專利名稱：用于治療和預防晶狀體纖維化疾病的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及晶狀體纖維化疾病領域，具體地說，本發(fā)明公開了用于抑制、治療和/ 或預防纖維化、特別是晶狀體纖維化疾病的組合物和方法。
背景技術：
為了描述本發(fā)明所屬技術領域的現有狀態(tài)，在本說明書中引述了一些公開出版物和專利文件。這些引用文獻中的每一篇都通過引用結合到本文中，如同全文公開的一樣。成肌纖維細胞很可能是導致視力減退的晶狀體纖維化疾病(例如后囊混濁(PCO) 和前囊下白內障(ASC))的病因。PCO是白內障手術的一種常見并發(fā)癥。ASC和PCO中成肌纖維細胞的起源尚不清楚。目前，還沒有可以用來有效地阻斷晶狀體纖維化疾病(例如 PC0)發(fā)展的方法。發(fā)明概述根據本發(fā)明，提供抑制纖維化疾病、特別是晶狀體纖維化疾病的方法。在一個具體的實施方案中，這些方法包括給予需要這種治療的患者的晶狀體治療有效量的組合物，該組合物包含與至少一種細胞毒性分子綴合的至少一種骨骼肌干細胞靶向分子和至少一種藥學上可接受的載體。在另一個實施方案中，該晶狀體纖維化疾病是后囊混濁或前囊下白內障。在又一個實施方案中，本發(fā)明的組合物是直接給予到晶狀體或周圍組織。根據本發(fā)明的另一方面，提供用于治療晶狀體纖維化疾病的組合物。在一個具體的實施方案中，這些組合物包含與至少一種細胞毒性分子綴合的至少一種骨骼肌干細胞靶向分子和至少一種藥學上可接受的載體。附圖簡述圖IA和圖IB提供在雞晶狀體囊袋上的模擬白內障手術以誘導后囊混濁之后，分別在第0天和第2天晶狀體中骨骼肌干細胞的影像圖。圖2A是來自在單獨的補體或補體加上G8抗體中培養(yǎng)(1天)的后囊混濁誘導的晶狀體的α-平滑肌肌動蛋白和β-肌動蛋白的蛋白質印跡圖。圖2Β是圖2Α中蛋白質印跡的信號強度比的圖。圖3是G8和MyoD mRNA標記的小鼠晶狀體細胞的影像圖。圖4提供位于晶狀體上皮里面小境(niches)中的G8pos細胞亞群的影像圖。在制備上皮外植體之前將晶狀體固定在E15，保留了原位定位G8pos細胞。外植體用抗G8抗原的mAb (用羅丹明綴合的第二抗體標記過)標記，再對F-肌動蛋白(Alexa Fluor-488鬼筆毒環(huán)肽)和核(T0-PR0 -3，藍色)共染色。在以χ-y面(x_y tile)數字地獲取的單一光學平面中共焦成像(圖4A)顯示在圖4B中，在較高的放大倍數下定位到晶狀體上皮細胞之中歸巢的小境的G8pos細胞(箭頭)，尺寸條20 μ m。圖4A中的插入圖顯示在培養(yǎng)物中在 TO時固定的外植體中，晶狀體上皮相關的G8pos細胞也表達MyoD mRNA,能用與MyoD反義寡核苷酸序列綴合的用Cy3標記的DNA樹狀聚體(dendrimer)進行檢測；細胞核用Hoechst 染料復染。為了進一步定位G8pos細胞小境，通過掃描共焦成像，創(chuàng)建了從頂部到基底獲取的連續(xù)1微米光切面Z-垛疊(Z-stack)的正交切割(頂圖，圖4B)。在代表性光切面中沿著水平線制作正交切割(底圖，圖4B)。G8pos小境與晶狀體上皮細胞的頂表面締合(箭頭， 圖 4B)。圖5顯示在對上皮損傷應答時擴大并遷移到創(chuàng)傷邊緣的G8pos前體細胞。進行模擬白內障手術以制備離體(ex vivo)受創(chuàng)傷上皮外植體，見圖5A中的模型。從晶狀體囊 (一種基底膜，BM)中去除纖維細胞團塊，在晶狀體上皮(LE)中產生了受創(chuàng)傷前沿，在此處它已毗連纖維細胞。在前囊中制造的切口使外植體變扁平，產生了受創(chuàng)傷切口邊緣。在圖 5B-5F中，通過用G8 mAb免疫標記，測定培養(yǎng)1小時時G8pos細胞對損傷的初始應答。用 Alexa Fluor 488-鬼筆毒環(huán)肽對F-肌動蛋白的染色勾畫出晶狀體上皮細胞的輪廓。通過模擬白內障手術造成的損傷誘導了 G8pos細胞群的出現和擴大(圖5B，圖5C)及其向創(chuàng)傷邊緣即前沿(圖5D-5E)和切口邊緣(圖5F)兩者的遷移。在水平線(圖5E，下圖)的位置通過共焦Z-垛疊的正交切割(圖5E，上圖)顯示沿著晶狀體上皮細胞頂表面遷移到前沿的 GSpos細胞(箭頭)。圖5G-5I顯示G8pos細胞的間充質表型通過G8和波形蛋白的雙重標記予以證明，見圖51中的疊加圖。尺寸條20 μ m。圖6提供示蹤研究，顯示對晶狀體上皮損傷應答中的G8pos細胞是創(chuàng)傷時存在的 G8pos細胞的子代。晶狀體上皮離體外植體中的G8pos細胞在TO時用G8 mAb和羅丹明綴合的第二抗體標記。將具有標記的G8細胞的外植體孵育并在損傷后追蹤G8細胞M小時(圖 6A-6F)或72小時(圖6G-6I)，此時將其固定并再次用G8 mAb標記，這次用Alexa-Fluor 488綴合的第二抗體標記。圖6A-6C和圖6G-6I是擴大后的小境，圖6D-6F是位于前沿的細胞。用帶Alexa-Fluor 488標簽的G8標記的所有細胞(圖6B，圖6E，圖6H)也用示蹤的帶羅丹明標簽的G8標記(圖6A，圖6D，圖6G)，如在疊加圖(圖6C，圖6F，圖61)中所看見的一樣。這些結果證明了參與晶狀體上皮愈合的G8pos細胞來源于在損傷時就存在的G8pos 前體細胞并且不包括后來募集至G8譜系的細胞。尺寸條20 μ m。圖7顯示G8pos細胞是成肌纖維細胞前體。培養(yǎng)6天的受創(chuàng)傷晶狀體上皮(圖 7A-7C)對G8抗原(圖7A)和α -SMA(圖7Β)進行雙重標記，見圖7C的疊加圖。在G8pos 細胞的集落內存在有從G8pos細胞到成肌纖維細胞的進程(progression)幾乎不表達到不表達α -SMA的G8pos細胞(白色箭頭)，表達α -SMA但尚未組構成應激纖維的G8pos細胞(箭頭)，含有應激纖維的帶α -SMA的G8pos細胞(空心箭頭)，和丟失了 G8抗原的成肌纖維細胞(虛箭頭)。在上述的同一進程中，讓外植體也在允許G8pos細胞遷移到堅硬培養(yǎng)皿上的條件下生長，這促進了 G8細胞在3天之內向成肌纖維細胞的分化(圖7D-7F)。 尺寸條20 μ m。圖7G、圖7H顯示G8pos細胞在培養(yǎng)第1天在上皮外植體中被清除，即通過用G8 mAb標記它們并用補體C溶解它們。圖7G提供在G8+C(與C相比)中的溶解細胞的錐蟲藍攝取標記區(qū)域(閉環(huán)區(qū)域)，這被在消除后第1天的細胞損失所證實。圖7H顯示在培養(yǎng)第1天、再培養(yǎng)5天和對α -SMA和β -肌動蛋白免疫轉印的暴露于G8+C、單獨的G8、 單獨的C或未處理(U)的上皮外植體。G8細胞的消除阻斷了 α-SMA的表達。圖8Α是在石蠟中包埋、切片和用蘇木精和伊紅染色的成年小鼠眼的影像圖。圖8Β 和圖8C中的箭頭表示在熒光顯微照片中在較高的放大倍數下顯示的區(qū)域。在圖8Β和圖8C中，用G8抗體標記的細胞用箭頭顯示。細胞核也被染色。圖9A-9D是分別針對G8抗原、α平滑肌肌動蛋白(SMA)、肌球蛋白和MyoD蛋白的存在染色的橫紋肌肉瘤細胞的影像圖。發(fā)明詳述據推測晶狀體由單一細胞類型——上皮細胞組成。因此，可以假設在晶狀體中的成肌纖維細胞是由晶狀體上皮細胞經歷上皮-間充質轉換過程發(fā)育而來。這種轉分化可以通過α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達來鑒定。本文提供一種針對晶狀體纖維化疾病的模型，該模型中，培養(yǎng)的雞胚晶狀體重演了囊混濁后晶狀體纖維化病變的主要特征，即增殖、跨后囊遷移和間充質標記的表達。這個模型用來鑒定負責引起纖維化的細胞。具體地說，骨骼肌干細胞(skm干細胞)，一種新鑒定出的在晶狀體中的表達MyoD mRNA和G8抗原的細胞群，已確認在晶狀體纖維化疾病的發(fā)展中起主要作用。正如下文所證明的，晶狀體含有獨特的表達骨骼肌譜系標記的干細胞亞群。這些 skm干細胞存在于中緯線上皮里面的小境中。損傷后，skm干細胞被激活以從上皮中出來并且表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。skm干細胞負責α-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)即一種成肌纖維細胞標記的表達。這些結果表明，skm干細胞亞群是晶狀體的纖維化疾病的病因。后囊混濁(PCO)是在白內障手術后20-40%的患者中所發(fā)生的一種疾病。白內障手術后所留下來的晶狀體上皮細胞遷移到晶狀體的透明后囊上。在PCO的發(fā)展過程中，從上皮中出現的細胞亞群負責引起視力下降的纖維化變化。正如本文所證明的，具有成肌纖維細胞樣特性的細胞起源于埋在晶狀體上皮中的骨骼肌干細胞。晶狀體中的骨骼肌干細胞可以基于其表達骨骼肌特異性轉錄因子MyoD (例如MyoD mRNA)和G8抗原進行鑒定。骨骼肌干細胞也可以表達成頭蛋白(Noggin)。根據本發(fā)明，提供抑制、預防、降低纖維化疾病/纖維化、特別是眼纖維化疾病的風險和/或治療纖維化疾病/纖維化、特別是眼纖維化疾病的方法。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法抑制器官或組織(例如心臟、皮膚、腸、肺、肝和/或腎)的纖維化。在一個具體的實施方案中，該方法包括減少和/或消除眼、特別是晶狀體中的骨骼肌干細胞。 在一個優(yōu)選的實施方案中，眼纖維化疾病是一種晶狀體纖維化疾病。眼纖維化疾病包括但不限于先天性眼纖維化綜合征、眼變應性疾病(例如眼變應性炎癥)、角膜的纖維化、小梁網的纖維化、視網膜的纖維化和晶狀體纖維化疾病。晶狀體纖維化疾病包括但不限于后囊混濁和白內障(例如前囊下白內障)。骨骼肌干細胞的切除可以通過各種方法來實現。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法利用了骨骼肌干細胞具有不同于其它細胞、特別是晶狀體上皮細胞的分子(例如在質膜上)的事實。在本發(fā)明一個具體的實施方案中，抑制、預防、降低晶狀體纖維化疾病的風險和/或治療晶狀體纖維化疾病的方法包括給予至少一種分子，該分子包含任選具有至少一種細胞毒性分子(例如與其綴合)的至少一種骨骼肌干細胞靶向部分。本發(fā)明的分子可含在至少一種藥學上可接受的載體中。在一個具體的實施方案中，靶向部分與細胞毒性分子共價連接，任選通過連接域(linking domain)。在另一個實施方案中，細胞毒性分子與對靶向部分(例如識別G8抗體的抗體)具有特定親和力的分子相連。在又一個實施方案中，靶向部分和細胞毒性分子不是共價連接的。舉例來說，本發(fā)明的方法可包括給予在一種藥物組合物或者在序貫或同時給予的單獨的藥物組合物中的G8抗體(一種skm干細胞靶向分子)和補體。特異性地靶向骨骼肌干細胞可以通過特異性地結合細胞表面分子，例如與配體和 /或抗體特異性地結合來實現，其中與晶狀體上皮細胞相比較，所述細胞表面分子對于骨骼肌干細胞來說是獨特的。對于骨骼肌干細胞，細胞表面靶包括但不限于G8抗原、多配體蛋白聚糖(syndecan)(多配體蛋白聚糖1_4)、c-Met (間充質-上皮過渡因子；肝細胞生長因子受體(HGFR))、CD34和M-鈣黏著蛋白。在一個具體的實施方案中，細胞表面靶是G8抗原。因此，本發(fā)明的靶向部分特異性地結合骨骼肌干細胞的細胞表面靶以把其它晶狀體細胞(例如晶狀體上皮細胞)全部排除在外?？赏ㄟ^使靶向部分與誘導細胞死亡的試劑(例如細胞毒性分子)偶聯(lián)來消除/減少骨骼肌干細胞。細胞毒性分子包括但不限于補體(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、牛、馬和人的補體；例如含有補體的血液/血清級分；例如補體成分/蛋白質；例如補體的激活物)、 納米顆粒和納米管(例如熱敏性碳納米晶體；參見例如Chakravarty等(2008) PNAS 105 8697-8702)和 Cho 等(2008) Cl in. Cancer Res.，14 :1310-1316)、細胞毒性(cytoxic)抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin))、陽離子兩親性裂解肽(例如KLA(氨基酸序列 KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO :2))和 PTP (前列腺特異性膜抗原-靶向肽CQKHHNYLC(SEQ ID NO :3)))、放射性核素和毒素。毒素可得自各種各樣的來源，例如植物、細菌、動物和人類，或者可以是合成毒素(藥物)，并且包括但不限于腐尸堿、蓖麻毒蛋白(例如蓖麻毒蛋白 A)、相思豆毒蛋白、溴化乙錠、白喉毒素、假單胞菌外毒素、PE40、PE38、皂草苷(saporin)、 多花白樹毒蛋白(gelonin)、RNA酶、肽核酸(PNAs)、1型或2型核糖體失活蛋白(RIP)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)、異株瀉根毒蛋白(bryodin)、苦瓜蛋白、化療劑和三角梅毒蛋白 (bouganin) 0本發(fā)明的放射性核素包括但不限于正電子發(fā)射同位素和α -發(fā)射體、β-發(fā)射體、Y-發(fā)射體、俄歇(Auger)-發(fā)射體和低能電子-發(fā)射體。在一個具體的實施方案中，放射性核素是α-發(fā)射體或俄歇-發(fā)射體。放射性同位素包括但不限于13N、18F、32P、 64Cu,66Ga,67Ga,68Ga,67Cu,77Br,80mBr,82Rb,86Y,90Y,95Ru,97Ru,99mTcU03RuU05Ru, 11 HnU13mInU13SnU21mTea22mTeU25mTeU231,1241,1251 U26IU31IU33IU65Tm, 167Tm、168Tm、177Lu、186Re、188Re、195mHg、211At、212Bi、213Bi 和 225Ac。在又一個實施方案中，含有放射性核素的分子可以與放射性增敏劑一起給予。本發(fā)明包括組合物，該組合物包含1)任選具有至少一種細胞毒素(例如與其綴合)的至少一種靶向部分，和幻至少一種藥學上可接受的載體。這樣的組合物可以按治療有效量給予到有需要的患者用于治療纖維化疾病、特別是晶狀體纖維化疾病?？梢园驯景l(fā)明的組合物裝在試劑盒內。本發(fā)明的組合物可以通過任何合適的途徑，例如可以通過注射(例如對于局部 (直接，包括眼內透鏡)或系統(tǒng)給藥)、口服、經肺、局部、經鼻或其它給藥方式給予。該組合物可以通過任何合適的方式給予，包括胃腸外、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、局部、 吸入、經皮、眼內、肺內、動脈內(intraareterial)、直腸內、肌內和鼻內給藥。在一個優(yōu)選的實施方案中，將該組合物直接給予到眼、特別是晶狀體。一般而言，該組合物中的藥學上可接受的載體選自稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。該組合物可以包括各種緩沖劑內容(例如his HC1、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；和添加劑例如去污劑和增溶劑(例如吐溫80(Tween 80)、聚山梨酯80(POlySOrbate 80))、抗氧劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)和增量(bulking)物質(例如乳糖、 甘露醇)。該組合物也可以摻入到高分子化合物例如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚丙交酯/聚乙交酯共聚物、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒制劑中，或者摻入到脂質體中。這樣的組合物可以影響本發(fā)明藥物組合物各組分的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內釋放速率和體內清除速率。參見例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 18 版，(1990， Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)，第1435-1712頁，所述文獻通過引用結合到本文中。本發(fā)明的藥物組合物可以制成例如液體形式，或者可以制成干粉形式(例如凍干的粉末，供后來的重配用)。 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的組合物包含滴眼劑、可注射溶液或眼膏。可利用很細的針把可注射溶液直接注射到晶狀體或鄰近組織中。也可以通過接觸透鏡或更優(yōu)選眼內透鏡(例如白內障手術中使用的眼內透鏡)將這種組合物給予到眼。所述透鏡可以用該組合物涂覆和/或包埋，或者可以將其浸泡在該組合物中。 在又一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以在白內障手術時、白內障手術后或白內障手術前給予以防止纖維化(例如引起PCO的纖維化)。在再另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以在去除纖維細胞團塊后直接注射到晶狀體囊的囊袋內。由于晶狀體是無血管的，因此預期本發(fā)明的分子(例如偶聯(lián)抗體)不會進入體循環(huán)。本文描述的操作用來特異性地靶向和消除/減少晶狀體上皮中的骨骼肌干細胞。 然而，本發(fā)明的方法可用來清除其它組織中的骨骼肌干細胞以治療、抑制和/或預防與異常行為和/或骨骼肌干細胞數量和/或異常纖維化相關的其它疾病和病變。這樣的疾病和病變包括例如瘢痕組織形成(例如皮膚、心臟或肝臟的瘢痕組織形成)。^X提供下面的定義便于對本發(fā)明的理解術語“纖維化”是指胞外基質蛋白的任何過度產生或沉積。纖維化包括纖維性組織的任何異常加工或纖維樣變性或纖維變性。纖維化可以由各種損傷或疾病所引起。術語 “眼纖維化”是指影響眼或其某一部位的纖維化。“抗體”或“抗體分子”是與特定抗原結合的任何免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術語包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單域抗體(Dab)和雙特異性抗體。 本文所用的抗體或抗體分子涵蓋了重組產生的完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、F (ν)、scFv、scFv2、scFv-Fc、小抗體(minibody)、雙抗體(diabody)、四抗體(tetrabody)、單可變域(例如重鏈可變區(qū) (variable heavy domain)、輕鏈可變區(qū)(variable light domain))和雙特異性的。單域抗體(Dabs)可以由單一輕鏈或重鏈可變區(qū)組成。本發(fā)明還包括Affibody 分子(Affibody， Bromma，Sweden)和肽抗體(ρ印tabody) (Terskikh 等(1997) PNAS 94 :1663-1668)。在本發(fā)明的某個實施方案中，將對骨骼肌干細胞上的靶分子有特異性的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)插入到上述抗體構建體(construct)的骨架(baclcbone)中。用于重組法制備抗體的方法是本領域眾所周知的?！癋v”是含有抗原識別和結合位點的抗體片段。這個區(qū)域由一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)以緊密、非共價締合的二聚體組成。正是在這種構型中，每個可變區(qū)的三個CDR相互作用以限定VH-VL 二聚體表面上的抗原結合位點?？傮w來說，這六個CDR賦予了抗體的抗原結合特異性。然而，甚至單可變區(qū)(或僅包含對抗原有特異性的三個CDR的Fv —半)也具有識別并結合抗原的能力，盡管其親和性常常低于整個結合位
點ο“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH區(qū)和VL區(qū)，其中這些結構域存在于一條多肽鏈中。一般而言，Fv多肽在VH區(qū)和VL區(qū)之間還包含多肽接頭(linker)，使得scFv能夠形成抗原結合所需要的結構。術語“雙抗體(diabody)”是指具有兩個抗原結合位點的抗體小片段，這些片段包含連在同一多肽鏈上的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū) (VH) (VH-VL)。通過利用短到不能在同一鏈的兩個結構域之間配對的接頭，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對并產生兩個抗原結合位點。雙抗體更全面地描述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和 Holliger 等，(1993)Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 :6444-6448。 在又一個實施方案中，抗體是人源化的。就抗體而論，術語“免疫特異性的”是指在含有抗原生物分子的混合群體的樣品中，能與目標蛋白質或化合物的一個或多個表位結合但基本上不識別和結合其它分子的抗體。術語“特異性地結合”是指在含有生物分子的混合群體的樣品中，目標多肽或化合物與靶多肽或化合物的結合，同時基本上不識別和結合其它分子。舉例來說，“特異性結合對”包含彼此具有特殊特異性的并且在正常條件下彼此結合優(yōu)于與其它分子結合的特異性結合成員和結合配偶體(binding partner)。術語“綴合的”是指通過本發(fā)明的兩個分子或化合物的共價或非共價方式相連接。 這些分子可以通過接頭域相連接。術語“接頭域(linker domain) ”是指包含靶向部分與細胞毒素共價連接的共價鍵或原子鏈的化學部分。在一個具體的實施方案中，接頭可含有O (即化學鍵) 約500個原子、約1 約100個原子或約1 約50個原子。示例性接頭可包含至少一個任選取代的、 飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或芳基。接頭也可以是多肽(例如約1 約 20個氨基酸)。本文所用的術語“放射性增敏劑”定義為按治療有效量給予動物以增加細胞對輻射的敏感性的分子。放射性增敏劑能增加細胞對輻射毒性效應的敏感性是已知的。放射性增敏劑包括但不限于2-硝基咪唑化合物和苯并三嗪二氧化物化合物、鹵代嘧啶、甲硝唑、米索硝唑、去甲米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、絲裂霉素C、RSU 1069,SR 4233、 E09、RB 6145、煙酰胺、5-溴脫氧尿苷(BUdR)、5-碘脫氧尿苷(IUdR)、溴脫氧胞苷、氟脫氧尿苷(FudR)、羥基脲、順鉬及其治療有效的類似物和衍生物。“藥學上可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府管理局批準的或在美國藥典或其它公認的藥典中列舉的用于動物、更特別是人類的?！拜d體”是指例如稀釋劑、佐劑、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)、抗氧劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、增溶劑(例如吐溫80、聚山梨酯80)、乳化劑、緩沖劑(例如Tris HC1、醋酸鹽、磷酸鹽)、抗微生物劑、增量物質(例如乳糖、甘露醇)、賦形劑、助劑或溶媒，其與本發(fā)明的活性劑一起給予。藥學上可接受的載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些。水或鹽水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別是對于可注射溶液。合適的藥用載體描述于“Remington' s PharmaceuticalSciences，，，Ε. W. Martin (Mack Publishing Co.，Easton，PA) ；Gennaro, A. R.，Remington The Science and Practice of Pharmacy，第 20 片反，(Lippincott，Williams 禾口 Wilkins)， 2000 ；Liberman 等(編著)，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York， N. Y.，1980 ；及 Kibbe 等(編著)，Handbook of Pharmaceutical Excipients (第 3 版)， American Pharmaceutical Association，Washington，1999。下面的實施例提供了實施本發(fā)明的說明性方法，但并不意味以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1在模擬白內障手術之后，按先前所述方法用針把雞晶狀體囊袋固定在培養(yǎng)皿上 (Walker 等(2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,48 :2214-23)。通過 G8 抗原的免疫熒光定位(


圖1)、MyoD mRNA的原位雜交(圖幻及共焦和落射熒光顯微鏡術對骨骼肌干細胞 (skm干細胞)進行了鑒定。G8抗體識別雞胚和胎(Gerhart等(2001) J. Cell Biol. , 155 381-391 ；Gerhart 等(2004)J. Cell Biol. ,164 :739-746 ；Strony 等(2005)Gene Expr. Patterns, 5 :387-395)和成體小鼠組織(圖3)中表達MyoD mRNA的細胞中特異性表達的表面抗原。使用與Cy3綴合的DNA樹狀聚體(dendrimer)(參見例如Gerhart等(2004) Biol. Proced. Online,6 :149-156)和下列反義寡核苷酸序列雞MyoD，5' -TTCTCAAGAGCAA ATACTCACCATTTGGTGATTCCGTGTAGTA-3' (L34006 ；Dechesne等(1994)Mol. Cell. Biol.，14 5474-5486)來檢測 MyoD 的信使 RNA。熒光樹狀聚體得自 GenisphereJnc. (Hatf ield, PA)。 用樹狀聚體和抗體按先前所述方法進行雙重標記(Gerhart等Q001) J. Cell Biol.，155 381-391 ；Gerhart 等(2004)J. Cell Biol. ,164 :739-746 ；Strony 等(2005)Gene Expr. Patterns, 5 :387-395 ；Gerhart 等(2004) Biol. Proced. Online, 6 :149-156)。在第1天切除skm干細胞，通過裂解用G8抗體標記的細胞(參見例如Gerhart 等(2001)J. Cell Biol. ,155 :381-391 ；Gerhart ^ (2004)J. Cell Biol.，164 :739-746 ； Strony 等(2005)Gene Exp. Patterns, 5 :387-395 ；Gerhart ^ (2007)J. Cell Biol. ,178 649-660 ；Gerhart ^ (2006)J. Cell Biol. ,175 :283-292 ；Gerhart ^ (2008)Biol. Proc. Online, 10 :74-82)并通過在補體中孵育獲得PCO培養(yǎng)物(圖幻。更準確地講，將晶狀體與按1 20在Hanks氏緩沖鹽水(含有0. 1 %牛血清白蛋白(BSA))中稀釋的G8抗體一起于37°C孵育1小時，洗滌后在按1 40在Hanks氏緩沖鹽水(含有0. 1 % BSA)中稀釋的幼兔補體(Cedarlane Laboratories,Burlington,NC)中在室溫下孵育30分鐘。用蛋白質印跡分析法測定α -SMA的表達(圖2)。在晶狀體上皮細胞中歸巢的晶狀體的中緯線區(qū)帶(EQ)中定位的小境里面檢測到 G8/MyoD mRNA陽性skm干細胞亞群。這一發(fā)現首次證明了在晶狀體上皮中存在具有干細胞特性并且其表型不同于晶狀體上皮細胞的細胞群。在用模擬白內障手術誘導的損傷后， skm細胞從其小境中快速出現并具有間充質形態(tài)。這些skm干細胞在骰狀晶狀體上皮細胞單層的頂部之上慢慢移動并遷移到共同遷移上皮細胞片層的前沿。skm干細胞的切除抑制了后囊混濁培養(yǎng)物中α-SMA表達的表達。也通過G8抗原的免疫熒光定位、MyoD mRNA的原位雜交和落射熒光顯微鏡術對骨骼肌干細胞進行了鑒定(圖3)。因此，顯然在晶狀體中存在骨骼肌干細胞并不局限雞，因為 skm干細胞也存在于其它動物(包括哺乳動物)。
實施例2間充質細胞在上皮創(chuàng)傷愈合、纖維化和癌癥中起重要的作用(Radisky等Q007) J.Cell Biochem. , 101 830-9 ；Eyden, B. (2008) J. Cell Mol. Med. , 12 :22-37 ；Polyak 等 (2009)Nat. Rev. Cancer 9 J65-73)。在上皮片層內具有間充質表型的細胞的出現被認為是主要由內源上皮細胞的轉化(通常稱為上皮-間充質轉換(EMT))所引起(Baum等Q008) Semin. Cell Dev. Biol.，19 :294-308 ；Lee等(2006) J. Cell Biol.，172 :973-81)。在本研究中，研究了上皮含有在上皮創(chuàng)傷愈合中起作用并可接收信號以分化成為成肌纖維細胞的間充質前體細胞亞群的可能性。這些研究的模型是一種離體培養(yǎng)系統(tǒng)，最初開發(fā)出來是為了研究稱為后囊混濁(PCO)的晶狀體纖維化疾病(Walker等Q007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,48 :2214-23)。采用這種培養(yǎng)物模型有可能跟蹤完整上皮對天然微環(huán)境內的臨床相關創(chuàng)傷的應答。上皮的創(chuàng)傷是在胚胎第15天雞晶狀體中模擬白內障手術的結果。這種顯微外科操作包括去除來自晶狀體囊內的晶狀體纖維細胞團塊即一種圍繞整個晶狀體的厚基底膜，這使得晶狀體囊后面剝除了細胞(見圖5A中的示意圖)。晶狀體上皮保持完整并粘連在具有主創(chuàng)傷邊緣的囊上，主創(chuàng)傷邊緣為曾連有纖維細胞的區(qū)域的邊界(前沿，圖5A)。 通過在其前區(qū)切幾個切口，產生了另外的創(chuàng)傷邊緣(切口邊緣，圖5A)，再使組織變扁平，用針固定在培養(yǎng)皿上使細胞一側朝上并培養(yǎng)成為離體外植體(見圖5A中的模型)。采用高分辨率共焦顯微術，該方法使得有可能跟蹤受創(chuàng)傷上皮對損傷的應答。這種創(chuàng)傷模型中的上皮細胞快速開始共同遷移橫過裸露的基底膜囊進入受創(chuàng)傷區(qū)，在培養(yǎng)物中幾天之內傷口就被上皮細胞填滿了(Walker 等(2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,48 :2214-23) 只有在創(chuàng)傷愈合過程完成之后才表達與生化檢測的成肌纖維細胞出現相關的分子標記(Walker 等(2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,48 :2214-23)，證明了在這個離體模型中，纖維化疾病的發(fā)展主要是遷移后和創(chuàng)傷后閉合事件。在本研究中檢驗的假設是1)在成熟晶狀體的上皮細胞中存在間充質前體亞群， 2)這些細胞可以在損傷后被激活以調節(jié)創(chuàng)傷愈合過程，和幻這些細胞的子代具有變成成肌纖維細胞(一種與纖維化疾病發(fā)展相關的表型)的潛力。在晶狀體損傷模型中作為間充質前體細胞候選者研究的細胞類型根據其細胞表面抗原G8的表達進行了鑒定。用G8單克隆抗體(mAb)標記的細胞是上胚層的一個亞群，上胚層是產生胚胎所有三個胚層的組織 (Bellairs，R. (1986) Anat Embryol (Berl) 174 1-14)。這些 G8P°S 細胞也表達生肌轉錄因子 myoD 的 mRNA(George-Weinstein 等(1996)Dev. Biol.，173 :279-91 ；Gerhart 等 Q000) J. Cell. Biol.，149 :825-34)。在發(fā)育過程中，大多數G8p°s/My0Dp°s上胚層細胞都被整合到體節(jié)中，在此其功能是調節(jié)肌肉分化(Gerhart等(2006) J. Cell. Biol. , 175 :283-92)； 然而，G8p°s/MyoDp°s上胚層細胞當在培養(yǎng)皿中分離和生長時本身就有生肌潛力(Gerhart 等(2001)J. Cell. Biol. , 155 :381-92 ；Strony ^ (2005)Gene Expr. Patterns, 5 :387-95 ； Gerhart等(2004) J. Cell. Biol.，164 :739-46)。有趣的是，在非肌肉組織的細胞中還檢測到表達 G8 抗原和 MyoD 兩者的細胞亞群(Gerhart 等(2001) J. Cell. Biol.，155 :381-92 ； Asakura 等(1995)Dev. Biol.，171:386-98 ;Chen 等(2005)Genesis 41 :116-21 ；Grounds 等(1992) Exp. Cell. Res.，198 :357-61)，所述非肌肉組織包括胚胎晶狀體(E5，Gerhart等 (2009)Developmental Biology 336 :30-41)，但是這些細胞亞群在這些組織中的功能是未知的。
材料與方法離體上皮外植體制備為了制備離體上皮外植體，從胚胎第15天(E15)雞胚(Truslow Farms, Chestertown, MD)中通過解剖眼摘出晶狀體(Walker 等 Q007nnvest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,48 :2214-23)。然后，在前晶狀體囊即圍繞晶狀體的厚基底膜內切一個切口，通過該切口水洗脫去除晶狀體纖維細胞團塊。這個過程(其中晶狀體上皮仍然緊緊粘連在囊上)模擬了白內障手術。上皮的主創(chuàng)傷邊緣(前沿)接在曾連有纖維細胞的區(qū)域的邊界(模型， 圖5A)。在該組織的前區(qū)進行切割，產生了另外的創(chuàng)傷邊緣，使外植體變扁平并用針固定在培養(yǎng)皿上使細胞一側朝上(圖5A)。通過顯微鏡成像跟蹤晶狀體上皮對其天然微環(huán)境內創(chuàng)傷的應答。將離體上皮外植體在含有青霉素-鏈霉素(Mediatech-Cellgro，Manassas， VA) U% L-谷氨酰胺(Mediatech-Cellgro，Manassas, VA)及按照說明加或不加10%胎牛血清(Invitrogen)的培養(yǎng)基199anvitrogen)中進行培養(yǎng)。在設計為保持G8P°S細胞的位置如其在體內(in vivo)存在時一樣的實驗中，在制備上皮外植體之前，將晶狀體在3. 7% 甲醛中固定10分鐘。免疫熒光和原位雜交對于免疫熒光研究，上皮外植體按先前所述方法進行免疫染色(Walker等Q007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，48 :2214-23)。簡而言之，在免疫染色之前，將外植體在含 3. 7%甲醛的PBS中固定后在含0. 25% Triton X-100的PBS中透化處理。將細胞與原代抗血清一起孵育后再與羅丹明-(Jackson Laboratories, West Chester, PA and Millipore Corp. ,Bedford,MA)、焚光素-(Jackson Laboratories, West Chester, PA)或 Alexa Fluor 488-(Invitrogen-Molecular Probes ；Eugene,OR)綴合的第二抗體一起孵育。對于免疫焚光研究使用了下列第一抗體:G8 mAb (Gerhart 等(2001) J. Cell. Biol.，155 :381-92)波形蛋白(多克隆)抗體(由Paul FitzGerald慷概贈送的禮物)(University of California, Davis, CA)和熒光素(FITC)-綴合的 α-SMA mAb (Sigma, St. Louis, M0)。有些外植體用結合絲狀肌動蛋白的Alexa Fluor 488-綴合的鬼筆毒環(huán)肽和T0-PR0 3 ( 一種核染料) (Invitrogen-Molecular Probes ；Eugene,OR)進行了復染。所有經免疫染色的樣品都用共焦顯微鏡(LSM 510 ；Carl Zeiss, Oberkochen，德國)進行了檢查，只是還要進行原位雜交的樣品除外。將單圖像或Z-垛疊(stack)收集起來并進行分析；得出的數據表示從頂部到基底方向成像的單光學平面或正交切面。對于原位雜交研究，MyoD的多種mRNA用與Cy3綴合的DNA樹狀聚體和下列反義寡核苷酸序列進行了檢測雞 MyoD，5 ‘ -TTCTCAAGAGCAAATACTCACCATTTGGTGATTCCGTGTAGT A-3' (SEQ ID NO 1) (Genisphere,Inc.，Hatfield，PA)(Gerhart等(2006)J. Cell. Biol.， 175 :283-92 ；Gerhart 等 Q004)Biol. Proced. Online，6 :149-156)。對外植體的 G8 抗原和 MyoD mRNA進行雙重標記，按先前所述方法(Gerhart 等(2001) J. Cell. Biol.，155 :381-92) 用Hoechst進行復染，并用落射熒光顯微鏡(Eclipse E800, Nikon)進行檢查。圖像用攝像機(Evolution QE ；Media Cybernetics)和 Image-Pro Plus 軟件(Phase 3 Imaging Systems)捕獲。細胞示蹤G8細胞按先前所述方法標記用于示蹤(Gerhart等(2006) J. Cell. Biol. , 175 觀3-92)。簡而言之，將晶狀體離體上皮外植體在TO時在含有G8 mAb(l 40)的培養(yǎng)基199 中在室溫下孵育45分鐘，在培養(yǎng)基199中漂洗，然后在羅丹明綴合的IgM抗體(Millipore Corp. ,Bedford,ΜΑ)中在室溫下孵育30分鐘。標記的外植體在培養(yǎng)基199中漂洗，置于無血清培養(yǎng)基(SFM 含有青霉素鏈霉素和L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基199)中，于37°C孵育。在培養(yǎng)物中M小時或72小時后，將上皮外植體在3. 7%甲醛中固定。為了確定損傷后M或 72小時對上皮創(chuàng)傷愈合應答的G8pos細胞是否的確是在TO時存在的G8pos細胞的子代，將固定后的外植體此時再次用G8 mAb(l 40)標記，然后用與Alexa Fluor 488綴合的IgM 第二抗體Qnvitrogen-Molecular Probes,Eugene,OR)標記。先前的命運作圖研究(其中追蹤G8pos細胞從上胚層到胚胎組織)證明，標記上胚層中的G8pos細胞的G8 mAb在整個研究當中保持與這些細胞締合并且不向周圍細胞轉移(Gerhart等Q006) J. Cell. Biol.， 175 :283-92)。上皮細胞外植體中的G8P°S細胞切除上皮外植體中的G8pos細胞切除按照先前對雞胚上胚層內G8pos細胞的切除法所描述的程序進行(Gerhart等(2006) J. Cell. Biol.，175 :283-92)。對于這些研究，在SFM中制備了離體晶狀體上皮外植體。在第1天培養(yǎng)時，將上皮外植體與在Hanks氏緩沖鹽水中稀釋的G8抗原(1 20) 一起于37°C孵育1小時，然后在含有0. 1 % BSA的Hanks氏緩沖鹽水中稀釋的幼兔補體(1 40 ；Cedar Lane, Inc, Burlington, Ontario, Canada)中在室溫下孵育30分鐘。幼兔補體按照制造商的方案(Cedar Lane, Inc, Burlington, Ontario, Canada)來制備。對照外植體保持不處理或者單獨與G8 mAb或補體一起孵育。處理后，漂洗外植體，再與SFM —起孵育。處理后立即測定溶解的G8細胞的存在，即將離體上皮外植體在含0. 2%錐蟲藍的PBS中于37°C孵育15分鐘，再用解剖顯微鏡(SMZ800 ；Nikon, Tokyo, Japan)和 Nikon Digital Sight DS-Fil 相機顯現，圖像用 Nikon NIS-Elements 成像軟件捕獲。蛋白質印跡分析在第6天，上皮外植體在含有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St. Louis, MO)的OGT 緩沖液 4mM 正辛基 β-D-吡喃葡糖苷，1 % Triton X-100, IOOmM NaCl, ImM MgCl2, 5mM EDTA，IOmM咪唑)中提取和裂解。用BCA試驗(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白質濃度。蛋白質在Tris-甘氨酸凝膠(Novex，San Diego, CA)上進行分離，用電泳法轉移到膜 (Immobilon-Ρ ；Mi llipore Corp. ,Bedford, ΜΑ)上并進行免疫印跡。為了檢測，使用了 ECL 試劑(Amersham Life Sciences,Arlington Heights，IL)。所有凝膠都在還原條件下跑電泳。蛋白質印跡法所用的抗體包括β-肌動蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(Sigma，St Louis, MO)。MM已鑒定出成熟晶狀體(E15)中存在G8pos細胞并測定了 G8pos細胞的定位、原位， 集中在G8pos細胞與晶狀體上皮的締合關系。為了保持G8pos細胞的位置如其在體內存在時一樣，在制備晶狀體上皮外植體之前將晶狀體進行固定。外植體中的G8pos細胞依次用抗G8抗原的mAb和羅丹明綴合的第二抗體進行了標記。培養(yǎng)物用熒光素綴合的鬼筆毒環(huán)肽進行共染色以標出絲狀肌動蛋白(F-肌動蛋白)并揭示外植體中細胞的細胞構造。標記的外植體用高分辨率共焦顯微術進行了檢查(圖4)。發(fā)現G8pos細胞定位在晶狀體上皮細胞中歸巢的小境內(圖4A)。G8P°S細胞的典型小境(圖4B中較高的放大倍數下顯示，下圖)平均含有7個細胞(7. 57+/"· 66 ；平均值+/-SEM)。在上皮外植體中檢測到多達14個這樣的小境。在晶狀體上皮內G8P°S細胞小境的定位對應于完整晶狀體的中緯線區(qū)。以前的研究表明，G8P0S細胞常常共表達生肌轉錄因子MyoD的mRNA。用G8 mAb和用DNA樹狀聚體雙重標記上皮外植體檢查到E15晶狀體上皮內MyoD mRNA由G8P°S細胞表達，其中G8 mAb用熒光素標記，DNA樹狀聚體與MyoD mRNA的反義寡核苷酸序列和熒光染料Cy3兩者綴合(Gerhart 等(2000) J. Cell. Biol.，149 :825-34 ；Gerhart 等(2004)Biol. Proced. Online 6:149-156)。熒光成像顯示，晶狀體上皮中存在的G8pos細胞也表達MyoD mRNA(插圖，圖 4A)。創(chuàng)建了通過激光掃描共焦顯微術采集的Z-垛疊的正交切面以研究晶狀體上皮內 GSpos細胞小境的微環(huán)境。在小境的區(qū)域中按頂部到基底方向以一個微米厚的光切面獲取 Z-垛疊。正交切面的分析揭示出G8P°S細胞的小境沿晶狀體上皮細胞頂表面定位，其中與晶狀體基底膜締合的G8P°S細胞證據很少(圖4B，參見箭頭，頂圖)。G8P°S細胞小境的獨特位置把這些細胞定位，使得它們能夠作為快速應答者對上皮的損傷發(fā)揮作用。本研究的一個重要方面是檢查G8P°S前體細胞對晶狀體上皮損傷的應答。對于這些研究，晶狀體上皮通過模擬白內障手術造成創(chuàng)傷并置于培養(yǎng)物中培養(yǎng)成離體外植體(圖 5A)。在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時后測定了 G8P°S前體細胞對上皮損傷的應答。此時，將培養(yǎng)物固定，用抗G8抗原的抗體免疫染色，對F-肌動蛋白共染色，用共焦顯微術檢查(圖 5B-F)。圖像分析揭示出在損傷后的這一短時間內，G8P°S前體細胞就已經從其小境中出來并且其群體大小已擴大(圖5B，C)。另外，G8P°S細胞已快速地遷移到傷口邊緣(圖5D-F)，既是鄰接已去除了纖維細胞的前沿(圖5D，E)也是已使上皮變扁平的切口邊緣(圖5F)。通過用共焦成像采集的Z-垛疊的正交切面揭示出G8P°S細胞通過沿上皮頂表面遷移游到傷口邊緣(圖5E，箭頭，頂圖)。遷移中的G8P°S細胞表現出間充質形態(tài)，一種由其表達間充質標記波形蛋白證實的表型(圖5G-I)。這些結果證明了晶狀體上皮內的G8P°S間充質前體細胞亞群通過從其小境中出來、擴大并遷移到傷口邊緣而對上皮的損傷作出快速反應。在需時三天左右的整個創(chuàng)傷愈合過程中，發(fā)現G8P°S細胞沿著晶狀體上皮頂表面以及在傷口邊緣處成簇。為了研究對上皮創(chuàng)傷應答的G8P°S細胞是否的確是在時間O (T0，緊接在顯微手術之后)時存在的G8P°S細胞的子代，將G8P°S細胞在TO時用G8抗體和羅丹明綴合的第二抗體標記并在創(chuàng)傷閉合時期中進行跟蹤。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)M小時(圖6A-F)和72 小時(圖6G-I)時，將外植體固定，在這些時間中存在的G8P°S細胞用G8 mAb免疫染色，其中G8 mAb用Alexa Fluor 488綴合的第二抗體標記過。共焦分析顯示，在活動性創(chuàng)傷愈合 04小時)期間，所有G8p°7AleXa Fluor 488標記的細胞也都用G8-羅丹明標簽標記，不論 GSpos細胞是沿著上皮成簇定位(圖6A-C)還是已遷移到創(chuàng)傷前沿(圖6D-F)。甚至當創(chuàng)傷愈合完成時(72小時)，所有G8p°7AleXa Fluor 488標記的細胞都用G8-羅丹明標簽共標記(圖6G-I)。這些結果證明參與晶狀體上皮創(chuàng)傷愈合應答的G8P°S細胞來源于在TO時就存在的G8pos細胞群。受創(chuàng)傷晶狀體上皮的愈合(創(chuàng)傷閉合)過程在用生化方法檢測到與纖維化相關的分子(例如α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白)之前就出現了(Walker等Q007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，48 :2214-23)。然而，在完成創(chuàng)傷愈合后的幾天以內，這些分子的表達均被誘導。此時，具有新出現的成肌纖維細胞典型間充質形態(tài)的α-SMA陽性細胞出現在晶狀體上皮細胞中(Walker 等(2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，48 :2214-23)。 現在，利用高分辨率共焦成像研究了在對晶狀體上皮損傷應答中被激活的G8P°S細胞是否是離體損傷模型中稍后時間出現的成肌纖維細胞的前體。成肌纖維細胞定義為已把α-SMA 組構成應激纖維的間充質細胞(Tomasek 等(2002)Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.，3 :349-63 ； Hinz等(2007) Am. J. Pathol. , 170 1807-16)，一種給這些細胞提供收縮功能的特征，該功能將它們與PCO等纖維化疾病相聯(lián)系。為了檢查G8P°S細胞是否是培養(yǎng)物模型中出現的成肌纖維細胞的前體，對在無血清條件下培養(yǎng)的離體外植體進行了圖像分析，培養(yǎng)第6天固定， 用G8 mAb和羅丹明綴合的第二抗體免疫標記，再用與熒光素直接綴合的α SMA抗體共標記 (圖7A-C)。共焦顯微術成像揭示出含有α-SMA陽性應激纖維的G8P°S細胞的存在，證明了 GSpos細胞的確是該創(chuàng)傷模型中成肌纖維細胞的來源。另外，發(fā)現了與上皮締合的G8P°S細胞小簇內有G8P°S前體細胞到成肌纖維細胞的進程。過渡細胞類型包括幾乎不表達到不表達α SMA的G8P°S細胞(白色箭頭)，表達α SMA但α SMA尚未組構成應激纖維的G8P°S細胞 (箭頭)，和含有α SMA陽性應激纖維的G8P°S細胞(空心箭頭)，表達G8的成肌纖維細胞。 本研究還證明G8細胞向成肌纖維細胞分化中的最后一步是前體細胞抗原G8的丟失(虛箭頭)。分化時前體細胞標記的丟失是這些細胞與許多前體細胞群的分化子代共享的一個特征(Cattaneo 等(1990)Nature 347 :762-5 ；Bai 等(2009)Neuroi^port. ,20 :918-22)。接下來檢查了是否有可能促使G8P°S細胞分化成成肌纖維細胞。對于這些研究， 利用了成肌纖維細胞發(fā)育已知在堅硬(rigid)環(huán)境下被增強的事實(Hinz，B. (2007) J. Invest. Dermatol. , 127 :526-37)，并讓離體培養(yǎng)物在含血清培養(yǎng)基中生長，使得切口邊緣處的G8P°S細胞從晶狀體囊遷移到堅硬培養(yǎng)皿上。在培養(yǎng)第3天，即在α-SMA陽性成肌纖維細胞已出現在其晶狀體上皮的天然微環(huán)境內之前的時間點，對這種G8P°S細胞群體檢查了 α SMA在G8P°S細胞中的表達。結果證明當G8P°S細胞接觸到堅硬基底時促進從G8P°S前體細胞向α-SMA陽性成肌纖維細胞的轉換(圖7D-F)。從G8P°S細胞向成肌纖維細胞的轉換過程與上述關于晶狀體囊上成肌纖維細胞的出現情況相同。這些數據證明G8P°S細胞能產生成肌纖維細胞。最后，檢查了當G8P°S細胞在培養(yǎng)物中在第一天被消除時，α -SMA表達是否在離體培養(yǎng)物中被抑制，即通過用G8抗體標記它們并用補體溶解它們。處理的培養(yǎng)物中的細胞溶解用錐蟲藍攝取法予以證實，因為這種染料被活細胞排斥。用細胞小集落檢測了錐蟲藍染色(圖7G，G8+C，切除，參見前沿處的環(huán)繞的大集落)。錐蟲藍標記的集落分布類似于培養(yǎng)第1天典型存在的G8P°S細胞的擴大集落分布。切除后M小時，通過來自錐蟲藍染色區(qū)域的細胞的后續(xù)損失證實了溶解(圖7G，G8+C，切除后1天)。類似的細胞損失在單獨用補體孵育的對照培養(yǎng)物中未觀測到(圖7G，C)。G8細胞切除后，將離體外植體(切除的和對照) 培養(yǎng)6天，即未處理的對照培養(yǎng)物通常表達α SMA的時間點，如此處通過免疫印跡分析所顯示(圖7Η，U)。α SMA的表達當在培養(yǎng)第1天切除G8P°S細胞時被抑制(圖7H，G8+C)，而在單獨暴露于G8抗體(G8)或補體(C)的培養(yǎng)物時幾乎對α SMA表達沒有影響。這些結果證實G8P°S細胞是成肌纖維細胞的前體。在本研究中，報告了在晶狀體上皮細胞中定位的小境中存在間充質前體細胞獨特亞群的發(fā)現。這種細胞類型對上皮的損傷作出快速反應并具有分化成成肌纖維細胞的潛力。這些細胞的獨特特征包括細胞表面抗原G8和MyoD mRNA的表達，這是它們與先前鑒定的上胚層亞群共享的特征，所述上胚層亞群變成摻入至各種胚胎組織(Gerhart等Q001) J. Cell. Biol. ,155 :381-92)，包括缺乏生肌潛力的那些，例如晶狀體。在晶狀體上皮創(chuàng)傷之后，G8P°S亞群從其小境中出來，群體大小擴大，表現出間充質表型并遷移到傷口邊緣。傷口邊緣處間充質細胞的存在是許多上皮創(chuàng)傷愈合模型的特征，但是它們的出現通常歸因于 EMT。對受創(chuàng)傷晶狀體上皮的本發(fā)明研究提示，G8p°7MyoDp°s前體細胞是對損傷應答并定位到傷口邊緣的間充質細胞的祖細胞的備選范例(alternate paradigm)。這種相同的前體群可以分化成成肌纖維細胞，其在創(chuàng)傷后的出現與纖維化疾病的發(fā)展相關。這一發(fā)現對晶狀體纖維化疾病PCO發(fā)展具有特別的重要性，PCO是在白內障手術期間晶狀體上皮創(chuàng)傷的后果。然而，在其它組織中表達G8抗原和/或MyoD的細胞小亞群的存在傾向于例如肺、肝和腎等的纖維化(Gerhart 等(2001) J. Cell. Biol.，155 :381-92 ；Mayer 等(1997) J. Cell. Biol.，139 :1477-84)，表明活化G8p°7MyoDp°s分化成成肌纖維細胞的能力對許多組織中纖維化發(fā)展有貢獻。實施例3將成年小鼠的眼在石蠟中包埋，切片后用蘇木精和伊紅染色(圖8A)。在圖8B和圖8C中，箭頭表示熒光顯微照片中較高的放大倍數下顯示的區(qū)域。晶狀體中緯線附近的細胞用G8抗體標記(圖8B和圖8C中的箭頭)。細胞核用染料染色。這些結果證明成年小鼠的晶狀體中存在骨骼肌干細胞。橫紋肌肉瘤是含有類似于骨骼肌細胞的細胞的腫瘤(圖9A-9D)。在人橫紋肌肉瘤細胞的培養(yǎng)物中G8抗體也識別其抗原。橫紋肌肉瘤細胞能合成也存在于成肌纖維細胞中的分子，包括G8抗原、α平滑肌肌動蛋白(SMA)、肌球蛋白和MyoD蛋白。這些結果表明G8 抗體可用來檢測人晶狀體中的成肌纖維細胞。盡管已經對本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案作了描述并在上文進行了具體的舉例說明，但是預期，本發(fā)明并不局限于所述的實施方案。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改，如同所附權利要求書中公開的一樣。
權利要求
1.一種抑制晶狀體纖維化疾病的方法，所述方法包括給予有需要的患者的晶狀體治療有效量的至少一種骨骼肌干細胞靶向分子和至少一種細胞毒性分子。
2.權利要求1的方法，其中所述至少一種骨骼肌干細胞靶向分子綴合至所述至少一種細胞毒性分子。
3.權利要求1的方法，其中所述至少一種骨骼肌干細胞靶向分子和至少一種細胞毒性分子包含在還包含至少一種藥學上可接受的載體的組合物中。
4.權利要求1的方法，其中所述晶狀體纖維化疾病是后囊混濁或前囊下白內障。
5.權利要求1的方法，其中所述骨骼肌干細胞靶向分子特異性地結合選自以下的分子G8抗原、多配體蛋白聚糖、c-Met、⑶34和M-鈣黏著蛋白。
6.權利要求1的方法，其中所述細胞毒性分子選自補體、熱敏性碳納米晶體、細胞毒性抗生素、陽離子兩親性裂解肽、放射性核素和毒素。
7.權利要求1的方法，其中將所述組合物直接給予到晶狀體或周圍組織。
8.權利要求5的方法，其中所述骨骼肌干細胞靶向分子是G8抗體。
9.權利要求6的方法，其中所述細胞毒性分子是補體。
10.一種用于抑制晶狀體纖維化疾病的組合物，所述組合物包含至少一種骨骼肌干細胞靶向分子、至少一種細胞毒性分子和至少一種藥學上可接受的載體。
11.權利要求10的組合物，其中所述至少一種骨骼肌干細胞靶向分子綴合至所述至少一種細胞毒性分子。
12.權利要求10的組合物，其中所述骨骼肌干細胞靶向分子是G8抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療纖維化疾病的組合物和方法。
文檔編號A01N63/02GK102333447SQ200980156374
公開日2012年1月25日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權日2008年12月4日
發(fā)明者A·S·門科, J·L·沃克, J·格爾哈特, M·喬治-溫斯坦 申請人:蘭肯瑙醫(yī)學研究所