 生境被嚴(yán)重破壞，致使野生鐵皮石斛瀕臨滅絕。研究發(fā)現(xiàn)，通過鐵皮石斛擬原球莖的生長增殖，來生產(chǎn)大量擬原球莖，獲取其藥用 成分是可行的。鐵皮石斛擬原球莖(protocorm-like bodies，即PLBs)是正在生長分化的 體細(xì)胞胚胎，具有與原植株相同的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能。通過擬原球莖的增殖分化，生 產(chǎn)大量的組培苗，使鐵皮石斛實(shí)現(xiàn)低成本高效率的繁殖，是目前解決鐵皮石斛資源短缺的 主要途徑之一。野生鐵皮石斛已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國政府的重點(diǎn)保護(hù)，嚴(yán)禁 采摘。為此研究鐵皮石斛擬原球莖的培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，以克服鐵皮石斛資源 短缺的問題。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的是一種固體組織培養(yǎng)鐵皮石斛擬原球莖的方法，它包括如下步 驟(1)無菌苗的選擇和處理從無菌瓶中取出株高約3 IOcm的種苗，無菌條件下用解剖剪刀將植株的莖剪成 Icm長的帶節(jié)的外植體，葉或根剪成Icm長的外植體。(2)擬原球莖的誘導(dǎo)和增殖將切好的外植體平放接種到擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個組合接10瓶，每培養(yǎng)瓶 接種5個外植體。誘導(dǎo)和增值培養(yǎng)基為MS+蔗糖20g/L+瓊脂4. 5g/L+NAA 0. 5mg/L+6_BA2mg/L。調(diào)整？!1為5.8。控制培養(yǎng)溫度為(25士 1) °C，光強(qiáng)50 μ mol ·πΓ2 .s—1，每天光照12h。(3)擬原球莖繼代培養(yǎng)方法將誘導(dǎo)出的擬原球莖在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代一次后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件 MS+NAA 1. Omg/ml+6-BA 0. 5mg/ml+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4. 5g/L，光照時間 12h/ d，光強(qiáng) 100 μ mo 1 · πΓ2 · s、培養(yǎng)溫度:25士 l°C，pH = 5.8。作為本發(fā)明固體組織培養(yǎng)鐵皮石斛類原球莖的方法更優(yōu)化的技術(shù)方案，對培養(yǎng)基 的配方比例和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。所述的擬原球莖誘導(dǎo)和增值培養(yǎng)培養(yǎng)周期20 40天，培養(yǎng)溫度20 30°C，光 照時間8 24小時/天，光照強(qiáng)度50 80 μ mol/πΓ2 · s—1 ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培 養(yǎng)基+蔗糖20 30g/L+瓊脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-芐氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH 值為 5. 5 6. 5 ；所述的繼代培養(yǎng)培養(yǎng)周期20 40天，培養(yǎng)溫度20 25°C，光照時間8 24 小時/天，光照強(qiáng)度50 80 μ mol/πΓ2 ·s—1 ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖30 40g/L+瓊脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-芐氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH值為 5. 5 6. 5。繼代培養(yǎng)是本發(fā)明的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，包括如下步驟(1)選取顏色鮮綠，生長同步、迅速的擬原球莖轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基上；(2)擬原球莖生長曲線近似S型，鐵皮石斛擬原球莖在0 10天呈延遲生長，10 40天呈對數(shù)生長，從培養(yǎng)的第14天開始細(xì)胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，在這階段擬原球莖增值 十分迅速，后進(jìn)入生長進(jìn)入穩(wěn)定期，擬原球莖鮮重增殖倍數(shù)為5倍以上。從培養(yǎng)的第30天 左右開始鐵皮石斛擬原球莖干重增加緩慢，并逐漸降低。(3)擬原球莖中多糖的含量最初的20天里呈上升趨勢，在第20天多糖含量達(dá)到最 大值85.6mg/g。隨后在第20天到第35天含量保持平穩(wěn)，35天后多糖含量開始下降。綜合 考查擬原球莖的生長和多糖的積累情況，最佳繼代和采收時間為30天。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該方法容易操作，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生 產(chǎn)。選用配方合理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，擬原球莖的誘導(dǎo)率平均為99%，多糖含量比野生鐵皮石斛 提高5倍以上。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)鐵皮石斛類原球莖，不變性，產(chǎn)量大，成本低，周期短， 極具市場競爭力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 一種固體組織培養(yǎng)鐵皮石斛擬原球莖的方法，它包括如下步驟(1)無菌苗的選擇和處理從無菌瓶中取出株高約3cm的種苗，無菌條件下用解剖剪刀將植株的莖剪成Icm 長的帶節(jié)的外植體，葉或根剪成Icm長的外植體。(2)擬原球莖的誘導(dǎo)和增殖將切好的外植體平放接種到擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個組合接10瓶，每培養(yǎng)瓶 接種5個外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖20g/L+瓊脂4. 5g/L+NAA0. 5mg/L+6-BA 2mg/L。 調(diào)整ρΗ5· 8?？刂婆囵B(yǎng)溫度(25 士 1) V，光強(qiáng)50 μ mol · m_2 · s—1，每天光照12h。
(3)擬原球莖繼代培養(yǎng)方法將誘導(dǎo)出的擬原球莖在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代一次后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件 MS+NAA 1. 5mg/ml+6-BA 1. 5mg/ml+ 蔗糖 22g/L+ 瓊脂 4. 5g/L，光照時間 12h/ d，光強(qiáng) 100 μ mo 1 · πΓ2 · s、培養(yǎng)溫度:25士 l°C，pH = 5.8。實(shí)施例2 —種組織培養(yǎng)鐵皮石斛類原球莖的方法，它包括如下步驟(1)無菌苗的選擇和處理從無菌瓶中取出株高約5cm的種苗，無菌條件下用解剖剪刀將植株的莖剪成 1. 5cm長的帶節(jié)的外植體，葉或根剪成1. 5cm長的外植體。(2)擬原球莖的誘導(dǎo)和增殖將切好的外植體平放接種到擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個組合接10瓶，每培養(yǎng)瓶 接種8個外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖25g/L+瓊脂5. Og/L+NAAl. 5mg/L+6-BA 2. 5mg/L。 調(diào)整ρΗ5· 6。控制培養(yǎng)溫度(25 士 1) V，光強(qiáng)60 μ mol · m_2 · s—1，每天光照12h。(3)擬原球莖繼代培養(yǎng)方法將誘導(dǎo)出的擬原球莖在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代一次后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培 養(yǎng)，接種量 80士 10g/L，培養(yǎng)條件 MS+NAA 1. Omg/ml+6-BA 0. 5mg/ml+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L，光照時間 12h/d，光強(qiáng) 100 μ mol · m_2 · s—1，培養(yǎng)溫度:25士 l°C，pH= 5.8。實(shí)施例3 對野生鐵皮石斛、實(shí)施例1和實(shí)施例2培養(yǎng)得到的鐵皮石斛擬原球莖石 斛多糖含量進(jìn)行檢測，具體檢測方法包括如下步驟(1)提取稱取野生鐵皮石斛或鐵皮石斛擬原球莖適量，加入20倍體積的蒸餾水， 在80°C水浴下浸提2小時，過濾得提取液。殘?jiān)瓷鲜霾襟E重復(fù)提取2次，合并三次提取所 得濾液，待用。(2) 5%苯酚溶液的配制稱取苯酚100g，加鋁片0. Ig和碳酸氫鈉0. 05g，常壓蒸 餾，收集182°C餾分。精密稱取該餾分約10. Og置于200mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度， 搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得5% (W/V)苯酚溶液，將其置于冰箱中備用。(3)樣品的測定取上述提取液，按適當(dāng)比例稀釋，精密吸取2ml具塞刻度試管中， 加入5%苯酚溶液lmL，搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，搖勻，置100°C水浴中加熱15min，冷水迅 速冷卻至室溫。以2mL蒸餾水同法操作為空白，使用紫外分光光度計，測定波長為490nm處 的吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線A = 0. 0153C-0. 0122，求出樣品多糖的葡萄糖濃度C(y g/ml)，按多糖含量(％ ) = C · D · f/W樣X 100%計算多糖含量。式中W樣為樣品重量；D為樣品的稀釋倍數(shù)；f為換算因子。所得樣品多糖含量應(yīng) > 30%。通過該方法對野生鐵皮石斛與上述兩個實(shí)施例生產(chǎn)的鐵皮石斛類原球莖樣品石 斛多糖含量的檢測結(jié)果如下野生鐵皮石斛與兩個實(shí)施例石斛多糖含量的比較
5 試驗(yàn)結(jié)果證明，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的鐵皮石斛類原球莖比野生鐵皮石斛的石 斛多糖含量高出5倍以上。實(shí)施例4 采用MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基和本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別對鐵皮石斛小 塊組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對通過鐵皮石斛小塊組織進(jìn)行誘導(dǎo)培 養(yǎng)，組織鮮重和誘導(dǎo)率顯著提高。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，其特征在于所述的方法是固體組織培養(yǎng)鐵皮石斛擬原球莖的方法，包括外植體的選擇誘導(dǎo)、增值培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，具體包括如下步驟(1)無菌苗的選擇和處理從無菌瓶中取出株高約3～10cm的種苗，無菌條件下用解剖剪刀將植株的莖剪成1cm長的帶節(jié)的外植體，葉或根剪成1cm長的外植體；(2)擬原球莖的誘導(dǎo)和增殖將切好的外植體平放接種到擬原球莖誘導(dǎo)和增值培養(yǎng)基中，每個組合接10瓶，每培養(yǎng)瓶接種5～10個外植體，誘導(dǎo)和增值培養(yǎng)基為MS+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L，調(diào)整pH＝5.8，控制培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光強(qiáng)50μmol·m-2·s-1，每天光照12h；(3)擬原球莖繼代培養(yǎng)方法將誘導(dǎo)出的擬原球莖在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代一次后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件MS+NAA 1.0mg/ml+6-BA 0.5mg/ml+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L，光照時間12h/d，光強(qiáng)100μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度25±1℃，pH＝5.8。
2.按照權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，其特征在于，所述的擬原球莖誘導(dǎo)和 增值培養(yǎng)中培養(yǎng)周期20 40天，培養(yǎng)溫度20 30°C，光照時間8 24小時/天，光 照強(qiáng)度50 80 μ mol/πΓ2 · s—1 ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖20 30g/L+瓊脂 4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH值為5. 5 6. 5。
3.按照權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，其特征在于，所述的擬原球莖繼代培 養(yǎng)中培養(yǎng)周期20 40天，培養(yǎng)溫度20 25°C，光照時間8 24小時/天，光照強(qiáng)度 50 80 μ mol/πΓ2 μ—1 ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為(如上權(quán)利要求中并未提到大規(guī)模培養(yǎng)基) MS培養(yǎng)基+蔗糖30 40g/L+瓊脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-芐氨基嘌呤 2. 0 3. Omg/L, pH 值為 5. 5 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固體組織培養(yǎng)鐵皮石斛擬原球莖的方法，它包括外植體的選擇誘導(dǎo)、增值培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)三個環(huán)節(jié)，所述的誘導(dǎo)和增值培養(yǎng)基為MS+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L。調(diào)整pH＝5.8。控制培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光強(qiáng)50μmol·m-2·s-1，每天光照12h。繼代培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件MS+NAA 1.0mg/ml+6-BA 0.5mg/ml+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L，光照時間12h/d，光強(qiáng)100μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度25±1℃，pH＝5.8。該方法易操作，有效成分含量高，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)鐵皮石斛擬原球莖，不變性，產(chǎn)量大，成本低，周期短。
文檔編號A01H4/00GK101878736SQ20101020279
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者賈景明 申請人:沈陽藥科大學(xué)