專利名稱：組織特異表達(dá)啟動(dòng)子及其獲得方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及組織特異表達(dá)啟動(dòng)子及其獲得方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是指基因中一段能準(zhǔn)確有效起始基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，通常位于基因上游。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)相互作用來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的水平及其時(shí)空表達(dá)的特異性。目前使用最廣泛的組成型啟動(dòng)子是煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。同時(shí)，人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子并初見(jiàn)成效，肌動(dòng)蛋白(Actin)和泛素(WDiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。Mariani等成功地利用煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA^驅(qū)動(dòng)核酸酶 Barnase, RnaseTl基因在花藥中特異表達(dá)，破壞絨氈層，獲得雄性不育油菜，這是首次通過(guò)基因工程創(chuàng)造出雄性不育系。小麥葉中表達(dá)ipt基因，提高細(xì)胞分裂素含量，可使葉綠素降解減緩，葉衰老變慢。水稻種子中富含谷蛋白(Glutelin)，分析發(fā)現(xiàn)GluB，GluD均在種子中特異表達(dá)。對(duì)GluB啟動(dòng)子區(qū)的詳細(xì)分析還鑒定了決定其表達(dá)特異性的GCN4等核心元件。 以往已經(jīng)利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)八氫番茄紅素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成了本不存在的β胡蘿卜素(維生素A原)；也利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大豆鐵蛋白基因，使轉(zhuǎn)基因水稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且促使鐵蛋白主要在胚乳中而不是本來(lái)的糊粉層積累。然而，目前為止分離得到的水稻種子特異啟動(dòng)子并不多，并集中于谷蛋白基因家族。傳統(tǒng)的獲得啟動(dòng)子元件的方法往往存在通量低，針對(duì)性差，工作量大等缺點(diǎn)，而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多植物的全基因組序列已經(jīng)測(cè)序完成，生物芯片技術(shù)的進(jìn)步以及生物信息學(xué)分析方法的完善使人們能夠從基因組學(xué)層面對(duì)植物基因的表達(dá)模式有一個(gè)全面的了解，而不是像以往只能局限于有限的基因。Haberer等通過(guò)對(duì)擬南芥和油菜基因組水平同源基因啟動(dòng)子區(qū)的種間序列分析，利用類似的生物信息學(xué)方法得到了 384個(gè)新的順式元件，并檢測(cè)到了大部分的已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的存在，證明了該方法的可行性。而目前，尚未見(jiàn)有基因組層面尋找水稻種子特異啟動(dòng)子(調(diào)控序列)或增強(qiáng)子的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供組織特異表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1、 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 或 SEQ IDNO :6 任一所示。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)；其中，所述的啟動(dòng)子片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚乳中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:USEQID N0:2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4任一所示。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。在另一優(yōu)選例中，所述的植物是具有胚、胚乳和/或種子結(jié)構(gòu)的植物。在另一優(yōu)選例中，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’ 一3’ ):(多核苷酸_X)n，啟動(dòng)子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQID NO :3、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6 任一所示；其中，η為1-100的正整數(shù)；較佳地，η為1_50的正整數(shù)；更佳地為1_30的正整數(shù)； 如 η 可以為 2，3，4，6，8，10，12，16，20 ；其中X為無(wú)，或長(zhǎng)度在I-IOObp ；較佳地l_50bp，更佳地l_20bp，更佳地l-10bp，更佳地l-5bp，如2、3bp的核酸；其中，啟動(dòng)子的片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子或其片段含有TATA-盒結(jié)構(gòu)。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子選自(但不限于)煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，或煙草花葉病毒(CaMV) 35S基本啟動(dòng)子(CAMV35S mini promoter)。在另一優(yōu)選例中，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動(dòng)子具有SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物的啟動(dòng)子或其片段下游還包括一目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因序列位于所述啟動(dòng)子序列的下游，且是與所述的啟動(dòng)子序列直接鄰近的編碼基因的序列。通常，所述的核酸序列與目的基因序列的間隔小于IOOObp (優(yōu)選的，小于500bp ；更優(yōu)選的，小于200bp ；更優(yōu)選的，小于IOObp ；最優(yōu)選的， 小于50bp)。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)β_葡萄糖苷酶(GUS)基因、 改善稻米或種子品質(zhì)相關(guān)的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸、啟動(dòng)子、目的基因可操作性地相連。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種植物細(xì)胞(優(yōu)選為非繁殖材料)，所述的細(xì)胞中含有所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的構(gòu)建物的用途，用于調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)。
在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4任一所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚乳中特異性表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO 5 所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚中特異性表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO 6 所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種調(diào)控目的基因在植物組織(胚乳、胚或種子中)特異性表達(dá)的方法，所述方法包括(1)提供一構(gòu)建物(表達(dá)載體)，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’ 一 3’)(多核苷酸-x)n，啟動(dòng)子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDN0:USEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 或 SEQ IDNO :6 任一所示；η 為 1-100 的正整數(shù)；X為無(wú)，或長(zhǎng)度在I-IOObp的核酸；其中啟動(dòng)子的片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構(gòu)建物的下游；(3)將步驟⑵插入目的基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞或組織中；和(4)將步驟C3)獲得的轉(zhuǎn)入了所述多核苷酸的植物細(xì)胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的組織(胚乳、胚或種子)中特異性表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選例中，調(diào)控目的基因在植物胚乳中特異性表達(dá)，在步驟(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4任一所不。在另一優(yōu)選例中，調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)，在步驟(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :5任一所示。在另一優(yōu)選例中，調(diào)控目的基因在植物種子中特異性表達(dá)，在步驟(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 6任一所示。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1顯示了構(gòu)建的表達(dá)載體的示意圖。圖2顯示了 35S基本啟動(dòng)子不會(huì)使GUS在種子中表達(dá)。圖3顯示了胚乳特異基序(pESl，3，4)的組織特異性表達(dá)情況。圖片第一行為種子，第二行為花，第三行為葉，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區(qū)域?yàn)榘l(fā)生GUS染色的區(qū)域。圖4胚乳特異基序(pES》，胚特異基序(pBYl)、種子特異基序(pRSl)的組織特異性表達(dá)情況。圖片第一行為種子，第二行為葉，第三行為花，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區(qū)域?yàn)榘l(fā)生GUS染色的區(qū)域。圖5顯示了順式作用元件(cis-element)預(yù)測(cè)的主要流程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，首次通過(guò)篩選分離到一些指導(dǎo)基因在特定植物組織中特異性表達(dá)的多核苷酸(基序)，所述的多核苷酸在與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段(如基本啟動(dòng)子)連接后，可指導(dǎo)下游的目的基因特異性地表達(dá)在植物的胚、胚乳或種子中。因此， 可應(yīng)用這些多核苷酸來(lái)調(diào)控植物組織中基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物品種改良等。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，除非另外說(shuō)明，所述的“多核苷酸”或“基序(motif)”是指一條對(duì)于調(diào)控基因的表達(dá)有用的核苷酸序列(序列單位)，其可以作為一種順式元件，也可以作為一種增強(qiáng)子。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)包括啟動(dòng)子的變體，其通過(guò)插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來(lái)獲得。組織或器官特異型啟動(dòng)子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中。所述的“啟動(dòng)子片段”是指具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的該啟動(dòng)子的片段；也即，該“啟動(dòng)子片段”保留了其相應(yīng)的啟動(dòng)子的基本功能。較佳地，所述的啟動(dòng)子片段可以是基本啟動(dòng)子或核心啟動(dòng)子。如本文所用，“順式調(diào)控元件”或“順式元件”是指對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起調(diào)節(jié)作用的保守性堿基序列。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本發(fā)明的基序和啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)的基因。合適的目的基因包括但不限于β-葡萄糖苷酶(GUQ基因、改善植物品質(zhì)或性狀或表型相關(guān)的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)、以及種子中激素合成相關(guān)基因等。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來(lái)自不同來(lái)源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來(lái)說(shuō)是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來(lái)說(shuō)是“外源的”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性表達(dá)”是指目的基因在特定的時(shí)間和/或特定的組織表達(dá)。“組織特異性”又稱“器官特異性”，在一些調(diào)控元件的調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出其相關(guān)的發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。本發(fā)明中，所述的“組織特異性表達(dá)”是指在植物胚乳、胚或種子中特異表達(dá)。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000倍水平被表達(dá)，則認(rèn)為相關(guān)基因的表達(dá)是組織或器官特異性的。如本文所用，所述的“植物”是具有胚、胚乳結(jié)構(gòu)的植物。本領(lǐng)域人員熟知，植物胚或胚乳的組成成分是相似的，具有胚或胚乳結(jié)構(gòu)的植物具有共同的特性，其基因組中存在許多保守的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的基因或調(diào)節(jié)元件，例如一系列調(diào)控植物形成胚或胚乳的元件。因此可以確定可以調(diào)控目的基因在禾本科植物的胚或胚乳或種子中特異性表達(dá)的基序(或基序-啟動(dòng)子)也可以調(diào)控目的基因在禾本科植物以外其它具有胚或胚乳結(jié)構(gòu)的植物產(chǎn)生同樣的表達(dá)特性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱寸。如本文所用，所述的“非繁殖材料”是指一種生物材料，其不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和無(wú)機(jī)鹽等無(wú)機(jī)物合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來(lái)維系生存的特性。本發(fā)明提供一種調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)的基序，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :6 任一所示。其中，如 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ IDNO :3 或 SEQ ID NO :4 任一所示的基序可驅(qū)動(dòng)目的基因在禾本科植物的胚乳中特異性表達(dá)，其核苷酸序列；如SEQ ID N0:5所示的基序可驅(qū)動(dòng)目的基因在禾本科植物的胚中特異性表達(dá)，其核苷酸序列；如SEQ ID NO 6 所示的基序可驅(qū)動(dòng)目的基因在禾本科植物的種子中特異性表達(dá)。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對(duì)核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與前述指定的核苷酸序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少80%，較佳地至少90%，更佳地至少95%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)緊條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫， 如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. l%Fic0ll，42°C等；或C3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調(diào)控作用。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的任一種基序序列具有80%以上，更優(yōu)選90%以上，最優(yōu)選95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調(diào)控作用?！跋嗤浴笔侵赴凑瘴恢孟嗤陌俜直?，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述的基序-啟動(dòng)子的指導(dǎo)下，可以使葡萄糖苷酶(GUS)基因特異地在植物的胚乳、胚或種子中表達(dá)。因此可見(jiàn)，本發(fā)明的基序是一種組織或器官特異性的調(diào)控序列。其對(duì)于定點(diǎn)地改良植物的品質(zhì)(通過(guò)驅(qū)動(dòng)目的基因特異性表達(dá))是特別有用的。葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產(chǎn)生具有發(fā)色團(tuán)或熒光的物質(zhì)，可用分光光度計(jì)、熒光計(jì)或組織化學(xué)等方法對(duì)GUS活性進(jìn)行定量和空間定位分析。在本技術(shù)領(lǐng)域中，GUS基因已被廣泛地用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，特別是其可被用于研究外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位。本發(fā)明的組織特異性表達(dá)相關(guān)基序在理論研究和農(nóng)藝改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這些基序可以被應(yīng)用于標(biāo)記特定組織，引導(dǎo)特定的功能基因在特定的組織中表達(dá)，以及應(yīng)用于特有組織的生長(zhǎng)發(fā)育研究和針對(duì)性改良。所述的基序可以是多次重復(fù)(如2-100 次)的，一般多次重復(fù)可以使功能加強(qiáng)，即增強(qiáng)子的效果是可以累加的，增強(qiáng)子序列合在一起，即使其中間插入一些別的序列，轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)的作用也會(huì)大大增強(qiáng)(參見(jiàn)朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現(xiàn)代分子生物學(xué)；高等教育出版社；2007)。通常，多次重復(fù)序列中，兩個(gè)基序之間插入其它序列(間隔序列)的長(zhǎng)度在I-IOObp，較佳地l-50bp，更佳地l-20bp，更佳地I-IObp， 更佳地Hbp，如2、!3bp。所述的間隔序列例如是酶切位點(diǎn)等。多次重復(fù)序列對(duì)于轉(zhuǎn)錄作用的加強(qiáng)還可參見(jiàn)陳俊，楊之帆，張文雋；4X3^增強(qiáng)子的克隆及其功能驗(yàn)證；華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，02，118-121 ；脅等亦發(fā)現(xiàn)，對(duì)于水稻基因Glu-Bl的啟動(dòng)子中決定其胚乳表達(dá)特異性的GCN4基序，隨著人工構(gòu)建使其重復(fù)次數(shù)的增多，其驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的表達(dá)水平也相應(yīng)得到增強(qiáng)(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2in transgenic rice plants. Plant J. 1998，14，673—83)。本發(fā)明的基序通常與啟動(dòng)子(如基本啟動(dòng)子)操作性連接，再與目的基因操作性連接，從而驅(qū)動(dòng)目的基因的特異性表達(dá)。所述的啟動(dòng)子或其片段沒(méi)有特別的限制，只要其含有TATA-盒結(jié)構(gòu)，可引發(fā)轉(zhuǎn)錄， 且在與所述基序連接后對(duì)于啟動(dòng)下游基因表達(dá)是有用的。所述的TATA-盒結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并被本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子研究中。在啟動(dòng)子上，TATA盒一般處于非常接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(通常于50個(gè)堿基對(duì)以內(nèi))的位置。本發(fā)明所述的啟動(dòng)子含有TATA-盒結(jié)構(gòu)，如煙草花葉病毒35S基本啟動(dòng)子 (CAMV35S mini promoter)。35S基本啟動(dòng)子區(qū)主要即TATA-盒結(jié)構(gòu)區(qū)，該結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在(朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現(xiàn)代分子生物學(xué)；高等教育出版社；2007)，并被廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子研究中，Sien等(Shen H，Yang HJ, Wang ZY. Inducible Expression of OsEBP-89 Gene inRice. Journal Of Plant Physiology and Molecular Biology,2004,30 (1) :87-93), Wu 等(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J.1998,14,673—83 ；Wu C, Washida H, Onodera Y, Harada K, Takaiwa F. Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGTand AACA motifs in a rice glutelin gene promoter :minimal cis—elementrequirements for endosperm-specific gene expression. Plant J. 2000,23,415-21), Yoshihara 等(Yoshihara Τ, Washida H, Takaiwa F. A 45_bp proximal regioncontaining AACA and GCN4 motif is sufficient to confer endosperm-specificexpression of the rice storage protein glutelin gene, GluA-3. FEBS Lett. 1996，383，213-8)人在研究中均將不同啟動(dòng)子(增強(qiáng)子)與35S 基本啟動(dòng)子融合來(lái)啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，所述的啟動(dòng)子是煙草花葉病毒(CaMV)35S的基本啟動(dòng)子 (CAMV35S mini promoter)，其含有TATA-盒結(jié)構(gòu)區(qū)，該結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并已被廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子研究中。所述的35S的基本啟動(dòng)子的序列如 CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG AGAG (SEQID NO :27)。
所述的啟動(dòng)子與基序之間直接相連，或者，它們之間還含有其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列的長(zhǎng)度在Ι-lOOObp，較佳地l-500bp，更佳地l-200bp，如100bp，50bp， 20bp，10bp。當(dāng)然，其它長(zhǎng)度(如更長(zhǎng))的間隔序列也是可以存在的，只要其存在不影響上述各元件之間的操作性相連，不抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。所述的間隔序列例如是酶切位點(diǎn)或隨機(jī)序列等。所述的目的基因相對(duì)于基序和啟動(dòng)子而言可以是外源(異源)的。對(duì)所述目的基因的核酸序列沒(méi)有特別的限制(如一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些在農(nóng)業(yè)或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合適的目的基因包括但不限于改良植物品質(zhì)、性狀或代謝相關(guān)的基因。所述的基序和啟動(dòng)子還可以與被改進(jìn)的目的基因序列可操作地連接，該目的基因相對(duì)于啟動(dòng)子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進(jìn)來(lái)產(chǎn)生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進(jìn)來(lái)增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點(diǎn))，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信5寸。此外，所述的基序和啟動(dòng)子可以設(shè)計(jì)成下調(diào)特定基因。這一般是通過(guò)將基序和啟動(dòng)子連接到目的基因序列上來(lái)實(shí)現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。任何一種前述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列可被包含在重組構(gòu)建物(重組載體) 中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發(fā)明的基序，在所述的基序的下游包括啟動(dòng)子，在所述啟動(dòng)子的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)需要表達(dá)目的基因時(shí)， 將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與基序-啟動(dòng)子可操作地連接。作為另一種方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向)引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的基序-啟動(dòng)子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號(hào)，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊灰淠軌蛟谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的基序-啟動(dòng)子，還可含有一種或多種其它基序或啟動(dòng)子。所述的其它啟動(dòng)子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒19S和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增強(qiáng)的CaMV、煙草RB7等。
包含上述適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和目的基因的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母； 植物細(xì)胞等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。作為一種方式，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是將攜帶基序-啟動(dòng)子和目的基因(可操作地連接)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動(dòng)子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉(zhuǎn)基因受體植物例如是水稻、小麥、大麥和玉米。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、表達(dá)特異性的基序的初步篩選本發(fā)明取材營(yíng)養(yǎng)組織(根，葉，苗)，以及不同發(fā)育階段的水稻種子并將其分為胚和胚乳，制作affymatrix芯片。利用該芯片，可以比較準(zhǔn)確的分離出在水稻種子中特異表達(dá)的基因。本發(fā)明人將胚(或者胚乳)作為一個(gè)分析元素，將營(yíng)養(yǎng)組織作為另一個(gè)分析元素，找出相對(duì)營(yíng)養(yǎng)組織特異表達(dá)(顯著高表達(dá))的基因，對(duì)其進(jìn)行非監(jiān)督聚類，得到表達(dá)模式相近的基因組，對(duì)每一組基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行比對(duì)(根據(jù)基序的相似性，所處位置，以及gibbs能量等原則)，獲得候選的可能決定了基因表達(dá)特異性的基序(motif，可能為順式元件，也可能屬增強(qiáng)子)。對(duì)這部分候選基序本發(fā)明人要進(jìn)行二次過(guò)濾篩選。首先，計(jì)算候選基序在整個(gè)基因組范圍內(nèi)以及在種子特異表達(dá)基因中的超幾何分布，檢驗(yàn)其是否高度集中在種子特異高表達(dá)的基因里，選出有顯著差異的基序作后續(xù)分析；其次，根據(jù)第一次篩選的結(jié)果，將其與 PLACE (Plant cis-acting Regulatory DNAElements)和 AGRIS(The Arabidopsis Gene Regulatory Information Server)數(shù)據(jù)庫(kù)中己知植物順式元件相比對(duì)， 去掉已知元件，得到的成員即為最后的計(jì)算結(jié)果，用于下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。順式作用元件預(yù)測(cè)的主要流程見(jiàn)圖5。過(guò)濾篩選前得到結(jié)果中，包含有大部分已知的水稻胚或胚乳特異順式元件，超幾何分布差異分析表明其在種子特異表達(dá)基因中顯著密集(P < 0. 05)，證明了本計(jì)算方法的可行性。另外根據(jù)對(duì)PLACE和AGRIS中已知元件長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)，本發(fā)明人選取分析的基序長(zhǎng)度處于6 31bp范圍內(nèi)。最終，計(jì)算得出胚乳特異基序13個(gè)，胚特異基序18個(gè)，見(jiàn)表1。表1、ρ < 0. 05且在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有匹配序列的基序胚(pBY)和種子(pRS)
motifOlggcctgg0. 04924SEQ id NO 5motif02mccctag0. 019805SEQ id NO 28motif03tagactg0.000184SEQ id NO 29motif04agctagc0.006183SEQ id NO 30motif05cgtccgat0.025469SEQ id NO 31motif06tacataca0.043309SEQ id NO 32motif07gtgcgtgcg0.042511SEQ id NO 33motif08aataagacgaatggtc0.018682SEQ id NO 34motif09tgtaattaca0.012906SEQ id NO 35motiflOtmgcctaatt0. 003255SEQ id NO 36motif11taatagctaa1.14E-06SEQ id NO 37motifl2ctggtctgaccggc2.06E-19SEQ id NO 38motif13gaaacggagggagta0.048481SEQ id NO 39motifl4gtccgtgctgcagctggctacaa0.007973SEQ id NO 6motif15cgcacgca0.003825SEQ id NO 40motif16acgaatgat1.98E-05SEQ id NO 41motif17gctcga0.009138SEQ id NO 42motifl8gtccttgcc1.91E-09SEQ id NO 43胚乳(pES)
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6 任一所示。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸的用途，用于與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)；其中，所述的啟動(dòng)子片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚乳中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 任一所示。
4.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
5.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段操作性連接，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
6.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’一 3’)(多核苷酸-X) n，啟動(dòng)子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6 任一所示； 其中，η為1-100的正整數(shù)； 其中，X為無(wú)，或長(zhǎng)度在I-IOObp的核酸；其中，啟動(dòng)子的片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動(dòng)子或其片段含有TATA-盒結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段選自煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子，或煙草花葉病毒35S基本啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動(dòng)子具有 SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物的啟動(dòng)子或其片段下游還包括一目的基因。
11.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。
12.—種植物細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞中含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求6-11任一所述的構(gòu)建物。
13.權(quán)利要求6-11任一所述的構(gòu)建物的用途，用于調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 4任一所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚乳中特異性表達(dá)。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的胚中特異性表達(dá)。
16.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述的構(gòu)建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，該構(gòu)建物用于驅(qū)動(dòng)目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)。
17. —種調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’一3’)“多核苷酸-幻…啟動(dòng)子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1、SEQID NO :2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6 任一所示；η 為 1-100 的正整數(shù)；X 為無(wú)，或長(zhǎng)度在I-IOObp的核酸；其中啟動(dòng)子的片段具有該啟動(dòng)子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起女口 ；,(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構(gòu)建物的下游；(3)將步驟( 插入目的基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞或組織中；和(4)將步驟C3)獲得的轉(zhuǎn)入了所述多核苷酸的植物細(xì)胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的組織中特異性表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織特異表達(dá)啟動(dòng)子及其獲得方法和應(yīng)用。本發(fā)明首次通過(guò)篩選分離到一些多核苷酸，所述的多核苷酸在與啟動(dòng)子連接后，可指導(dǎo)下游的目的基因特異性地表達(dá)在植物的胚、胚乳或種子中，可應(yīng)用這些多核苷酸來(lái)調(diào)控植物組織中基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物品種改良。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102206638SQ20101013409
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者溫碧清, 薛紅衛(wèi) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院