專(zhuān)利名稱(chēng)：小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效qtl的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方法， 將植物幼胚培養(yǎng)與分子標(biāo)記結(jié)合在小麥抗赤霉病育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小赤霉病是危害小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要致病菌之一。80年代后期以來(lái)，由于全球氣 候變化和耕作制度的影響，小麥赤霉病在歐洲、美國(guó)、加拿大、中國(guó)、南美等地頻繁發(fā)生，對(duì) 小麥產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的損失，為此人們對(duì)小麥赤霉病已經(jīng)進(jìn)行了廣泛深入的研究， 并取得了顯著的成就。我國(guó)是全球小麥赤霉病受害面積最大的國(guó)家，長(zhǎng)江中下游和華南冬 麥區(qū)及東北春麥區(qū)東部尤為嚴(yán)重，每年小麥赤霉病的發(fā)生面積已超過(guò)700萬(wàn)hm2，約占全國(guó) 小麥總面積的1/4。因此，長(zhǎng)江中下游麥區(qū)創(chuàng)制抗赤霉病的種質(zhì)、培育抗病小麥新品種是克 服赤霉病危害的根本途徑。但是由于禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)在小麥開(kāi)花期侵染麥穗，它的侵 染和擴(kuò)展取決于當(dāng)?shù)?、?dāng)時(shí)的天氣情況即溫度和濕度等天氣因素(陸維忠等2000)，這對(duì) 育種家依靠表型進(jìn)行抗赤性的選擇帶來(lái)困難。此外，小麥赤霉病是由多基因控制的數(shù)量 性狀(張勇等，2005)，抗性鑒定過(guò)程易受環(huán)境影響且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。分子標(biāo)記輔助選擇(MAS， marker-assisted selection)給育種材料中變異的選擇提供了嶄新的途徑，分子標(biāo)記是建 立在DNA基礎(chǔ)上的一種遺傳學(xué)標(biāo)記它具有不受環(huán)境影響，在作物任何發(fā)育階段以及任何器 官、組織中都可以進(jìn)行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，這樣就可以實(shí)現(xiàn)間接地對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行苗期鑒定和早 代選擇，從而使目的基因的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。不僅提高了性狀選擇的準(zhǔn)確性，而且加 快了性狀鑒定的速度，從而達(dá)到了提高育種效率的目的(Dudley等，1993 ；Lee等，1995)。除了分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的應(yīng)用外，傳統(tǒng)育種技術(shù)還是存在育種周期偏 長(zhǎng)，育種效率不夠理想等問(wèn)題。盡管異地加代可以實(shí)現(xiàn)一年2-3代，但試驗(yàn)費(fèi)用較高，因 此探索將育種周期縮短、加速小麥新種質(zhì)的培育研究便顯得十分必要和迫切(王海波等， 2003)。加快小麥育種的速度，首先必須加快小麥整個(gè)生長(zhǎng)期的發(fā)育速度，然而現(xiàn)有的小麥 幼胚培養(yǎng)技術(shù)仍然主要用于遠(yuǎn)緣雜交胚挽救或以幼胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織植株再生和 轉(zhuǎn)基因方面的研究(王海波等，2006)，對(duì)南方夏季高溫多濕的條件下如何通過(guò)幼胚培養(yǎng)與 抗赤霉病育種的MAS回交育種相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抗赤霉病基因快速轉(zhuǎn)育的研究卻很少。研究表明，在抗赤霉病小麥品種或品系的3BS染色體上帶有主效抗病QTL (周淼平 等，2003 ；Zhang等2004)，Xgwn493、Xgwm533為與其緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記(Bai等，2002 ； 2003 ；陸維忠，2000)。近年來(lái)我們利用分子標(biāo)記輔助選擇在赤霉病抗性改良上已經(jīng)取得初 步成效，相繼育成了多個(gè)抗赤性較好的新品種。但由于回交策略中必須在高世代才能獲得 背景與輪回親本一致的抗性材料，需要采用適當(dāng)方法縮短回交周期以盡早獲得豐產(chǎn)性好并 攜帶抗性QTL染色體片段的豐產(chǎn)抗病種質(zhì)。因此，如何將小麥幼胚培養(yǎng)與分子標(biāo)記相結(jié)合 應(yīng)用于回交育種策略可望縮短回交育種期限，建立高效抗赤霉病基因轉(zhuǎn)育育種程序，盡快獲得帶有目的基因(QTL)的回交材料，一直是本領(lǐng)域密切關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，通過(guò)小麥幼胚培養(yǎng)與分子標(biāo)記相結(jié)合技術(shù)，將抗赤霉病小麥品種或品系中 抗赤霉病主效QTL轉(zhuǎn)育到農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系中的方法，并未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)將抗赤霉病主效QTL轉(zhuǎn)育到抗赤 霉病差，但其他綜合性狀優(yōu)良的品種中的育種周期過(guò)長(zhǎng)的實(shí)際問(wèn)題，提供一種新的小麥幼 胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病 主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交轉(zhuǎn)育、幼胚壯苗培養(yǎng)、標(biāo)記輔助選擇、快速 成苗技術(shù)相結(jié)合的快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL，具體步驟如下a)以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系為受體親本，以抗赤霉病小麥品種 或品系為抗源父本，受體親本抽穗期去雄與抗源父本雜交后剝?nèi)∮着?；b)4°C下春花培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)移到晝/夜25V /15°C光照培養(yǎng)成苗，成苗5d后，移栽 到晝/夜28°C /15°C溫室中生長(zhǎng)，同時(shí)取半張葉片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533 為標(biāo)記對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，留取含有標(biāo)記的植株繼續(xù)生長(zhǎng)；c)植株抽穗期去雄與回交親本進(jìn)行雜交，所述的回交親本為感赤霉病小麥品種受 體親本；d)授粉后12d，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作下剝?nèi)∮着?；e)按照b至d步驟輪回重復(fù)4 5次，最后一次輪回重復(fù)在b步驟結(jié)束后直接進(jìn)入f;f)揚(yáng)花期自交，選育具有抗赤霉病主效QTL且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新種質(zhì)。在本發(fā)明中所述的剝?nèi)∮着呤侵富ê?2d的仔粒經(jīng)75%酒精消毒30s和0. 1% 升汞消毒10 15min，無(wú)菌水洗3次；在無(wú)菌條件下將幼胚剝出；所述的春化培養(yǎng)是指將 幼胚尖端向下在添加0. 3%麥芽提取物的1/2MS培養(yǎng)基中4°C培養(yǎng)7天。在本發(fā)明中成苗5d后，移栽到晝/夜28°C/15°C溫室中生長(zhǎng)是指成苗5d后，將 幼胚苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，遮蔭2 3d，緩苗后在晝夜溫度28°C /18°C溫室中培養(yǎng)，拔節(jié)期葉 面噴每隔5d噴一次0.3%磷酸二氫鉀，連續(xù)噴施二次；所述的營(yíng)養(yǎng)土由大田土、泥炭土和珍 珠巖按照631的體積比混合而成。在本發(fā)明中所述的農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系為揚(yáng)麥15號(hào)或揚(yáng) 麥13或淮麥18 ；抗赤霉病小麥品種或品系為蘇麥3號(hào)或?qū)?94037或?qū)?840。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)將小麥幼胚培養(yǎng)與分子標(biāo)記相結(jié)合，建立了一種抗赤霉 病轉(zhuǎn)育、輪回重復(fù)幼胚壯苗培養(yǎng)、幼苗移栽快育、分子標(biāo)記輔助選擇，在感性赤霉病小麥品 種或品系中快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL，大大縮短了培育周期，有效地提高小麥新種質(zhì)選育 效率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1、受體親本和輪回親本優(yōu)質(zhì)弱筋小麥揚(yáng)麥152、抗源父本抗赤霉病小麥品種蘇麥3號(hào)3、培養(yǎng)基采用l/2MS(pH 5.8)固體培養(yǎng)基中添加0. 3 %麥芽提取物(malt extract)。4、營(yíng)養(yǎng)土 大田土、泥炭土、珍珠巖以6 3 1的體積比混合均勻。5、引物的設(shè)計(jì)與合成Qfhs. ndsu. 3BS 引物 Xgwn493、Xgwm533 序列參見(jiàn)R0der等(1998)發(fā)表，由上海生
工公司合成。6、葉片DNA提取剪取各幼胚苗半張葉片，放入研缽中加入液氮后磨成粉末，分裝到 1. 5mlenpperdof管中，加入0. 6ml 65°C預(yù)熱的CTAB提取液，65°C水浴60min。樣品取出 后，置于室溫，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)混合液，小心翻轉(zhuǎn)后，IOOOOrpm離心 IOmin (25°C )。離心后上清液轉(zhuǎn)入另一含有0. 6體積的預(yù)冷的異戊醇的enpperdof管中，輕 輕搖動(dòng)至DNA沉淀析出，靜置后鉤出DNA沉淀。加入0. 7ml70%乙醇洗滌3次，傾去上清， 將DNA貼壁晾干。加入適量的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。加入3_5ulRNase (5mg/ml)，37°C 水浴60min。加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，輕搖，12000rpm離心lOmin。上清液轉(zhuǎn) 入另一含有2倍體積(800ul)的無(wú)水乙醇和1/10體積(40ul)的3M NaAc的enpperdof管 中，緩慢翻轉(zhuǎn)，混勻，-20°C靜置2h后，鉤出DNA沉淀，加入0. 7ml 70%乙醇洗滌3_5次，將 DNA貼壁晾干。加入適量的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。對(duì)DNA進(jìn)行0. 8%的瓊脂糖電泳，確 定DNA質(zhì)量與濃度。7、瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA提取后，采用0. 8%的瓊脂糖電泳，確定DNA的質(zhì)量和濃度。8、分子標(biāo)記電泳檢測(cè)PCR 反應(yīng)在 PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, INC.) 上進(jìn)行，反應(yīng)體積為20 μ 1。反應(yīng)混合液包括1 Xbuffer，1. 5mmol/L MgC12,2. Ommol/ L dNTPs，250ymol/L 引物，50-100ng 模板 DNA，1U Taq 酶。反應(yīng)程序?yàn)?4 °C，5min ； 94°C 45sec，55-60°C，45sec，72°C，45sec，40 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin0 4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色成像。具體過(guò)程田間以受體親本(母本)抽穗期去雄與抗源父本雜交，2007年4月10日田間授 粉，4月22日(花后12d)剝?nèi)∮着吲囵B(yǎng)。取幼胚的方法是剛抽穗的仔粒經(jīng)75%酒精消毒 30s和0. 升汞消毒10 15min，無(wú)菌水洗3次；在無(wú)菌條件下將幼胚剝出(取幼胚的方 法下同)。第一代4月22日取幼胚培養(yǎng)，4月26日春化處理(將幼胚尖端向下在添加0. 3% 麥芽提取物的1/2MS培養(yǎng)基中4°C培養(yǎng)7天，下同)，成苗5d后，將幼胚苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中， 遮蔭2 3d，緩苗后在晝夜溫度28°C/18°C溫室中培養(yǎng)，5月10日移栽，并取半張葉片提取 DNA,以SSR引物Xgwn493、Xgwm533為標(biāo)記對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，留取含有標(biāo)記的植株 繼續(xù)生長(zhǎng)，拔節(jié)期葉面噴每隔5d噴一次0.3%磷酸二氫鉀，連續(xù)噴施二次，6月15日揚(yáng)花，6 月28日取12d幼胚培養(yǎng)。(生育期67d)(第二代到第五代部分過(guò)程相同，僅以時(shí)間為線索簡(jiǎn)述)第二代2007年6月28日胚培養(yǎng)，7月1日春化處理，7月16日移栽(分子標(biāo)記檢測(cè))，9月1日揚(yáng)花抽穗期去雄與回交親本回交，9月14日取幼胚(生育期78d)。第三代2007年9月14日胚培養(yǎng)，9月18日春化，10月2日移栽于大棚(分子標(biāo) 記檢測(cè))，11月8日揚(yáng)花抽穗期去雄與回交親本回交，11月23日可以取幼胚培養(yǎng)(生育期 71d)，第四代2007年11月23日胚培養(yǎng)，11月27日春化，12月12日移栽溫室(分子 標(biāo)記檢測(cè))，2008年2月24日揚(yáng)花抽穗期去雄與回交親本回交，3月8日取12d幼胚(生育 期103d)。由于冬季溫室加溫條件較差，生育期延長(zhǎng)。第五代2008年3月8日胚培養(yǎng)，3月11日春化，3月25日移栽于大棚營(yíng)養(yǎng)缽(分 子標(biāo)記檢測(cè))，4月27日揚(yáng)花自交，6月1日收獲種子(生育期84d)，秋季播種到大田篩選、鑒定。2009年4月25日對(duì)移栽到田間的具有標(biāo)記的后代進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，在87個(gè) BC4F2后代株系中檢測(cè)到具有來(lái)自抗性親本Xgwm 493等位位點(diǎn)的株系21個(gè)，抗性標(biāo)記檢 出率24. 1% ；具有抗性親本Xgwm533標(biāo)記的株系16個(gè)，抗性標(biāo)記檢出率18. 4% ；同時(shí)具有 兩種標(biāo)記的株系12個(gè)，標(biāo)記檢出率13. 8%，對(duì)檢測(cè)出具有標(biāo)記的株系進(jìn)行赤霉病接種鑒定 表明，同時(shí)含有Xgwm493、Xgwm533標(biāo)記的株系中抗到高抗赤霉病植株比例達(dá)到75% ；含有 Xgwm533標(biāo)記的株系中抗赤霉病株系占68. 7%，其次是含有Xgwm493的株系中有14個(gè)抗赤 霉病達(dá)中抗以上水平，標(biāo)記篩選的有效率達(dá)到66. 7% ；可見(jiàn)在小麥赤霉病抗性主效QTL轉(zhuǎn) 育中采用分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合幼胚培養(yǎng)是高效的。以上實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的具體限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員結(jié)合依據(jù)本發(fā)明公 開(kāi)方法，選擇不同的受體親本、輪回親本和抗源父本，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交轉(zhuǎn)育、幼胚壯苗培養(yǎng)、標(biāo)記輔助選擇、快速成苗技術(shù)相結(jié)合的快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL，具體步驟如下a)以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系為受體親本，以抗赤霉病小麥品種或品系為抗源父本，受體親本抽穗期去雄與抗源父本雜交后剝?nèi)∮着?；b)4℃下春花培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)移到晝/夜25℃/15℃光照培養(yǎng)成苗，成苗5d后，移栽到晝/夜28℃/15℃溫室中生長(zhǎng)，同時(shí)取半張葉片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533為標(biāo)記對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，留取含有標(biāo)記的植株繼續(xù)生長(zhǎng)；c)植株抽穗期去雄與回交親本進(jìn)行雜交，所述的回交親本為感赤霉病小麥品種受體親本；d)授粉后12d，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作下剝?nèi)∮着撸籩)按照b至d步驟輪回重復(fù)4～5次，最后一次輪回重復(fù)在b步驟結(jié)束后直接進(jìn)入f；f)揚(yáng)花期自交，選育具有抗赤霉病主效QTL且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方 法，其特征在于所述的剝?nèi)∮着呤侵富ê?2d的仔粒經(jīng)75%酒精消毒30s和0. 升汞 消毒10 15min，無(wú)菌水洗3次；在無(wú)菌條件下將幼胚剝出；所述的春化培養(yǎng)是指將幼胚 尖端向下在添加0. 3%麥芽提取物的1/2MS培養(yǎng)基中4°C培養(yǎng)7天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方 法，其特征在于成苗5d后，移栽到晝/夜28°C /15°C溫室中生長(zhǎng)是指成苗5d后，將幼胚 苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，遮蔭2 3d，緩苗后在晝夜溫度28°C /18°C溫室中培養(yǎng)，拔節(jié)期葉面噴 每隔5d噴一次0.3%磷酸二氫鉀，連續(xù)噴施二次；所述的營(yíng)養(yǎng)土由大田土、泥炭土和珍珠巖 按照631的體積比混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3之一所述的小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主 效QTL的方法，其特征在于所述的農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系為揚(yáng)麥15號(hào) 或揚(yáng)麥13或淮麥18 ；抗赤霉病小麥品種或品系為蘇麥3號(hào)或?qū)?94037或?qū)?840。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記選擇快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交轉(zhuǎn)育、幼胚壯苗培養(yǎng)、標(biāo)記輔助選擇、快速成苗技術(shù)相結(jié)合的快速轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL，它以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感赤霉病小麥品種或品系為受體親本，以抗赤霉病小麥品種或品系為抗源父本，受體親本抽穗期去雄與抗源父本雜交后剝?nèi)∮着?；將幼胚培養(yǎng)成苗后提取葉片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533為標(biāo)記對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，留取含有標(biāo)記的植株繼續(xù)生長(zhǎng)，再剝?nèi)∮着?，采用相同的方法?jīng)過(guò)多輪回交，最后自交，獲得轉(zhuǎn)育抗赤霉病主效QTL的新種質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)是培育周期短，新種質(zhì)選育效率高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101828521SQ201010175150
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者任麗娟, 余桂紅, 姚金保, 張平平, 張旭, 張鵬, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院