專利名稱：電磁輻射致癌的Scid小鼠模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電磁輻射致癌的Scid小鼠模型及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，電磁技術(shù)已經(jīng)成為工業(yè)、醫(yī)療、通訊等領(lǐng)域中不可或缺的重要工具之一。電磁技術(shù)在方便人們?nèi)粘Ｉ畹耐瑫r，對人體的影響也受到越來越多的 關(guān)注。電磁波可以透入生物體，并與生物組織發(fā)生相互作用，導(dǎo)致不同生物層次上的形態(tài)、 結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，甚至誘發(fā)癌癥。如何預(yù)防或減少電磁輻射對人體的傷害，已日益成為 生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點。通過對電磁輻射的生物效應(yīng)進(jìn)行深入研 究，目前已經(jīng)提出了多種作用機(jī)理的模型、假說和理論。1982年美國政府制訂了一套基于熱 效應(yīng)的射頻輻射標(biāo)準(zhǔn)，用比吸收率(Specific Absorption Rate，SAR，單位為W/kg)值來衡 量電磁輻射的熱效應(yīng)，該標(biāo)準(zhǔn)逐漸被全世界所接收并沿用至今。但是，越來越多的現(xiàn)象表明 僅僅用SAR值來衡量電磁輻射對人體的影響是不夠的，因為長期的電磁輻射給人體造成一 系列的健康問題無法用熱效應(yīng)解釋和評價。于是，大量研究嘗試分析其它一些參數(shù)指標(biāo)來 確定電磁輻射的危害。Leszczynski 等人(D. Leszczynski, et al. Differentiation. 2002,70:120 ~ 129)研究了電磁輻射對人內(nèi)皮細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)能引起熱休克蛋白27(HSP27)的短暫磷 酸化，并能激活多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)換路徑，并提出電磁輻射誘導(dǎo)的HSP27活化能阻止細(xì)胞 色素C的凋亡路徑，從而導(dǎo)致腦瘤的發(fā)生。Di carlo等人(A.DiCarlo，et al. J. Cell. Biochem. 2002,84 447 454)用功率為3. 5mff的電磁輻射對雞胚胎進(jìn)行每日30 60分鐘 的輻射，連續(xù)輻射4天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比熱休克蛋白70(HSP70)水平下降了 27%，從 而胚胎防御缺氧應(yīng)激的能力降低，提示長期暴露于電磁輻射會由于HSP70水平降低而導(dǎo)致 細(xì)胞自我保護(hù)能力降低，從而增加發(fā)生腫瘤的可能性。Kramarenko等人(Α. V. Kramarenko, et al. Int. J. Neurosci. 2003，113 1007 1019)研究了高頻電磁輻射對人腦電圖的影響， 發(fā)現(xiàn)用手機(jī)照射人腦后，在顳骨部位出現(xiàn)2. 5 6. OHz的慢波，每15 20秒出現(xiàn)一次，持續(xù) 約1秒；在兒童中有類似的發(fā)現(xiàn)，但慢波出現(xiàn)較早、振幅較大、持續(xù)時間長且間隔短，表明手 機(jī)輻射會影響人的大腦，而且可能更容易對兒童大腦造成損傷。然而，并非所有實驗都證明 電磁輻射會對人體的正常生理指標(biāo)產(chǎn)生影響。比如在Tahvanainen等人(K. Tahvanainen, et al. Bioelectromagnetics. 2004,25 73 83)的研究中，他們用 900MHz 和 1800MHz 的 手機(jī)輻射作用于志愿者35分鐘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈血壓和心率與對照組沒有顯著差異。以上這些研究由于受到實驗條件的限制，不能確定長期的電磁輻射所造成的危害 及程度，特別是不能對電磁輻射的致癌作用進(jìn)行評價。由于在實驗研究中利用不同的生物 學(xué)體系，如不同的細(xì)胞或動物亞型及生物體處于不同的生理狀態(tài)等個體差異，或使用不同 的輻射裝置、實驗程序等分析電磁輻射的生物學(xué)后果，有的甚至得出相反的結(jié)論，從而對確 定電磁輻射的致癌作用帶來了困難。因此，目前亟需構(gòu)建一種可靠的動物模型以用于研究 電磁輻射的致癌作用。
Scid小鼠即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠，攜帶位于第16對染色體的單個隱性突變基 因。Scid小鼠外觀與普通小鼠差別不大，但胸腺、脾、淋巴結(jié)的重量不及正常的30%，組織 學(xué)上表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞顯著缺陷。Scid小鼠極易感染，是繼裸鼠出現(xiàn)之后發(fā)現(xiàn)的一種十分有 價值的免疫缺陷動物。目前，利用Scid小鼠構(gòu)建電磁輻射致癌的動物模型的方法尚未見國 內(nèi)外文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方法簡單、重復(fù)性好、效果顯著的電磁輻射致癌的Scid 小鼠模型及構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的一種電磁輻射致癌的Scid小鼠模型及構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將NIH/3T3細(xì)胞在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10% 小牛血清、1 %青霉素、1 %鏈霉素和1 %谷氨酰胺，當(dāng)細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞并擴(kuò)展匯 合后，吸出舊培養(yǎng)液，加入0. 03% Versene溶液沖洗一遍，吸出洗液，然后加入胰蛋白酶消 化液37°C進(jìn)行消化，消化結(jié)束后再進(jìn)行傳代；(2)暴露實驗 將NIH/3T3細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，將裝有NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng) 板置于橫電磁波傳輸小室(Transverse Electromagnetic TransmissionCell，簡稱 TEM 小 室)中，再將TEM小室置于5% CO2培養(yǎng)箱中，同時，將NIH/3T3細(xì)胞暴露于功率密度為30 90ff/m2的電磁輻射下，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為36. 5°C，每天輻射2小時，培養(yǎng)4 6周；(3)軟瓊脂培養(yǎng)實驗配制濃度分別為1. 2%和0. 6%的瓊脂糖溶液，以及2XDMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含 有20%小牛血清、2%青霉素、2%鏈霉素和2%谷氨酰胺，向一支試管中加入2XDMEM培養(yǎng) 液和1. 2%瓊脂糖溶液各lmL，倒入細(xì)胞培養(yǎng)板中，待凝固后制成瓊脂糖基礎(chǔ)層，再向另一 支試管中加入2XDMEM培養(yǎng)液和0. 6%瓊脂糖溶液各0. 5mL，然后接種0. 2mL NIH/3T3細(xì)胞 溶液，均勻混合后加在基礎(chǔ)層上，待凝固后制成雙層瓊脂，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；(4) Scid小鼠致瘤實驗收集經(jīng)過電磁輻射的NIH/3T3細(xì)胞，對2只Scid小鼠進(jìn)行背部皮下接種，每只小 鼠注射細(xì)胞懸液0. lmL，飼養(yǎng)6周后對形成的瘤塊進(jìn)行病理切片檢查。上述步驟(1)中的MH/3T3細(xì)胞是一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞對外界因素 敏感、容易發(fā)生轉(zhuǎn)化，適用于癌基因轉(zhuǎn)化試驗。本發(fā)明方法采用對外界因素敏感、容易發(fā)生轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞系，暴露于電磁 輻射后接種于Scid小鼠，6周后形成腫瘤，表明微波輻射對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有誘導(dǎo)作用。本發(fā)明方法以O(shè)TH/3T3永生細(xì)胞作為體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的靶細(xì)胞，建立了電磁輻 射誘發(fā)腫瘤的Scid小鼠模型。本發(fā)明方法效果顯著、步驟簡單、重復(fù)性好，具有良好的應(yīng)用 前景。本發(fā)明方法建立的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗?zāi)Ｐ涂捎糜谀M體內(nèi)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，為電 磁輻射誘發(fā)腫瘤的發(fā)病機(jī)制及其防治措施的研究提供了一種良好的實驗?zāi)Ｐ秃陀辛Φ募夹g(shù)手段。本發(fā)明方法可以應(yīng)用于工業(yè)、科學(xué)、醫(yī)療以及日常生活中電磁輻射的致癌性風(fēng)險 預(yù)評價，這將對預(yù)防電磁輻射對人體健康的遠(yuǎn)期危害具有重要的價值。


圖1 軟瓊脂糖培養(yǎng)的NIH/3T3細(xì)胞圖片；圖2 =Scid小鼠的腫瘤組織病理切片。
具體實施例方式實施例1(1)NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將NIH/3T3細(xì)胞在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長增殖形 成單層細(xì)胞并擴(kuò)展匯合后，吸出舊培養(yǎng)液，加入0. 03% Versene溶液沖洗一遍，吸出洗液， 然后加入胰蛋白酶消化液37°C進(jìn)行消化，同時在倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，當(dāng)原來的貼 壁細(xì)胞逐漸趨于圓形、胞質(zhì)回縮、間隙增大、細(xì)胞之間不再連接成片時，立即終止消化，吸棄 消化液加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液，用吸管將已經(jīng)消化好的細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸 液吸出分裝至3個培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基旋緊瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(2)暴露實驗將NIH/3T3細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，將裝有NIH/3T3細(xì)胞的培 養(yǎng)板置于橫電磁波傳輸小室(Transverse Electromagnetic TransmissionCell，簡稱 TEM 小室)中，再將TEM小室置于5% CO2培養(yǎng)箱中，同時，將NIH/3T3細(xì)胞暴露于功率密度為 30ff/m2的電磁輻射下，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為36. 5°C，每天輻射2小時，培養(yǎng)6周，電磁輻射由 Agilent 8648C信號源產(chǎn)生，經(jīng)20W功率放大器放大，電磁輻射強(qiáng)度由Narda場強(qiáng)計控制；(3)軟瓊脂培養(yǎng)實驗配制濃度分別為1. 2%和0. 6%的瓊脂糖溶液，高壓滅菌后置于40°C水浴中備用， 配制2XDMEM培養(yǎng)液，高壓滅菌后置于37°C水浴中備用，在試管中加入2XDMEM培養(yǎng)液 lmL，再加入1. 2%瓊脂糖溶液lmL，均勻混合后，倒入細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于室溫，待凝固后 形成瓊脂糖基礎(chǔ)層，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中備用，另取一支試管，加入2XDMEM培養(yǎng)液 0. 5mL，再加入0. 6%瓊脂糖溶液0. 5mL，然后接種0. 2mL NIH/3T3細(xì)胞懸液，均勻混合后，力口 在預(yù)先制備好的基礎(chǔ)層上，放置于室溫，待凝固后形成雙層瓊脂，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成的情況；(4) Scid小鼠致瘤實驗收集經(jīng)過電磁輻射的NIH/3T3細(xì)胞，用帶6號針頭的注射器抽取0. ImL細(xì)胞懸液， 注射于Scid小鼠背部皮下，平行對2只小鼠進(jìn)行接種，飼養(yǎng)6周后觀察致瘤情況，并將形成 的腫瘤組織經(jīng)過固定、包埋和切片后，置于顯微鏡下進(jìn)行病理切片檢查。軟瓊脂糖培養(yǎng)的OTH/3T3細(xì)胞如圖1所示，有細(xì)胞集落形成，集落中央有隆起 ，有 多層細(xì)胞。致瘤實驗的兩只Scid小鼠均出現(xiàn)了腫瘤，形成腫瘤的Scid小鼠接種處皮下出 現(xiàn)結(jié)節(jié)狀隆起。瘤塊體積為1 1. 5cm3，瘤塊表面不平，質(zhì)地硬，中間有壞死，與皮下組織粘 連，為梭形細(xì)胞肉瘤。腫瘤組織病理切片如圖2所示，經(jīng)染色可見瘤組織細(xì)胞相互重疊，呈類多角形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三度空間延伸，浸潤并破壞肌層。實施例2步驟(2)中電磁輻射的功率密度為50W/m2，其它步驟同實施例1。兩只Scid小鼠 均出現(xiàn)了腫瘤。實施例3
步驟(2)中電磁輻射的功率密度為70W/m2，其它步驟同實施例1。兩只Scid小鼠 均出現(xiàn)了腫瘤。實施例4步驟(2)中電磁輻射的功率密度為90W/m2，其它步驟同實施例1。兩只Scid小鼠 均出現(xiàn)了腫瘤。實施例5步驟(2)中暴露時間為4周，其它步驟同實施例1。兩只Scid小鼠均出現(xiàn)了腫瘤。實施例6步驟⑵中暴露時間為4周，其它步驟同實施例2。兩只Scid小鼠均出現(xiàn)了腫瘤。實施例7步驟⑵中暴露時間為4周，其它步驟同實施例3。兩只Scid小鼠均出現(xiàn)了腫瘤。實施例8步驟⑵中暴露時間為4周，其它步驟同實施例4。兩只Scid小鼠均出現(xiàn)了腫瘤。
權(quán)利要求
一種電磁輻射致癌的Scid小鼠模型及構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將NIH/3T3細(xì)胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10％小牛血清、1％青霉素、1％鏈霉素和1％谷氨酰胺，當(dāng)細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞并擴(kuò)展匯合后，吸出舊培養(yǎng)液，加入0.03％Versene溶液沖洗一遍，吸出洗液，然后加入胰蛋白酶消化液37℃進(jìn)行消化，消化結(jié)束后再進(jìn)行傳代；(2)暴露實驗將NIH/3T3細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，將裝有NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)板置于橫電磁波傳輸小室中，再將該小室置于5％CO2培養(yǎng)箱中，同時，將NIH/3T3細(xì)胞暴露于功率密度為30～90W/m2的電磁輻射下，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為36.5℃，每天輻射2小時，培養(yǎng)4～6周；(3)軟瓊脂培養(yǎng)實驗配制濃度分別為1.2％和0.6％的瓊脂糖溶液，以及2×DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有20％小牛血清、2％青霉素、2％鏈霉素和2％谷氨酰胺，向一支試管中加入2×DMEM培養(yǎng)液和1.2％瓊脂糖溶液各1mL，倒入細(xì)胞培養(yǎng)板中，待凝固后制成瓊脂糖基礎(chǔ)層，再向另一支試管中加入2×DMEM培養(yǎng)液和0.6％瓊脂糖溶液各0.5mL，然后接種0.2mL NIH/3T3細(xì)胞溶液，均勻混合后加在基礎(chǔ)層上，待凝固后制成雙層瓊脂，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；(4)Scid小鼠致瘤實驗收集經(jīng)過電磁輻射的NIH/3T3細(xì)胞，對2只Scid小鼠進(jìn)行背部皮下接種，每只小鼠注射細(xì)胞懸液0.1mL，飼養(yǎng)6周后對形成的瘤塊進(jìn)行病理切片檢查。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電磁輻射致癌的Scid小鼠模型及構(gòu)建方法。該方法首先培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞并傳代，然后將細(xì)胞暴露于30～90W/m2的電磁輻射下，培養(yǎng)4～6周，再進(jìn)行軟瓊脂糖培養(yǎng)實驗，并接種于Scid小鼠進(jìn)行致瘤實驗。結(jié)果表明軟瓊脂糖實驗中有細(xì)胞集落形成，致瘤實驗中Scid小鼠均產(chǎn)生腫瘤。本發(fā)明方法建立了電磁輻射誘發(fā)腫瘤的Scid小鼠模型，效果顯著、步驟簡單、重復(fù)性好。本發(fā)明方法建立的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗?zāi)Ｐ涂捎糜谀M體內(nèi)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，為電磁輻射誘發(fā)腫瘤的發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究提供了一種良好的實驗?zāi)Ｐ秃陀辛Φ募夹g(shù)手段。本發(fā)明方法可以應(yīng)用于工業(yè)、科學(xué)、醫(yī)療以及日常生活中電磁輻射的致癌性風(fēng)險預(yù)評價，對預(yù)防電磁輻射對人體健康的遠(yuǎn)期危害具有重要價值。
文檔編號A01K67/027GK101838633SQ20101012338
公開日2010年9月22日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者崔亞松, 曾毅, 趙麗嬌, 鐘儒剛 申請人:北京工業(yè)大學(xué)