專利名稱：：殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)的生物防治領(lǐng)域，尤其涉及殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：西蘭花(BrassicaoleraceaL.var.italica)又稱綠花菜、青菜花，其花球由肥嫩的主軸、多個(gè)肉質(zhì)花梗和發(fā)育不全的花蕾組成，19世紀(jì)末由歐美傳入，近年來在我國東部沿海地區(qū)大量種植。西蘭花由于它極高的營養(yǎng)價(jià)值已經(jīng)成為世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。然而，植物病原特別是細(xì)菌病原嚴(yán)重制約了西蘭花的生產(chǎn)。國外研究已顯示機(jī)遇性致病菌假單胞菌(Pseudomonasspp.)、邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginalis)、熒光假光胞菌(Pseudomonasfluorescens)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌古月蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora)或古月蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴暮黑胚亞種(Pectobacteriumcarotovorasubsp.atroseptica)都能引起西蘭花花球病害，這些細(xì)菌單獨(dú)或復(fù)合侵染，造成作物的減產(chǎn)，損失一般在30%100%。國內(nèi)李斌等(2009)首次發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(P.fluorescens)在我國寧波地區(qū)引起西蘭花細(xì)菌性頭腐病，該病害自2005年起連續(xù)危害寧波市特別是寧?？h種植的西蘭花的生產(chǎn)，其病狀表現(xiàn)為花球中出現(xiàn)褐色腐爛斑塊，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民稱之為“爛球病”，嚴(yán)重田塊的病害發(fā)生率在65%81%。然而，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)有效的化學(xué)制劑來防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病，應(yīng)用較廣的銅制劑對該病害的效果也不好。因此發(fā)明新的有效的生化試劑來抵抗這種病害非常有必要。殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙酰化處理后的產(chǎn)物，通常將脫乙酰度大于55%的甲殼素稱作殼聚糖，其學(xué)名為聚氨基葡萄糖，化學(xué)名(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，廣泛存在于蝦、蟹等動(dòng)物外殼和藻類、真菌的細(xì)胞壁中。殼聚糖是一種抗菌譜較廣的天然物質(zhì)，對細(xì)菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用。殼聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及無毒副作用，其分子內(nèi)含有-OH和-ΝΗ2-活性基團(tuán)，易與多種有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)，目前廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、環(huán)境保護(hù)和水處理等領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病中的應(yīng)用，解決了傳統(tǒng)殺菌劑防效差、毒害副作用大的問題。殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐中的應(yīng)用，殼聚糖通過抑制細(xì)菌性頭腐病的感染菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)的生長，進(jìn)而預(yù)防和治療西蘭花細(xì)菌性頭腐病。其具體防治方法可以是將殼聚糖配置成溶液，在發(fā)病前或發(fā)病后的西蘭花頭部噴灑，噴灑濃度在0.050.lmg/ml，可以有效降低西蘭花細(xì)菌性頭腐病的病害發(fā)生率和病斑直徑。本發(fā)明還提供了一種殼聚糖在制備防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病藥劑中的應(yīng)用，該藥劑以殼聚糖為主要成分，添加必要的藥用附加劑制得。本發(fā)明又提供了一種防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病的藥劑，該藥劑以殼聚糖為主要原料，水為溶劑，其制備過程是先將殼聚糖粉末溶解于體積百分比為1%的乙酸溶液中，然后加水配制成相應(yīng)濃度的溶液，最后用NaOH調(diào)配成PH值為6.0左右，其中乙酸只是為了溶解殼聚糖，對量沒有要求。上述殼聚糖脫乙酰度優(yōu)選為大于75%，最好是大于85%，防效更好。采用上述殼聚糖溶液不僅在離體條件下能抑制熒光假單胞菌(P.fluorescens)的生長，而且在西蘭花活體上能有效降低頭腐病的發(fā)生率和病斑直徑。當(dāng)采用脫乙酰度為85%，濃度為0.lmg/ml的殼聚糖溶液在發(fā)病前或發(fā)病后的西蘭花頭部噴灑，分別可以降低發(fā)病率約80%和55%，分別減小病斑直徑約95%和75%。圖1為實(shí)施例2中不同濃度的殼聚糖溶液A對熒光假單胞菌(P.fluorescens)生長的影響；圖2為實(shí)施例2中不同濃度的殼聚糖溶液B對熒光假單胞菌(P.fluorescens)生長的影響；圖3為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液A預(yù)處理對西蘭花病害發(fā)生率的影響；圖4為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液A預(yù)處理對西蘭花病害抑制率的影響；圖5為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液A預(yù)處理對西蘭花病斑直徑的影響；圖6為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液A預(yù)處理對西蘭花病斑直徑抑制率的影響；圖7為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液B預(yù)處理對西蘭花病害發(fā)生率的影響；圖8為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液B預(yù)處理對西蘭花病害抑制率的影響；圖9為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液B預(yù)處理對西蘭花病斑直徑的影響；圖10為實(shí)施例4中不同濃度的殼聚糖溶液B預(yù)處理對西蘭花病斑直徑抑制率的影響；圖11為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液A后處理對西蘭花病害發(fā)生率的影響；圖12為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液A后處理對西蘭花病害抑制率的影響；圖13為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液A后處理對西蘭花病斑直徑的影響；圖14為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液A后處理對西蘭花病斑直徑抑制率的影響；圖15為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液B后處理對西蘭花病害發(fā)生率的影響；圖16為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液B后處理對西蘭花病害抑制率的影響；圖17為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液B后處理對西蘭花病斑直徑的影響；圖18為實(shí)施例5中不同濃度的殼聚糖溶液B后處理對西蘭花病斑直徑抑制率的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備殼聚糖溶液將脫乙酰度為75%和85%的殼聚糖粉末分別溶解于體積百分比為的乙酸中，配制成濃度為5mg/ml的殼聚糖溶液A和殼聚糖溶液B，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，在室溫下?lián)u24小時(shí)，用高壓滅菌鍋121°C滅菌20分鐘，待用。實(shí)施例2檢測殼聚糖不同濃度時(shí)的抑菌活性本實(shí)施例的熒光假單胞菌(P.fluorescens)PFB-Ol由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供，該菌株為試驗(yàn)材料，其特異性對試驗(yàn)結(jié)果沒有影響，下同。在實(shí)施例1制得的5mg/ml的殼聚糖溶液A或殼聚糖溶液B里加入無菌的去離子水配制成濃度為0.01,0.05和0.10mg/ml的殼聚糖溶液。在各濃度的殼聚糖溶液中接種相同體積的熒光假單胞菌(P.fluorescens)菌懸液(108CFU/ml)，160r/min、28°C條件下振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，實(shí)驗(yàn)以pH為6.0的無菌去離子水作為殼聚糖處理的對照，最終采用計(jì)數(shù)法檢測培養(yǎng)液中的菌體數(shù)。每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)。當(dāng)選用殼聚糖溶液A時(shí)，檢測結(jié)果如圖1所示，殼聚糖溶液在不同濃度時(shí)對熒光假單胞菌(P.fluorescens)表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，而且隨著濃度的增加抑菌活性逐漸增強(qiáng)。與對照相比，殼聚糖溶液在濃度0.01mg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量下降了1.90(LogCFU/ml)，在濃度0.05mg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量下降了3.42(LogCFU/ml)，但濃度0.lmg/ml時(shí)的細(xì)胞數(shù)量與0.05mg/ml的細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差別。當(dāng)選用殼聚糖溶液B時(shí)，檢測結(jié)果如圖2所示，與對照相比，殼聚糖溶液在濃度0.0lmg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量下降了0.73(LogCFU/ml)，在濃度0.lmg/ml時(shí)細(xì)胞數(shù)量下降了4.98(LogCFU/ml)，因此殼聚糖溶液在0.lmg/ml時(shí)抑菌活性最高。實(shí)施例3檢測殼聚糖在不同接種時(shí)間下的抑菌活性吸取實(shí)施例1制得的5mg/ml的殼聚糖溶液A或殼聚糖溶液B100μ1，加入4.9ml無菌去離子水配制成濃度為0.10mg/ml的殼聚糖溶液。在殼聚糖溶液中接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)菌懸液(108CFU/ml)，160r/min、28°C條件下振蕩培養(yǎng)0,2,4,6,12,24小時(shí)后檢測熒光假單胞菌(P.fluorescens)的生長情況。實(shí)驗(yàn)以pH為6.0的無菌去離子水作為殼聚糖處理的對照，每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)。當(dāng)選用殼聚糖溶液A時(shí)，結(jié)果如表1顯示，作為對照的無菌去離子水中接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)2小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量下降了0.20(LogCFU/ml)，接下來菌量保持穩(wěn)定。而處理組殼聚糖溶液中熒光假單胞菌(P.fluorescens)細(xì)胞數(shù)量顯著下降，與對照相比，接種2小時(shí)后，殼聚糖溶液中的細(xì)胞數(shù)量減少了2.60(LogCFU/ml)，在接種12小時(shí)后，殼聚糖溶液中的細(xì)胞數(shù)量減少了3.29(LogCFU/ml)(見表1)。表明殼聚糖溶液的抑菌活性在接種時(shí)間024小時(shí)內(nèi)逐漸增強(qiáng)。表1殼聚糖溶液A不同接種時(shí)間對P.fluorescensPFB-01的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>當(dāng)選用殼聚糖溶液B時(shí)，結(jié)果如表2顯示，作為對照的無菌去離子水中接種熒光假單胞菌(P.fIuorescens)2小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量下降了0.20(LogCFU/ml)，接下來菌量保持穩(wěn)定。而處理組殼聚糖溶液中熒光假單胞菌(P.fluorescens)細(xì)胞數(shù)量顯著下降。與對照相比，接種2小時(shí)后，殼聚糖溶液中的細(xì)胞數(shù)量減少了4.43(LogCFU/ml)，在接種12小時(shí)后，殼聚糖溶液中的細(xì)胞數(shù)量減少了5.55(LogCFU/ml)(見表2)。表明殼聚糖溶液的抑菌活性在接種時(shí)間012小時(shí)內(nèi)逐漸增強(qiáng)，在1224小時(shí)內(nèi)反而降低。表2殼聚糖溶液B不同接種時(shí)間對P.fluorescensPFB-Ol的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4殼聚糖處理過的西蘭花上接種熒光假單胞菌試驗(yàn)材料為未使用過殺菌劑和殼聚糖的西蘭花。在實(shí)施例1制得的5mg/ml的殼聚糖溶液A或殼聚糖溶液B里加入無菌的去離子水配制成濃度為0.05和0.10mg/ml的殼聚糖溶液。在西蘭花上用殺菌劑(100ug/ml的噻唑鋅)和上述殼聚糖溶液做噴霧處理，對照實(shí)驗(yàn)用無菌水噴霧處理，待干。然后在西蘭花株頭部接種50μ1菌懸液(108CFU/ml)，每株植株接種10個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)處理設(shè)三株植株。將接種后的植株放置于溫度28°C、相對濕度90%的人工氣候箱中，光照條件下培養(yǎng)16小時(shí)，黑暗條件下培養(yǎng)8小時(shí)。一周后檢測發(fā)病率和病斑大小。當(dāng)選用殼聚糖溶液A時(shí)，結(jié)果如圖3和圖4所示，病原菌接種后的病發(fā)率達(dá)83.3%，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)病發(fā)率顯著下降。0.10mg/ml和0.05mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果都比殺菌劑略差，但沒有顯著差別。與0.05mg/ml的殼聚糖溶液相比，0.10mg/ml的殼聚糖溶液反而增加了病害發(fā)生率，降低了抑制率。如圖5和圖6所示，病原菌接種后病斑直徑為6.1mm，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)病斑直徑顯著下降。0.10mg/ml和0.05mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果都比殺菌劑略差，但沒有顯著差別。與0.05mg/ml的殼聚糖溶液相比，0.10mg/ml的殼聚糖溶液降低了病斑的大小和發(fā)生率。當(dāng)選用殼聚糖溶液B時(shí)，結(jié)果如圖7和圖8所示，病原菌接種后的病發(fā)率達(dá)83.3%，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)病發(fā)率顯著下降。其中，0.10mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果比殺菌劑好，能有效降低西蘭花的病害發(fā)生率，而0.05mg/ml的殼聚糖溶液和殺菌劑的處理效果沒有顯著差別。如圖9和圖10所示，病原菌接種后病斑直徑為6.1mm，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種熒光假單胞菌(P.fluorescens)病斑直徑顯著下降。其中，0.10mg/ml的殼聚糖溶液能顯著降低病斑大小，而0.05mg/ml的殼聚糖溶液和殺菌劑的處理效果沒有顯著差別。實(shí)施例5殼聚糖處理發(fā)病的西蘭花在實(shí)施例1制得的5mg/ml的殼聚糖溶液A或殼聚糖溶液B里加入無菌的去離子水配制成濃度為0.05和0.10mg/ml的殼聚糖溶液。在健康的西蘭花上接種50μ1菌懸液(108CFU/ml)，待干。用殺菌劑(100ug/ml的噻唑鋅)或上述殼聚糖溶液做噴霧處理，對照實(shí)驗(yàn)用無菌水噴霧處理。每個(gè)處理設(shè)三株植株。將接種后的植株放置于溫度28°C、相對濕度90%的人工氣候箱中，光照條件下培養(yǎng)16小時(shí)，黑暗條件下培養(yǎng)8小時(shí)。一周后檢測發(fā)病率和病斑大小。當(dāng)選用殼聚糖溶液A時(shí)，結(jié)果如圖11和圖12所示，病原菌接種后不做任何處理植株病發(fā)率達(dá)76.7%，用殼聚糖或者殺菌劑處理發(fā)病的植株病發(fā)率顯著下降。0.05mg/ml和0.10mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果都差于殺菌劑，且0.05mg/ml的殼聚糖溶液與殺菌劑有顯著差別。0.10mg/ml殼聚糖溶液的處理效果比0.05mg/ml的殼聚糖溶液來的好。如圖13和圖14所示，病原菌接種后不做任何處理的病斑直徑為5.4mm，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種病原菌病斑直徑顯著下降。0.05mg/ml和0.10mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果都差于殺菌劑，且0.05mg/ml的殼聚糖溶液與殺菌劑有顯著差別。0.10mg/ml殼聚糖溶液的處理效果比0.05mg/ml的殼聚糖溶液來的好。當(dāng)選用殼聚糖溶液B時(shí)，結(jié)果如圖15和圖16所示，病原菌接種后不做任何處理植株病發(fā)率達(dá)76.7%，用殼聚糖或者殺菌劑處理發(fā)病的植株病發(fā)率顯著下降。0.05mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果略差于殺菌劑，而0.10mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果略好于殺菌齊U，但都沒有顯著差別。如圖17和圖18所示，病原菌接種后不做任何處理的病斑直徑為5.4mm，用殼聚糖或者殺菌劑處理過的植株再接種病原菌病斑直徑顯著下降。0.05mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果略差于殺菌劑，而0.10mg/ml的殼聚糖溶液的處理效果略好于殺菌劑，但都沒有顯著差別。權(quán)利要求殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病中的應(yīng)用。2.殼聚糖在制備防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼聚糖的脫乙酰度大于75%。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼聚糖的脫乙酰度大于85%。全文摘要本發(fā)明公開了一種殼聚糖在防治西蘭花細(xì)菌性頭腐病中的應(yīng)用，殼聚糖通過抑制細(xì)菌性頭腐病的感染菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)的生長，進(jìn)而預(yù)防和治療西蘭花細(xì)菌性頭腐病。當(dāng)采用脫乙酰度為85％，濃度為0.1mg/ml的殼聚糖溶液在發(fā)病前或發(fā)病后的西蘭花頭部噴灑，分別可以降低發(fā)病率約80％和55％，分別減小病斑直徑約95％和75％。文檔編號(hào)A01N43/16GK101822249SQ201010162100公開日2010年9月8日申請日期2010年4月30日優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日發(fā)明者劉寶平,周青,唐喬梅,李斌,謝關(guān)林申請人:浙江大學(xué)