專利名稱：一種木霉孢子粉劑及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及微生物活性農(nóng)藥粉劑，具體涉及一種木霉孢子粉劑及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
木霉菌隸屬于半知菌亞門，叢梗目，從梗孢科，是一類具有重要經(jīng)濟意義的生防益 菌。木霉菌對環(huán)境的適應性強、生長速度遠比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空間 和營養(yǎng)源的有力競爭者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入點附近低濃度 營養(yǎng)物質(zhì)迅速占領空間吸收營養(yǎng)使植物病原真菌無法入侵。近年來人為向土壤中引入木霉 菌防治植物病害的研究較為活躍，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和綠色木霉防治洋蔥白腐病、 棉花和黃瓜黃萎病、人參根腐病、茉莉白絹病、西洋參立枯病及多種作物的猝倒病和疫病， 均取得較為理想的防治效果。不同種類木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 將木霉菌用于防治香蕉枯萎病的技術(shù)記載。木霉菌經(jīng)固體發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的孢子，人們通常將大量的木霉菌孢子制成木霉 孢子粉劑以便于對其進行貯藏、運輸和施用。目前常用的木霉孢子粉劑制備方法是用水將 木霉孢子從固體培養(yǎng)基上洗脫下來制成孢子懸浮液，在孢子懸浮液中加入適量吸水劑后將 其在室內(nèi)晾干或用低于50°C的溫度風干制成木霉孢子粉劑。但這種制備方法加工時間長、 效率低、體積大且晾干或風干后的木霉孢子粉劑中木霉孢子的密度較低，不便于貯藏、運輸 和施用。噴霧干燥技術(shù)是指采用霧化法將原料液分散為霧滴并用熱氣體干燥霧滴而獲得干 粉產(chǎn)品的一種干燥方法。由于成本低、易于推廣、采用的設備簡單且有利于干粉產(chǎn)品的大 規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，噴霧干燥技術(shù)在食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領域的運用頗為廣泛。鑒于噴霧干 燥技術(shù)的諸多優(yōu)點，人們曾試圖將噴霧干燥技術(shù)應用到微生物活性農(nóng)藥制備領域，借以解 決微生物粉劑難以在保持高活性的前提下快速制備的難題。但噴霧干燥技術(shù)的溫度參數(shù)通 常在140°C以上，在此高溫條件下微生物容易失去活性。如木霉孢子在超過45°C的溫度條 件下容易失活，孢子懸浮液中的木霉孢子通過高溫高壓噴嘴噴出后基本喪失萌發(fā)能力。因 為人們尚未找到如何在干燥噴霧技術(shù)的高溫條件下保持微生物活性的解決方案，到目前為 止噴霧干燥技術(shù)在微生物活性農(nóng)藥制備領域尚未被合理應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于根據(jù)現(xiàn)有木霉孢子及其制備方法中存在的不足，將噴霧干燥技術(shù) 合理用于微生物活性農(nóng)藥制備，提供一種粉劑密度大，萌發(fā)率高，干燥效率高的木霉孢子粉 劑。本發(fā)明另一目的在于提供上述木霉孢子粉劑的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述木霉孢子粉劑的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種木霉孢子粉劑，包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株
3T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCCNO :3531，保藏日期為2009年12月17日)的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明木霉孢子粉是具有萌發(fā)活性的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段序列可以通過 PCR擴增得到，擴增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反應體系為ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上游引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 游引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反應條件為(1) 94°C，5min， 熱變性；(2)94°C，4k，熱變性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循環(huán)。擴增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木霉孢子粉劑中，所述助干劑為β-環(huán)糊精、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉中的一 種或幾種的混合物。本發(fā)明木霉孢子粉劑的制備方法包括如下步驟(1)將棘孢木霉菌株T1植于PDA培養(yǎng)基上使其復蘇，再采用酵母膏蔗糖培養(yǎng)基進 行菌種繼代培養(yǎng)，待長出直徑為5 7mm的深綠色菌落后，將菌落接種，在酵母膏蔗糖培養(yǎng) 基和麩皮木屑培養(yǎng)物中進行擴大培養(yǎng)，直至長出白色菌絲或綠色孢子；(2)將白色菌絲或綠色孢子制成孢子懸浮液，過濾沉淀為濃縮孢子液；(3)向濃縮孢子液中添加助干劑，每升孢子液中加入助干劑的質(zhì)量為50g，一邊攪 拌一邊噴霧干燥，即得木霉孢子粉劑。上述制備方法中，所述酵母膏蔗糖培養(yǎng)基的最佳配方為酵母膏15g，蔗糖20g， KH2PO4Ig,麥芽膏15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維生素BO. 5mg,維生素CO. 5mg,七水合硫酸 鎂0. 05g，硫酸鐵0. Olg,瓊脂20g,水IL0上述酵母膏蔗糖培養(yǎng)基優(yōu)選高溫滅菌過的培養(yǎng)基，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為 30mino所述菌種繼代培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為48 72h。所述擴大培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為5 7d。所述麩皮木屑培養(yǎng)物是麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水的混合物，其中，麩皮、木 屑、蔗糖三者的質(zhì)量與水的體積比為2 1 0.02，維生素B用量為每千克麩皮木屑培養(yǎng)物 中加入0. 5mg。步驟C3)所述噴霧干燥是將濃縮孢子液添加助干劑后在磁力攪拌器上一邊攪拌 一邊進行噴霧干燥，在90 130°C范圍內(nèi)設定進風溫度、出風溫度在41 55°C，控制進料 量為1 20wt %。作為一種優(yōu)選方案，噴霧干燥過程中進風溫度為110°C，出風溫度為53°C， 進料量為IOwt %。由于木霉菌對環(huán)境的適應性強且生長速度遠比病原真菌快，能對病原真菌產(chǎn)生營 養(yǎng)或空間的競爭，能有效利用植物表面的病原真菌侵入點附近的低濃度營養(yǎng)物質(zhì)迅速生長 占領空間消耗掉營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制了病原真菌的生長和對寄主植物的入侵，達到對植物 病害的防治效果。本發(fā)明木霉孢子粉劑作為微生物活性農(nóng)藥，不僅能有效防治香蕉枯萎病， 還因為棘孢木霉菌株T1具有廣譜性拮抗能力，能拮抗多種病原真菌，防治其他多種植物病 害。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明采用棘孢木霉菌株T1作為生產(chǎn)菌株，其孢子粉生存能力強，適應性廣， 具有廣譜性拮抗能力，除了能對香蕉枯萎病起到有效防治，還能夠拮抗多種病原真菌，尤其 對土傳真菌有顯著的拮抗效果；(2)本發(fā)明將噴霧干燥技術(shù)合理用于微生物活性農(nóng)藥木霉孢子粉劑的制備中，解 決了干燥噴霧技術(shù)的高溫條件下難以保持微生物活性的技術(shù)難題，使得微生物粉劑可以在 保持高活性的前提下快速制備，制備工藝簡單易行，采用的設備簡單，有助于降低干粉產(chǎn) 品的制備成本，易于推廣，有利于干粉產(chǎn)品的大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，節(jié)省了孢子粉劑的制備時 間；(3)本發(fā)明木霉孢子粉劑木霉孢子密度大，萌發(fā)率高，干燥效率高，貯藏空間小，方 便人們對其進行貯藏、運輸和使用。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例11.菌株的復蘇和擴大培養(yǎng)(1)將冷藏的棘孢木霉菌株Tl (Trichoderma asperellum T1)植于PDA培養(yǎng)基上 使其復蘇； (2)采用酵母膏蔗糖培養(yǎng)基，并設定培養(yǎng)溫度為30°C、濕度為70 85%，對經(jīng)過步 驟(1)復蘇后的菌株采用平板進行菌種繼代培養(yǎng)48 72h，直至長出直徑約為5 7mm的 深綠色菌落；(3)將由步驟( 平板繼代培養(yǎng)成的菌落用無菌水洗下，接種于裝有經(jīng)高溫滅菌 的由麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水組成的培養(yǎng)料的茄形瓶中進行孢子擴大培養(yǎng)，設定培 養(yǎng)溫度為30°C、濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為5 7d,每天翻動拍打茄形瓶，至培養(yǎng)物上長 出白色菌絲并在其上長出綠色孢子。2.分離洗滌用無菌水將茄形瓶中的菌絲和孢子洗下制成孢子懸浮液，再將孢子懸浮液經(jīng)過濾 處理后沉淀為濃縮孢子液，然后將濃縮孢子液裝瓶在4 10°C的溫度條件下貯藏。3.噴霧干燥向濃縮孢子液中添加助干劑后在磁力攪拌器上一邊攪拌一邊進行噴霧干燥，設定 干燥器進風溫度為110°c、出風溫度為53°C，進料量為IOwt%。其中酵母膏蔗糖培養(yǎng)基的主要配方酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4 lg，麥芽膏 15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維生素BO. 5mg,維生素CO. 5mg,七水合硫酸鎂0. 05g,硫酸鐵 0. Olg，瓊脂20g，水1000ml。麩皮木屑培養(yǎng)料的每瓶裝瓶量為15g，每瓶加水量5ml，其中麩 皮、木屑、蔗糖干重比為2 1 0.02，維生素B用量為每千克麩皮木屑培養(yǎng)物中含0.5mg。 助干劑為環(huán)糊精，含量50g/L孢子懸浮液。用于酵母膏蔗糖培養(yǎng)基和麩皮木屑培養(yǎng)物 滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為30min。實施例2
以下進一步說明進風溫度、進料量、助干劑類型、助干劑含量等參數(shù)的變化對木霉 孢子粉劑制備的影響。以萌發(fā)率為指標對噴霧干燥的進風溫度和進料量做單因素分析，制備過程中變化 進風溫度、進料量測得不同進風溫度、進料量對所制備孢子粉的影響，從而對比并選擇利 于保證孢子高萌發(fā)率、干燥效果好的進風溫度和進料量范圍。在進料量為5wt%時，設定 9(rc，ioo°c，ii(rc、i2(rc和i3o°c等五個進風溫度，測定各溫度所制備的孢子粉的萌發(fā)率 并記錄干燥效果；在進風溫度為120°c時，設定1襯％、5襯％、10襯％、15襯％和20wt%等五 個進料量，測定各進料量所制備的孢子粉的萌發(fā)率并記錄干燥效果；測得結(jié)果如表1、2 表1進風溫度對萌發(fā)率和干燥效果的影響
權(quán)利要求
1.一種木霉孢子粉劑，其特征在于包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢 木霉菌株T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏號為CGMCC NO 3531)的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉孢子粉劑，其特征在于所述助干劑為環(huán)糊精、馬鈴薯 淀粉、可溶性淀粉中的一種或幾種的混合物。
3.權(quán)利要求1或2所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將棘孢木霉菌株T1植于PDA培養(yǎng)基上使其復蘇，再采用酵母膏蔗糖培養(yǎng)基進行菌 種繼代培養(yǎng)，待長出直徑為5 7mm的深綠色菌落后，將菌落接種，在酵母膏蔗糖培養(yǎng)基和 麩皮木屑培養(yǎng)物中進行擴大培養(yǎng)，直至長出白色菌絲或綠色孢子；(2)將白色菌絲或綠色孢子制成孢子懸浮液，過濾沉淀為濃縮孢子液；(3)向濃縮孢子液中添加助干劑，每升孢子液中加入助干劑的質(zhì)量為50g，一邊攪拌一 邊噴霧干燥，即得木霉孢子粉劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述酵母膏 蔗糖培養(yǎng)基的配方為酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麥芽膏15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g， 維生素BO. 5mg，維生素CO. 5mg，七水合硫酸鎂0. 05g，硫酸鐵0. Olg，瓊脂20g，水IL0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于所述酵母膏蔗糖培養(yǎng)基 為高溫滅菌過的培養(yǎng)基，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述菌種 繼代培養(yǎng)的溫度為30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為48 72h ；所述擴大培養(yǎng)的溫度為 30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為5 7d。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于所述麩皮木屑培養(yǎng)物是 麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水的混合物，其中，麩皮、木屑、蔗糖三者的質(zhì)量與水的體積比 為2 1 0.02，維生素B用量為每千克麩皮木屑培養(yǎng)物中加入0.5mg。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述木霉孢子粉劑的制備方法，其特征在于步驟C3)所述噴霧干燥 的進風溫度為110°C，出風溫度為53°C，進料量為IOwt%。
9.權(quán)利要求1或2所述木霉孢子粉劑的應用，其特征在于所述木霉孢子粉劑用于拮抗 病原真菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述木霉孢子粉劑的應用，其特征在于所述木霉孢子粉劑用于 防治香蕉枯萎病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木霉孢子粉劑及其制備方法和應用。本發(fā)明木霉孢子粉劑包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株T1(Trichodermaasperellum T1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO3531)的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段序列如SEQ ID NO1所示，所述助干劑為β-環(huán)糊精、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明木霉孢子粉劑可以對香蕉枯萎病起到有效防治的效果，還可以拮抗多種病原真菌，尤其對土傳真菌有顯著的拮抗效果。本發(fā)明制備方法節(jié)省了木霉孢子粉劑的制備時間，得到的木霉孢子粉劑密度大、萌發(fā)率高，干燥效率高，便于貯藏、運輸和使用。
文檔編號A01N25/12GK102067885SQ20101013904
公開日2011年5月25日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者周俐, 張頌聲, 方羽生, 李小妮, 蔣剛彪, 詹玉海, 趙瑾, 鐘平生, 高永峰 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學, 廣東省植物保護總站, 惠州市南天生物科技有限公司