專利名稱：一種擬青霉代謝產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擬青霉代謝產(chǎn)物及其應(yīng)用，屬于微生物藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
擬青霉屬中的一些種在控制植物蟲害中起著重要作用，如淡紫擬青霉對(duì)胞囊線 蟲、根結(jié)線蟲等植物寄生線蟲的控制，玫煙色擬青霉和粉擬青霉能寄生并致死多種昆蟲，包 括同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等。在許多國(guó)家，這些擬青霉已成功開發(fā)成生防 菌劑，在構(gòu)建生態(tài)農(nóng)業(yè)中起著重要作用。 擬青毒屬(Paecilomyces Bainier)屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲 包纟岡 (Hyphomycetes)，絲孢目(Hyphomycetales)，叢梗孢科(Moniliaceae)。主要形態(tài)特征是菌 絲多核，白色、灰白色至暗白色或褐色，從毛狀，蔓延。分生孢子梗從蔓延的氣生菌絲或菌絲 索上產(chǎn)生，但不少種缺乏明確的孢子梗。有或無(wú)孢梗束形成，長(zhǎng)度變化很大。瓶?；恐鶢?或球形膨大，向上變細(xì)長(zhǎng)，常超過總長(zhǎng)的一半，多彎曲并偏離主軸；瓶梗著生情況復(fù)雜，或呈 輪狀如青霉一樣的分枝，或不規(guī)則地叢生于短小的分枝上，或單生于蔓延的氣生菌絲上。分 生孢子單胞，擬卵圓形、橢圓形、腎形、或變細(xì)長(zhǎng)的柱狀，少數(shù)種近球形。分生孢子通常聚集 成干燥離散的鏈，有時(shí)傾斜排列或形成不規(guī)則的孢子團(tuán)塊。在查氏培養(yǎng)基上，菌落通常白 色、灰白色、淡橙黃色、肉色、模糊的淡褐色、黃褐色、或真正的綠色。 松材線蟲1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)，以后相繼在江蘇、安徽、廣東和浙江等 地成災(zāi)，幾乎毀滅了在香港廣泛分布的馬尾松林。近距離傳播主要靠媒介天牛，如松墨天牛 (Monochamus alternatus)，攜帶傳播；遠(yuǎn)距離主要靠人為調(diào)運(yùn)帶疫(帶松材線蟲的天牛) 的苗木、松材、松木包裝箱及松木制品等進(jìn)行傳播。被松材線蟲感染后的松樹，針葉黃褐色 或紅褐色、萎蔫下垂，樹脂分泌停止，在樹干上可觀察到天牛侵入孔或產(chǎn)卵痕跡，病樹整株 干枯死亡，木材藍(lán)變。嚴(yán)重威脅用材林。由于擴(kuò)展迅速，現(xiàn)已對(duì)黃山、張家界等風(fēng)景名勝區(qū) 的天然針葉林構(gòu)成了巨大威脅。松材線蟲病在美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、朝鮮等國(guó) 也均有發(fā)生。因此，研制開發(fā)針對(duì)松材線蟲的生防制劑顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬青霉代謝產(chǎn)物，為開發(fā)松材線蟲生防菌劑奠定基 礎(chǔ)。 本發(fā)明使用的真菌是擬青霉1788 (Paecilomyces sp. 1788) ， 1788菌株已于2009 年11月5日保存于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，地址中國(guó).北京.中關(guān) 村；保藏號(hào)CGMCC No. 3422。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的將擬青霉(Paecilomyces sp. 1788)通過查氏培養(yǎng)基常規(guī) 液體發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液低壓濃縮后，水相經(jīng)反復(fù)柱層析，洗脫得到本發(fā)明的擬青霉代謝產(chǎn) 物，該擬青霉代謝產(chǎn)物由如下步驟得到 a.生產(chǎn)菌株為Paecilomyces sp. 1788，保藏號(hào):CGMCC No. 3422 ;
b.將1788菌株的菌絲體接種到試管PDA固體培養(yǎng)基斜面上，20-3(TC下培養(yǎng)4-8 天，獲得試管種； c.將試管種接種到每瓶裝50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，培養(yǎng)基配方為蛋 白胨10g，酵母膏l(xiāng)Og，葡萄糖20g，自來(lái)水lOOOml， pH自然；培養(yǎng)溫度20_30°C ;搖床培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)速為100-250rpm ;培養(yǎng)時(shí)間5_15天； d.將含菌絲的發(fā)酵液低壓濃縮后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相 部位低壓濃縮形成濃縮液，將其緩慢加入2倍體積的丙酮中并不斷攪拌，然后靜置，形成丙 酮水溶相和沉淀相，再分離兩相； e.重復(fù)數(shù)次直至丙酮水溶相基本無(wú)色，收集沉淀相；沉淀相重復(fù)過聚己酰胺柱， 以丙酮與水梯度洗脫，再經(jīng)過C-18硅膠柱和S印hadexLH-20凝膠柱甲醇洗脫，以TLC板為 參考合并組分，活性跟蹤檢測(cè)所分離得到活性組分，用0. 5%茚三酮乙醇溶液顯色成紅色。
實(shí)驗(yàn)表明擬青霉1788的發(fā)酵產(chǎn)物毒殺松材線蟲(Burs即helenchuh xylophilus) ，24小時(shí)的半致死率(ED5。)為299. 5卯m， ED95為796. 2ppm。
本發(fā)明的擬青霉代謝產(chǎn)物具有毒殺松材線蟲(Burs即helenchuhxylophilus)的 功能，能作為制備殺松材線蟲制劑的應(yīng)用。 本發(fā)明與現(xiàn)有的殺松材線蟲藥相比，具有高效、低毒、易溶于水、易制備等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)方法 1、將1788菌株的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng) 基，20或25或3(TC下培養(yǎng)4或6或8天，獲得試管種； 2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為 蛋白胨10g，酵母膏10g，葡萄糖20g，自來(lái)水lOOOml， pH自然。培養(yǎng)溫度20或25或30°C ; 搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-250 rpm ;培養(yǎng)時(shí)間5或10或15天。 3、將含菌絲的發(fā)酵液低壓濃縮后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相 部位低壓濃縮形成濃縮液，將其緩慢加入2倍體積的丙酮中并不斷攪拌，然后靜置，形成丙 酮水溶相和沉淀相，再分離兩相。重復(fù)數(shù)次直至丙酮水溶相基本無(wú)色，收集沉淀相。沉淀相 重復(fù)過聚己酰胺柱，以丙酮與水梯度洗脫，再經(jīng)過C-18硅膠柱和S印hadexLH-20凝膠柱甲 醇洗脫，以TLC板為參考合并組分，活性跟蹤檢測(cè)所分離到活性組分，用0. 5%茚三酮乙醇 溶液顯色成紅色。 本發(fā)明活性組分對(duì)松材線蟲的藥效試驗(yàn)
1、試驗(yàn)用藥劑 將活性組分用無(wú)菌蒸餾水稀釋為適用濃度。 將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基用無(wú)菌蒸餾水稀釋為適用濃度作為對(duì)照。
2、制備試驗(yàn)用線蟲 將灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接在PDA平板上，25。C培養(yǎng)至長(zhǎng)滿平板，接入一 塊帶有松材線蟲(B.xylophilus)的培養(yǎng)基，25t:培養(yǎng)到菌絲消失，線蟲長(zhǎng)滿平板，然后置 于4t:冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)按貝曼漏斗法洗出，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)線蟲懸液至約300條/ml。
3、試驗(yàn)方法
4
取2ml測(cè)試樣品或?qū)φ諛悠酚?cm直徑的培養(yǎng)皿中，用移液槍加入0. 3ml的線蟲 懸液(約100條)。測(cè)定活性時(shí)，在解剖鏡下于不同時(shí)間(12h和24h)進(jìn)行觀察，記錄死線 蟲數(shù)(以物理剌激不動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn))和總的線蟲數(shù)，計(jì)算樣品對(duì)線蟲的"樣品致死率"和"對(duì)照 死亡率"。 一個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)重復(fù)，最后得到這個(gè)菌株的"校正致死率"。供試菌株的校正致死 率按下列公式計(jì)算 樣品平均致死率(％ ) = E (觀察計(jì)數(shù)到的死線蟲數(shù)/觀察計(jì)數(shù)到的總線蟲 數(shù))X100% /n ; 校正致死率(％ )=樣品平均致死率(％ )-對(duì)照平均致死率(％ )
實(shí)施例1 :擬青霉1788發(fā)酵液對(duì)松材線蟲的毒殺作用 培養(yǎng)好的液體發(fā)酵物用真空抽濾后得清亮溶液，該溶液在60-7(TC減壓濃縮至干 得活性物質(zhì)，溶解于無(wú)菌蒸餾水配制成5mg/ml的樣品，按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行藥效試驗(yàn)。列 表所示為校正死亡率。 表1發(fā)酵液對(duì)B. xylophilus線蟲的毒殺作用
重復(fù)次數(shù) 4小日寸12小時(shí) 24小時(shí)
1 27. 5。/0 40.1% 94.2%
2 22.4% 38. 3% 92. 7%
3 28. 6% 47. 9% 92. 6% 結(jié)果表明，擬青霉1788的液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)松材線蟲具有顯著的毒殺作用，致死率 達(dá)到92%以上. 實(shí)施例2 :活性組分對(duì)松材線蟲的毒殺作用
將分離得到的活性組分溶于無(wú)菌蒸餾水，稀釋為500ppm溶液。
按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行藥效試驗(yàn)。列表所示為校正死亡率。
表2活性組分對(duì)B. xylophilus線蟲的毒殺作用
重復(fù)次數(shù)4小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)
115. 5%40.3%82. 1%
221. 7%42.8%81. 3%
320. 1%38.3%80. 7% 結(jié)果表明，分離得到的活性組分對(duì)B. xylophilus線蟲的致死率在24小時(shí)達(dá)到
80%以上。具有明顯的殺線蟲活性。 實(shí)施例3 :活性組分對(duì)松材線蟲的半致死率ED5。 實(shí)施例3方法同實(shí)施例2，不同之處為將2. 5mg活性組分溶于少量無(wú)菌蒸餾水， 配制為1000卯m的水溶液，隨后倍半稀釋，測(cè)定半致死率(ED5。)和95%致死率(ED95)。
表3對(duì)B. xylophilus線蟲的ED50和ED95濃度ppm4小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)
100025. 8%43. 7%100%
80025. 5%40. 3%96. 1 %
60017. 9%35. 4%86. 7%
40015. 8%30. 7%64. 0%
20010. 3%23. 3%27. 3%
1000. 7%1. 6%5. 1% 結(jié)果表明，活性組分在24小時(shí)對(duì)B. xylophilus線蟲的半致死率(ED5。)為為299. 5 卯m，95X致死率(ED95)為796. 2卯m。
權(quán)利要求
一種擬青霉代謝產(chǎn)物，其特征在于該擬青霉代謝產(chǎn)物由如下步驟得到a.生產(chǎn)菌株為Paecilomyces sp.1788，保藏號(hào)CGMCC No.3422；b.將1788菌株的菌絲體接種到試管PDA固體培養(yǎng)基斜面上，20-30℃下培養(yǎng)4-8天，獲得試管種；c.將試管種接種到每瓶裝50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，酵母膏10g，葡萄糖20g，自來(lái)水1000ml，pH自然；培養(yǎng)溫度20-30℃；搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-250 rpm；培養(yǎng)時(shí)間5-15天；d.將含菌絲的發(fā)酵液低壓濃縮后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相部位低壓濃縮形成濃縮液，將其緩慢加入2倍體積的丙酮中并不斷攪拌，然后靜置，形成丙酮水溶相和沉淀相，再分離兩相；e.重復(fù)數(shù)次直至丙酮水溶相基本無(wú)色，收集沉淀相；沉淀相重復(fù)過聚己酰胺柱，以丙酮與水梯度洗脫，再經(jīng)過C-18硅膠柱和SephadexLH-20凝膠柱甲醇洗脫，以TLC板為參考合并組分，活性跟蹤檢測(cè)所分離得到活性組分，用0.5％茚三酮乙醇溶液顯色成紅色。
2. 權(quán)利要求1所述的擬青霉代謝產(chǎn)物，其特征在于該擬青霉代謝產(chǎn)物具有毒殺松材線 蟲(Burs即he/enchuh xy/ophi/us)的功能，能作為制備殺松材線蟲制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬青霉代謝產(chǎn)物及其應(yīng)用，屬于微生物藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的生產(chǎn)菌株為Paecilomyces sp.1788，保藏號(hào)CGMCCNo.3422；將擬青霉(Paecilomyces sp.1788)通過查氏培養(yǎng)基常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液低壓濃縮后，水相經(jīng)反復(fù)柱層析，洗脫得到本發(fā)明的擬青霉代謝產(chǎn)物。本發(fā)明的擬青霉代謝產(chǎn)物具有毒殺松材線蟲(Bursaphelenchuh xylophilus)的功能，24小時(shí)的半致死率(ED50)為299.5ppm，ED95為796.2ppm。能作為制備殺松材線蟲制劑的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有的殺松材線蟲藥相比，具有高效、低毒、易溶于水、易制備等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01N63/04GK101787376SQ201010039109
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者劉亞君, 劉意, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)