專利名稱：利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖 的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobium candidum Kimura et Mi go)為蘭科氣生草本植物。它因 表皮呈鐵綠色而得名，俗稱鐵皮楓斗，因其老莖節(jié)外呈褐色，又名黑節(jié)草，鐵皮石斛為石斛 之極品。分布于安徽、浙江、江西、廣東、廣西、云南、貴州等省區(qū)。鐵皮石斛對生長環(huán)境和氣 候條件要求十分苛刻，它生長于海拔500 1000m，相對濕度在60% 75%，林間透光度在 60%左右，生長季節(jié)溫度20 25°C，冬季氣溫9 12°C，在無霜多霧，年降雨量為1100 1500mm的常綠闊葉林中及石灰?guī)r上。鐵皮石斛常年飽云、霧、雨、露滋潤，受天地之靈氣，吸 日月之精華，一般生長在人跡罕至的深山老林和懸崖峭壁上的陰面崖縫間。鐵皮石斛通過 風(fēng)及蟲媒傳播繁殖，從種子萌發(fā)進(jìn)入商品階段需2 3年才能采收。由于鐵皮石斛特殊的生 長環(huán)境和自身繁殖極其困難，以及人們的過度采挖，目前鐵皮石斛的野生資源已日趨減少， 至1987年，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物，在《中國植物紅皮書》中被列為瀕危種，現(xiàn)已成 為國家二級保護(hù)植物。挽救和保護(hù)鐵皮石斛野生種質(zhì)資源并實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)利用具有極其重 要的意義。鐵皮石斛具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》記載鐵皮石斛具有“主 傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸胃”的功效；成書于一千多年前的道家醫(yī) 學(xué)經(jīng)典《道藏》將鐵皮石斛、天山雪蓮、三兩重人參、百二十年首烏、花甲之茯從、深山靈芝、 海底珍珠、冬蟲夏草等列為“中華九大仙草”，鐵皮石斛位“九大仙草”之首；鐵皮石斛為千百 年來歷代帝皇夢寐以求的寶物，素有“千金草”之稱，馳名中外，被國際藥用植物界稱為“藥 界大熊貓”，民間稱其為“救命仙草”。鐵皮石斛莖的鮮品或干品皆可作中藥石斛單獨(dú)使用， 也可用在復(fù)方配伍中。其質(zhì)硬而脆，斷面較平坦，味苦，具有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱、明目及強(qiáng) 腰膝的作用。石斛、人參、山藥、茯芩等26種中藥配伍而成的石斛夜光丸具有平肝，滋腎，明 目的功效。在列入藥典的石斛中，只有鐵皮石斛才具有主治五臟虛弱贏瘦、強(qiáng)陰益精、久服 厚腸胃、定志除驚、輕身延年、健陽、補(bǔ)腎益力、壯筋骨等功效。以鐵皮石斛正氣處方為配方 的，有脈絡(luò)寧靜脈注射液、石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛輕胃散等產(chǎn)品，對 咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病等均有顯著療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)還證明鐵皮石 斛具有抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗血小板聚集、降血糖等作用。由于鐵皮石斛為附生植物，多生于溫涼高濕陰坡或半陰坡的巖層峭壁或密林的樹 杈上，生境十分狹窄，且多年來對其過度采挖，加之試管苗的移栽成活率低，造成了石斛藥 源供需之間的緊張狀態(tài)。目前，鐵皮石斛的野生資源已瀕臨枯竭。圓球莖是鐵皮石斛離體 培養(yǎng)產(chǎn)生的胚性組織，同樣具有植株物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育的潛能。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 獲得組織培養(yǎng)物，并以組織培養(yǎng)物代替其原植株成為藥源，是實(shí)現(xiàn)野生石斛資源可持續(xù)利 用的有效方式之一，這對拯救野生石斛資源有著極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，以鐵皮 石斛無菌播種所獲得的圓球莖為材料，通過生物反應(yīng)器諸理化參數(shù)的調(diào)控，探明在反應(yīng)器 內(nèi)圓球莖生長的優(yōu)化條件，并對有效成分含量進(jìn)行分析，為鐵皮石斛的開發(fā)利用提供新的 方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案—種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，在3L生物反應(yīng)器中注入2L液 體培養(yǎng)基，接種20g圓球莖、光照強(qiáng)度為1600LUX、空氣注入量為0. 20vvm時(shí)進(jìn)行完全浸沒培 養(yǎng)30d，增殖鐵皮石斛圓球莖。所述的培養(yǎng)基是由1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁 lOOmL 蔗糖 30g I71 構(gòu)成，pH 5. 8。所述的生物反應(yīng)器為氣升式生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明，鐵皮石斛圓球莖多糖產(chǎn)量以及生物堿產(chǎn)量均在同樣條件下達(dá)到最 高，且均高于栽培苗和組培苗。利用氣升式生物反應(yīng)器對鐵皮石斛圓球莖進(jìn)行培養(yǎng)可以提 高增殖速度，在短期內(nèi)獲得大量的外植體。同時(shí)從成本角度考慮，生物反應(yīng)器培養(yǎng)可減少 培養(yǎng)基成本(瓊脂使用費(fèi))，另一方面又可以減少操作人員數(shù)，從而降低勞動(dòng)強(qiáng)度和生產(chǎn)成 本。因此，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)可為商業(yè)化生產(chǎn)提供一種新的途徑，解決石斛藥源供需之間 的緊張。


圖1鐵皮石斛圓球莖在3L生物反應(yīng)器中的增殖生長情況。
圖2培養(yǎng)密度對多糖含量及產(chǎn)量的影響。
圖3培養(yǎng)密度對生物堿含量及產(chǎn)量的影響。
圖4光照強(qiáng)度對多糖含量及產(chǎn)量的影響。
圖5光照強(qiáng)度對生物堿含量及產(chǎn)量的影響。
圖6通氣量對多糖含量及產(chǎn)量的影響。
圖7通氣量對生物堿含量及產(chǎn)量的影響。
圖8生物反應(yīng)器中不同培養(yǎng)時(shí)期多糖含量及產(chǎn)量的變化。
圖9生物反應(yīng)器中不同培養(yǎng)時(shí)期生物堿含量及產(chǎn)量的變化。
圖10鐵皮石斛不同來源材料多糖及生物堿含量的比較。
圖11氣升式生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式利用氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖方法的具體實(shí)施步驟如下一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，在3L氣升式生物反應(yīng)器中注 入2L液體培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基是由l/2MS+BA2mg L^+NAAO. 5mg I/1—椰汁lOOmL 蔗糖30g L-1構(gòu)成，pH 5. 8，接種20g圓球莖、光照強(qiáng)度為1600Lux、空氣注入量為0. 20vvm 時(shí)進(jìn)行完全浸沒培養(yǎng)30d，增殖鐵皮石斛圓球莖。
以上最佳方案由下列實(shí)驗(yàn)對比得出。(一 )材料與方法1.鐵皮石斛圓球莖生物反應(yīng)器培養(yǎng)及有效成分積累的研究①.培養(yǎng)密度的篩選在3L氣升式生物反應(yīng)器中，2L液體培養(yǎng)基(1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁lOOmL L、蔗糖30g pH 5. 8)在溫度121 °C，壓力1. 2kg cm_2的條件下高 壓滅菌30min，冷卻后注入反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)分別接種10、20和30g圓球莖，注入 0. 20vvm(air volume/culture volume/min.)的空氣，在溫度 25士2°C，光照強(qiáng)度 1600Lux, 每天光照16h的條件下培養(yǎng)30d后調(diào)查圓球莖的鮮物重、干物重以及多糖和生物堿的含量。②.光照強(qiáng)度的篩選依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)接種20g圓球莖，光照強(qiáng)度分別設(shè)置為黑暗、 1600LUX、用環(huán)狀日光燈調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度2400LUX下進(jìn)行，其它條件同上，培養(yǎng)30d后調(diào)查圓球 莖的鮮物重、干物重以及多糖和生物堿的含量。③.空氣注入量的篩選依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)接種20g圓球莖，光照強(qiáng)度為1600LUX，通氣量 設(shè)置為0. 10,0. 20,0. 30vvm,其它條件同上，培養(yǎng)30d后調(diào)查圓球莖的鮮物重、干物重以及 多糖和生物堿的含量。2.鐵皮石斛圓球莖不同培養(yǎng)時(shí)期有效成分含量的分析反應(yīng)器內(nèi)接種20g圓球莖，光照強(qiáng)度為1600LUX，通氣量設(shè)置為0. 20vvm，其它條件 同上。接種后10d，20d，30d，40d測定圓球莖多糖以及生物堿含量。3.鐵皮石斛不同來源材料有效成分含量的比較比較鐵皮石斛一年生栽培苗、固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6個(gè)月的組培苗以及反應(yīng)器培養(yǎng) 30d圓球莖多糖和生物堿的含量。( 二 )結(jié)果與分析1.鐵皮石斛圓球莖生物反應(yīng)器培養(yǎng)及有效成分積累的研究①.接種量的篩選當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)接種密度為20g時(shí)鮮物重和干物重顯著多于10g和30g處理，分別為 167. 5g 和 15. 0g。培養(yǎng)密度對鐵皮石斛圓球莖多糖以及生物堿積累的影響見圖2和圖3，由圖2可 看出，反應(yīng)器中接種10g鐵皮石斛圓球莖時(shí)，多糖含量較高，達(dá)到217.41mg g—1 ；接種量為 20g時(shí)多糖產(chǎn)量較高，為1. 59g化―1。由圖3可看出，接種量為20g時(shí)生物堿含量較高，為到 3. 61mg g-1 ；生物堿產(chǎn)量也在接種量為20g時(shí)較高，為27. 08mg L-1。②.光照強(qiáng)度的篩選光照強(qiáng)度對生物反應(yīng)器內(nèi)鐵皮石斛圓球莖增殖存在一定的影響，鐵皮石斛圓球莖 在1600LUX條件下生長最旺盛，鮮物重達(dá)到179. 8g。光照強(qiáng)度對鐵皮石斛圓球莖多糖及生物堿積累的影響見圖4和圖5，當(dāng)光照強(qiáng) 度為2400LUX時(shí)，圓球莖多糖含量較高，為228. 92mg g—1 ；鐵皮石斛圓球莖多糖產(chǎn)量在 1600Lux條件下達(dá)到最高值，為1. 72g L—1。在黑暗條件下，圓球莖生物堿含量較高，為 3. 92mg g—1，生物堿產(chǎn)量在1600Lux條件下達(dá)到最高值，為29. 57mg L—1。
③.通氣量的篩選通氣量對生物反應(yīng)器內(nèi)鐵皮石斛圓球莖增殖有影響，當(dāng)通氣量為0. 20vvm時(shí)圓球 莖生長健壯，顏色鮮綠，鮮物重和干物重分別為180. lg和16. 5g，適宜鐵皮石斛圓球莖的增
殖。 鐵皮石斛圓球莖多糖含量和生物堿含量在給予不同通氣量條件下存在一定的 差異，由圖6和圖7可看出，當(dāng)通氣量為0. 2vvm時(shí)，鐵皮石斛圓球莖多糖含量較高，為 ZUJSmg'g—1，多糖產(chǎn)量也相應(yīng)的在通氣量為0.2vvm時(shí)達(dá)到最大值，其值為1. 75g化人與 多糖相似的是，生物堿含量和產(chǎn)量均在通氣量為0. 2vvm時(shí)達(dá)到最大值，分別為3. 74mg g—1 和 30. 86mg I71。2.鐵皮石斛圓球莖不同培養(yǎng)時(shí)期有效成分含量的分析鐵皮石斛圓球莖中多糖含量和生物堿含量亦與其生長密切相關(guān)(圖8和圖9)，在 培養(yǎng)十天至20天內(nèi)，多糖含量有所增加，20天至30天內(nèi)，多糖含量增加較快，并在培養(yǎng)至 30d時(shí)達(dá)到最大值，為214. 18mg g—1，三十天后多糖含量有所下降；鐵皮石斛圓球莖多糖產(chǎn) 量也相應(yīng)的在30天時(shí)達(dá)到最大值，為1.768*1^。而生物堿含量則在十天至二十天內(nèi)增長 速度較快，三十天時(shí)達(dá)到最大值，其值為3. 78mg g—1，三十天后稍有回落；生物堿產(chǎn)量在30 天時(shí)達(dá)到最大值，為30. 99mg L-1。3.鐵皮石斛不同來源材料有效成分含量的比較鐵皮石斛一年生栽培苗、固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6個(gè)月的組培苗以及反應(yīng)器培養(yǎng)30d 圓球莖多糖和生物堿的含量的比較見圖10，由圖可看出，這三種材料中，鐵皮石斛圓球莖多 糖含量和生物堿含量均為最高，分別為214. 18mg g-1和3. 78mg 均高于栽培苗和組培
田o生物反應(yīng)器是為生物體生長和代謝提供優(yōu)化的理化環(huán)境，使生物體能夠更好地生 長，得到更多的生物量或代謝產(chǎn)物的設(shè)備，具有生產(chǎn)規(guī)模大、周年生產(chǎn)、不受季節(jié)及區(qū)域性 影響、自動(dòng)化程度高、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn).生物反應(yīng)器分為機(jī)械攪拌式、氣動(dòng)式、固定化及 其它類型，本發(fā)明實(shí)施例中所采用的反應(yīng)器為氣升式生物反應(yīng)器，結(jié)構(gòu)如圖11所示，圖中 a 插頭b 氣泵c 空氣流量計(jì)d 過濾膜e 多孔噴嘴(孔徑15 y m) f 出氣口，箭頭表示空 氣流動(dòng)方向。氣升式生物反應(yīng)器是氣動(dòng)式反應(yīng)器中的一種，其流動(dòng)性均勻，提供低剪切力 環(huán)境，結(jié)構(gòu)簡單，沒有其他生物反應(yīng)器(如攪拌式反應(yīng)器)所具有的如泄漏點(diǎn)和死角多等缺 點(diǎn)。如圖1，鐵皮石斛圓球莖在3L氣升式生物反應(yīng)器中的增殖生長情況。氣升式生物反應(yīng)器的主要工作原理為氣體由反應(yīng)器底部的流量計(jì)和過濾膜進(jìn)入 反應(yīng)器，通過氣體分布裝置(噴嘴)霧狀噴入反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基中，經(jīng)過氣液分離后在反應(yīng)器 上部排除，從而帶動(dòng)液體和培養(yǎng)物在反應(yīng)器的循環(huán)流動(dòng)，達(dá)到攪拌目的。氣升式反應(yīng)器攪 拌速度和混合程度由(1)通氣速率，如通入反應(yīng)器的氣體體積；(2)氣體噴泄氣的位置和構(gòu) 型，如噴嘴和燒結(jié)口 ；(3)容器的高度與直徑比；(4)培養(yǎng)液的黏度和流變性。
權(quán)利要求
一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，在3L生物反應(yīng)器中注入2L液體培養(yǎng)基，接種20g圓球莖、光照強(qiáng)度為1600Lux、空氣注入量為0.20vvm時(shí)進(jìn)行完全浸沒培養(yǎng)30d，增殖鐵皮石斛圓球莖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，其特征在 于所述的培養(yǎng)基是由 1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁 lOOmL 蔗糖 30g L—1 構(gòu)成，pH 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛圓球莖的方法，其特征在 于所述的生物反應(yīng)器為氣升式生物反應(yīng)器。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用氣升式生物反應(yīng)器大量增殖鐵皮石斛圓球莖的方法，在3L生物反應(yīng)器中注入2L液體培養(yǎng)基，接種20g圓球莖、光照強(qiáng)度為1600Lux、空氣注入量為0.20vvm時(shí)進(jìn)行完全浸沒培養(yǎng)30d后，鮮物種可達(dá)180.1g，適宜鐵皮石斛圓球莖的增殖。本發(fā)明鐵皮石斛圓球莖多糖產(chǎn)量以及生物堿產(chǎn)量均在同樣條件下達(dá)到最高，且均高于栽培苗和組培苗。本發(fā)明可以提高增殖速度，在短期內(nèi)獲得大量的外植體。同時(shí)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)可減少培養(yǎng)基成本，又可以減少操作人員數(shù)，從而降低勞動(dòng)強(qiáng)度和生產(chǎn)成本。因此，生物反應(yīng)器培養(yǎng)可為商業(yè)化生產(chǎn)提供一種新的途徑，解決石斛藥源供需之間的緊張。
文檔編號A01H4/00GK101849507SQ20101019366
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者孫丹, 尹成日, 廉美蘭, 樸炫春 申請人:延邊大學(xué)