專利名稱：一種培育大顆粒有核珍珠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培育有核珍珠的方法，本發(fā)明所述方法用于 培育直徑在8-lOmm的孵育珠核，從而能夠使培育出來的珍珠具有更大的直徑(一般能達(dá) IOmm以上)，所使用的培育生物一般為淡水貝類，例如三角帆蛘等。
背景技術(shù)：
我國淡水資源豐富，淡水貝類育珠前景廣闊。目前，我國淡水珍珠年產(chǎn)量千噸以 上，但優(yōu)質(zhì)、高檔的珍珠卻不足百噸，直徑為8mm以上的珍珠在短期內(nèi)難以滿足國際市場的 要求。珍珠顆粒的大小在很多程度上決定了珍珠生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。對于淡水貝類大顆粒珍 珠培育在生產(chǎn)上仍是一個難題。近10年來，人工育珠工藝的理論基礎(chǔ)得到了新的發(fā)展“游 離細(xì)胞植入法培育有核珍珠”及“內(nèi)臟團(tuán)育珠技術(shù)”在培育淡水有核珍珠上取得了突破性進(jìn) 展，為優(yōu)質(zhì)珍珠的培育提供了良好的生物學(xué)基礎(chǔ)，也為大顆粒珍珠培育提供了空間的可能。 但是，大顆粒珠核插核后吐珠率高和傷口難以愈合一直困繞著大顆粒有核珍珠的培育，迫 切需要在生產(chǎn)工藝上進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，降低插核手術(shù)給珍珠產(chǎn)業(yè)帶來的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題在于現(xiàn)有內(nèi)臟團(tuán)培育有核珍珠的過程中，插入珠 核后，珍珠培育生物(例如三角帆蛘等)一般具有高吐珠率的問題，并針對該問題提供一種 培育有核珍珠的方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種培育大顆粒有核珍珠的方法，包括a、從蛘體上獲得外套膜外表皮細(xì)胞，b、用 得到的外套膜外表皮細(xì)胞孵育珠核，得到孵育珠核，C、將孵育珠核植入育珠蛘內(nèi)進(jìn)行培育； C步驟所述的培育包括①、在育珠蛘內(nèi)開一用于放置孵育珠核的囊袋；②、將孵育珠核塞入囊袋，囊袋開口處用生物縫合線縫合；③、對經(jīng)②步驟處理后的育珠蛘進(jìn)行培育。珍珠培育生物的吐珠率，如果從時間過程上看，可以分成前后兩種情況，前一種情 況是指，在孵育珠核塞入囊袋的過程中，發(fā)生吐珠現(xiàn)象(即孵育珠核難以塞入囊袋)；后一 種情況是，在孵育珠核塞入囊袋后，發(fā)生吐珠現(xiàn)象。這兩種現(xiàn)象均會造成珍珠培育生物的吐 珠率增高，給珍珠培育工作帶來困難?，F(xiàn)有技術(shù)在遇到本發(fā)明上述困難時，一般只能有意識的解決后一種情況所帶來的 吐珠率提高的問題，所采取的方案通常是將插入的珠核直徑減少，雖然這種做法能夠從某 種程度上解決后一種情況所帶來的吐珠率提高的問題，但這一方案卻在解決問題的同時帶 來了新的技術(shù)問題，即插入的珠核直徑減少，所培育出來的珍珠顆粒也就比較小，滿足不了 國際市場的需求。本發(fā)明的解決思路是同時針對珍珠培育生物吐珠率高的兩個方面全面展開的，一方面，對于后一種情況，本發(fā)明通過生物縫合的技術(shù)手段能夠從根本上杜絕育珠蛘在插入 珠核后，發(fā)生吐珠現(xiàn)象；另一方面，對于前一種情況，本發(fā)明經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，孵育珠核囊袋的 開口處并不是設(shè)置在珍珠培育生物的培育器官上的(以蛘類為例，培育器官為蛘體的內(nèi)臟 團(tuán))，這樣的器官往往不具有良好的肌肉收縮性能，孵育珠核塞入其中后，囊袋開口處的珠 核容納量并沒有多大變化，在這種情況下，孵育珍珠很容易從囊袋開口處突出，并最終脫離 蛘體。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，以蛘類為例，蛘體內(nèi)臟團(tuán)與斧足的交界處具有較好的肌肉收縮性 能，因此，將囊袋開口處設(shè)置在這一部位，可以大大的增加囊袋開口處的珠核容納量，從而 使孵育珠核塞入囊袋過程變得容易。 使用本發(fā)明的技術(shù)方案不但能夠解決珍珠培育生物高吐珠率的技術(shù)問題，而且還 得到了一個附加的技術(shù)效果，那就是囊袋開口處由于可以用生物縫合線縫合，因此囊袋開 口處可以盡可能的開大些(不影響有核珍珠培育效果的前提下)，以容納直徑更大的孵育 珠核，從而為培育出大直徑的珍珠創(chuàng)造基本條件，一般說來，本發(fā)明所述孵育珠核的直徑為 8-10mmo當(dāng)然，生物縫合線縫合后，塞入口(即囊袋開口處)也需要進(jìn)行必要的處理，以使 塞入口不至于受到感染而產(chǎn)生病變，從而嚴(yán)重影響珍珠培育效果，或者導(dǎo)致育珠蛘的死亡。為此，本發(fā)明方法中的c步驟在②步驟和③步驟之間還增設(shè)了清洗消毒步驟先用抗菌素在②步驟的囊袋開口處進(jìn)行清洗，然后將促肌肉生產(chǎn)藥物涂抹到②步 驟的囊袋開口處上以使囊袋開口處的肌肉快速復(fù)原。


圖1為實(shí)施例所述將附著外套膜細(xì)胞的珠核用鑷子塞進(jìn)內(nèi)臟團(tuán)囊袋深處的操作 示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員很好的理解本發(fā)明的具體技術(shù)特征，以利于本發(fā)明的實(shí) 施，現(xiàn)對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。一種培育大顆粒有核珍珠的方法，包括第一、從蛘體上獲得外套膜外表皮細(xì)胞， 第二、用得到的外套膜外表皮細(xì)胞孵育珠核，得到孵育珠核，第三、將孵育珠核植入育珠蛘 內(nèi)進(jìn)行培育。其中每個步驟中又包含若干小步驟，對于第三步驟而言，它又可以分為1、在育珠蛘內(nèi)開一用于放置孵育珠核的囊袋；2、將孵育珠核塞入囊袋，囊袋開口處用生物縫合線縫合；3、對經(jīng)2步驟處理后的育珠蛘進(jìn)行培育。技術(shù)人員可以明白的從本說明書發(fā)明內(nèi)容得知，上面提到的第一、第二、第三、1、2 以及3步驟分別對應(yīng)發(fā)明內(nèi)容部分的a、b、c、①、②以及③步驟，技術(shù)人員可以將
發(fā)明內(nèi)容
部分所涉及的各種為產(chǎn)生相應(yīng)技術(shù)效果而提供的改進(jìn)的技術(shù)方案應(yīng)用到本具體實(shí)施方式
中來。本具體實(shí)施方式
的主要目的就是在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，再對技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn) 一步的擴(kuò)充或者改進(jìn)，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)更好的技術(shù)效果。
其一，本具體實(shí)施方式
對第一步驟進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)化，細(xì)化后的第一步驟包括I、從蛘體上分離外套膜外表皮組織；II、將外套膜外表皮組織放入胰酶消化液消化，收集外套膜外表 皮細(xì)胞。為了減少細(xì)菌等有害病原物對外套膜外表皮組織的感染，可以進(jìn)一步的在在I步 驟和II步驟之間設(shè)置沖洗步驟用PBS及抗生素(例如青霉素及鏈霉素的混合物等)的混合洗液沖洗外套膜外表 皮組織。并且最好將II步驟中的胰酶消化液的質(zhì)量百分比濃度設(shè)定在0. 25% -0. 32%之 間，本具體實(shí)施方式
發(fā)現(xiàn)，這樣的濃度設(shè)置可以完全將外套膜外表皮細(xì)胞從外套膜外表皮 組織上剝離，而又不會給外套膜外表皮細(xì)胞造成傷害。其二，本具體實(shí)施方式
對第二步驟進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)化，細(xì)化后的第二步驟包括(1)、用多聚賴氨酸處理珠核；(2)、用第一步驟獲得的外套膜外表皮細(xì)胞，孵育(1)步驟得到的珠核，使珠核外 附著至少一層外套膜外表皮細(xì)胞，形成孵育珠核。第二步驟在上述(1)、(2)工作之前，一般需要對珠核進(jìn)行滅菌處理。(2)步驟在保障本具體實(shí)施方式
珍珠培育效果方面的作用是十分巨大的，具體的 來講大量外套膜外表皮細(xì)胞均勻附著外膜上表皮細(xì)胞，使外表皮細(xì)胞在移行增值過程 中能均勻包裹珠核，珍珠質(zhì)的分泌和沉積分布均勻，避免了疵珠，并有效地縮短育珠時間。為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何判斷珠核外已經(jīng)附著至少一層外套膜外表皮 細(xì)胞，并且能夠保證外套膜外表皮細(xì)胞是均勻的附著在珠核外表面上，本具體實(shí)施方式
提 供了一種判斷標(biāo)準(zhǔn)孵育后的珠核在倒置顯微鏡下，技術(shù)人員能夠觀測到外套膜外表皮細(xì)胞已經(jīng)鋪 滿了珠核表面，形成單層細(xì)胞層，并且在水相中輕輕彈動珠核，細(xì)胞不會從珠核上脫離。為了保證(2)步驟中的孵育工作能夠順利進(jìn)行，必須事先在珠核表面用粘附劑 (例如(1)步驟中的多聚賴氨酸)處理以使最先接觸珠核表面的外套膜外表皮細(xì)胞能夠順 利的粘附在珠核表面上，然后再利用這些已經(jīng)附在珠核表面的外套膜外表皮細(xì)胞進(jìn)行繁殖 培養(yǎng)。在實(shí)際操作過程中，對粘附劑粘度大小的選擇是有限制的，一般來說，粘度太大， 不便于珠核孵育的操作，粘度太小細(xì)胞附著在珠核上的能力較小。采用的調(diào)控粘附劑粘度的手段，一般有兩種，對于本具體實(shí)施方式
提到的多聚賴 氨酸而言，可以從多聚賴氨酸的分子量及多聚賴氨酸的濃度這兩方面來調(diào)節(jié)粘度，任何一 種調(diào)節(jié)手段都可以單獨(dú)使用，但是兩種調(diào)節(jié)手段同時使用時，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般能夠獲 得更為精準(zhǔn)的粘度調(diào)節(jié)效果。為滿足本具體實(shí)施方式
在珠核表面上粘附外套膜外表皮細(xì)胞的需要，(1)步驟的 多聚賴氨酸的分子量在10000-150000之間，多聚賴氨酸的濃度可以設(shè)定為0. 1-0. 2mg/ml。(2)步驟中孵育(1)步驟得到的珠核的溫度一般能夠適應(yīng)外套膜外表皮細(xì)胞的生 長繁殖即可，本具體實(shí)施方式
將該溫度設(shè)定為25°C _27°C。下面再向本領(lǐng)域技術(shù)人員演示下，應(yīng)用本具體實(shí)施方式
的實(shí)施例。
實(shí)施例本實(shí)施例采用1齡左右健康、活力強(qiáng)的小蛘為外套膜外表皮組織的獲取來源。第一、采用撕膜法分離河蛘的外套膜外表皮組織。所采用的撕膜法，能夠使獲得的外套膜組織成分單一，不含內(nèi)表皮組織或細(xì)胞，從而有助于高純度外套膜外表皮細(xì)胞的獲得。第二，在無菌室內(nèi)，取外套膜外表皮組織在PBS溶液(含8g/LNaCl、0. 2g/LKCl、 1. 44g Na2HP04/L 和 0. 24g/L KH2PO4, pH 為 7. 4)中洗滌，然后用 PBS+200IU/mL 雙抗(青霉 素及鏈霉素)、PBS+1000IU/mL雙抗、PBS+200IU/mL雙抗洗液的次序各沖洗組織一次，最后 用PBS再次沖洗。第三、取處理過的組織剪成2mm3大小的小塊，用PBS沖洗小片2次，然后在組織小 片中加入0. 3%的胰酶消化液于37°C下消化30min，以完全培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)并分散細(xì) 胞，靜止IOmin后取水相，離心后收集細(xì)胞。用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù) 在5 X IO5-I X IO6個/mL，置于26°C CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。第四、采用與珍珠同質(zhì)的貝殼磨制的圓球形、扁平形珠核，直徑為8mm，洗滌后高壓 蒸汽滅菌，干燥后用0. lmg/mL的多聚賴氨酸(分子量為15，000)浸泡8小時。取出珠核， 使用恒溫干燥箱在60°C下干燥，期間確保處理過程無菌污染。在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)，用獲得的外 表皮細(xì)胞及培養(yǎng)液在CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育處理的珠核，溫度26°C，孵育時間為8h，用具體 實(shí)施方式提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，使珠核外充份附著大量的外套膜外表皮細(xì)胞。第五、選取健康有活力的3齡育珠蛘，其長達(dá)到13cm、寬達(dá)到10cm、殼高達(dá)到3. 5cm 以上，清洗外殼泥土和藻類，開殼器開殼后用“U”型架支撐殼的開口，使用75%的酒精棉球 對手術(shù)部位進(jìn)行擦拭，用開口針在內(nèi)臟團(tuán)2與斧足3交界處水平鉤開約15mm開口 4，并使 用通片針向內(nèi)臟團(tuán)2方向打開一口袋裝囊袋，將附著外套膜細(xì)胞的珠核1用鑷子塞進(jìn)內(nèi)臟 團(tuán)囊袋深處(插核部位見圖1)。插核完成后，采用單手打結(jié)法用特殊生物線對傷口進(jìn)行縫 合，防止吐珠，使傷口處組織貼附在一起，同時用抗菌素和促肌肉生長藥物在傷口縫合處加 以清洗和涂抹以降低傷口感染，促進(jìn)肌肉再生。經(jīng)術(shù)后縫合的的育珠蛘在清水池中暫養(yǎng)8 小時后豎直吊養(yǎng)于水下20cm中，進(jìn)行珍珠培育。此外，本實(shí)施例植入的珠核直徑較大(為8mm)，為了降低珠核對內(nèi)臟團(tuán)的機(jī)械損 傷，降低蛘的死亡率，植入的珠核采用一蛘一珠的方式。其培育結(jié)果可達(dá)75%左右的成珠 率，獲得珍珠直徑至少在IOmm以上，培育時間為兩年半左右。
權(quán)利要求
一種培育大顆粒有核珍珠的方法，包括a、從蚌體上獲得外套膜外表皮細(xì)胞，b、用得到的外套膜外表皮細(xì)胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、將孵育珠核植入育珠蚌內(nèi)進(jìn)行培育；其特征在于c步驟所述的培育包括①、在育珠蚌內(nèi)開一用于放置孵育珠核的囊袋；②、將孵育珠核塞入囊袋，囊袋開口處用生物縫合線縫合；③、對經(jīng)②步驟處理后的育珠蚌進(jìn)行培育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于②步驟中的孵 育珠核的直徑為8-10mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于①步驟中 的囊袋開口處位于內(nèi)臟團(tuán)與斧足的交界處。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于所述c步 驟在②步驟和③步驟之間還增設(shè)了清洗消毒步驟先用抗菌素在②步驟的囊袋開口處進(jìn)行清洗，然后將促肌肉生產(chǎn)藥物涂抹到②步驟的 囊袋開口處上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于a步驟包括I、從蛘體上分離外套膜外表皮組織；II、將外套膜外表皮組織放入胰酶消化液消化，收集外套膜外表皮細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于a步驟在I步 驟和II步驟之間還設(shè)有沖洗步驟用PBS及抗生素的混合洗液沖洗外套膜外表皮組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于所述沖洗步驟 中的抗生素為青霉素及鏈霉素的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于II步驟中的胰 酶消化液的質(zhì)量百分比濃度為0. 25% -0. 32%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于b步驟包括(1)、用多聚賴氨酸處理珠核；(2)、用a步驟獲得的外套膜外表皮細(xì)胞，孵育(1)步驟得到的珠核，使珠核外附著至少 一層外套膜外表皮細(xì)胞，形成孵育珠核。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于b步驟還包括 在(1)步驟之前對珠核進(jìn)行滅菌處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于(2)步驟中孵 育(1)步驟得到的珠核在25°C _27°C條件下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于(1)步驟的多 聚賴氨酸的分子量在10000-150000之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于多聚賴氨酸 的濃度為 0. 1-0. 2mg/ml。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種培育大顆粒有核珍珠的方法，其特征在于多聚賴氨酸的濃 度為 0. 1-0. 2mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培育大顆粒有核珍珠的方法，為了解決現(xiàn)有培育有核珍珠的過程中，插入珠核后，珍珠培育生物(例如河蚌等)一般具有高吐珠率的問題，本發(fā)明提供了一種培育大顆粒有核珍珠的方法，該方法包括a、從蚌體上獲得外套膜外表皮細(xì)胞，b、用得到的外套膜外表皮細(xì)胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、將孵育珠核植入育珠蚌內(nèi)進(jìn)行培育；其中c步驟分為①在育珠蚌內(nèi)開一用于放置孵育珠核的囊袋；②將孵育珠核塞入囊袋，囊袋開口處用生物縫合線縫合；③對經(jīng)②步驟處理后的育珠蚌進(jìn)行培育。本發(fā)明方法能夠順利解決上述技術(shù)問題，并且能夠使培育出來的珍珠的直徑一般在10mm以上。
文檔編號A01K61/00GK101803581SQ20101016283
公開日2010年8月18日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者施志儀, 李文娟, 賈亮 申請人:上海海洋大學(xué)