專利名稱：細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物的制作方法
細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人及動(dòng)物細(xì)胞及組織的冷凍保存用試劑，其能減輕在冷凍及解凍細(xì)胞 及組織時(shí)對(duì)細(xì)胞及組織的損傷或傷害。此冷凍保存技術(shù)預(yù)期在需要冷凍保存活的組織(例 如皮膚，角膜，胰島及心臟瓣膜)的移植醫(yī)學(xué)中，及在需要冷凍保存細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞， 間葉干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)等)的再生醫(yī)學(xué)中高度需求。
背景技術(shù)：
在0°C或以下溫度的冷凍保存技術(shù)常規(guī)用于長(zhǎng)-時(shí)間保存帶水的或含水物質(zhì)(例 如植物及動(dòng)物的細(xì)胞及組織以及食品)。已知冷凍這些物質(zhì)時(shí)，冰晶形成，得到不均勻濃度 的被水分子排除的溶質(zhì)及混入物，稱為‘冷凍濃縮’。為阻止冷凍濃縮，可將各低分子量化合物加入冷凍保存介質(zhì)。例如，加入二甲基亞 砜(DMSO)，甘油等作為冷凍-保護(hù)劑，以最小化由冷凍保存過程中細(xì)胞中的結(jié)晶化的水導(dǎo) 致的對(duì)細(xì)胞及組織的損傷。因此，細(xì)胞通常懸浮于冷凍管中的含5 20%冷凍保存劑(例如DMS0，甘油，乙二 醇及丙二醇)的生理溶液，培養(yǎng)基中，及于低溫，-80°C或-196°C保存。這些試劑中，DMSO是最有效的及常采用的，但其在生理學(xué)上有毒，及已知當(dāng)將細(xì)胞 輸注到受者時(shí)導(dǎo)致高血壓，惡心及嘔吐。而且，DMSO毒性傾向于衰減解凍的細(xì)胞培養(yǎng)或輸 注到受者身體后細(xì)胞的存活率和/或功能。這些試劑中，甘油具有更低冷凍保存效果，及要求僅于室溫或非冷凍低溫保持細(xì) 胞懸浮液后冷凍，或通過使用程序冷凍器等精確控制降低的溫度。而且，因?yàn)樗鼈儗?duì)細(xì)胞生 存及功能的低保護(hù)效果，所述冷凍保存劑對(duì)解凍的細(xì)胞有害。冷凍保存干細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞或iPS細(xì)胞)或生殖細(xì)胞(例如精子，未受精 的或受精卵)中，用高濃度的冷凍保護(hù)劑(例如DMS0，乙酰胺，丙二醇及聚乙二醇)進(jìn)行快 速冷凍或玻璃化。玻璃化快速致使細(xì)胞內(nèi)水成為玻璃化狀態(tài)，以避免冰晶形成所致的對(duì)細(xì) 胞的傷害或損傷。還是，細(xì)胞或組織被濃的冷凍保存劑的高毒性損傷非?？赡?；因此，此技 術(shù)僅在一些有限情況中采用。制備藥學(xué)產(chǎn)品，食品及用于展示目的的冰雕中，使用例如氯化鈉或糖，葡萄糖及海 藻糖的添加劑。也使用其他由生物(例如植物，魚及昆蟲)制得的例如抗冷凍蛋白或抗冷 凍糖蛋白的添加劑(特開2005-126533及特開2003-250506)。燃料電池中，水通過電化學(xué)反應(yīng)在任何一個(gè)電極產(chǎn)生。例如，在質(zhì)子-交換膜燃料 電池中，水在陰極電極產(chǎn)生；及產(chǎn)生的一部分水通過電解質(zhì)膜向陽極側(cè)移動(dòng)。水也將從進(jìn)入 電池的氣體中的蒸汽冷凝產(chǎn)生。這些水潛在地阻礙氣流，耗竭氣體本身的供給及最終降低 電池表現(xiàn)。這些錯(cuò)雜可通過用親水包被材料(例如蛋白)處理氣體分隔物表面，由此限制水 冷凝來防止，但液體水甚至在所述條件下于低溫偶爾冷凍導(dǎo)致其他錯(cuò)雜。為防止此問題，將 有抗冷凍蛋白的聚合物電解質(zhì)加入樹脂層，其然后包被聚合物電解質(zhì)膜表面(下列Adler 等人)，但此方法具有高成本的問題。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1特表平10-51140專利文獻(xiàn)2專利第3694730號(hào)專利文獻(xiàn)3特開2005-12653專利文獻(xiàn)4特開2OO3-25O5Oe專利文獻(xiàn)5特開2008-04159非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)IlLovelock JE and Bishop MWH, Nature 183 1394-1395,1959非專利文獻(xiàn)2Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164 :666_666，1949非專利文獻(xiàn)3Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, LakeyJRT. Cell Preserv Technol 5，16-24，200非專利文獻(xiàn)4Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20，1779-1786，200非專利文獻(xiàn)5Yu ΗΝ, Lee YR, Nob EM，et al. INT JHEMAT0L = 87 189-194 ；2008非專利文獻(xiàn) 6Adler S, Pellozzer C, Paparella Μ, Hartung Τ, Bremer S.Toxicol in Vitro 20 :265_271 ；200
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題常規(guī)冷凍保存方法(包括快速冷凍技術(shù))在冷凍及解凍后不可保存細(xì)胞或組織的 完全結(jié)構(gòu)完整性；因此，非常需要有低毒性的新冷凍保存物質(zhì)。而且，已知DMSO誘導(dǎo)細(xì)胞 (例如HL-60細(xì)胞)分化；因此，其不適于某些類型的細(xì)胞。抗冷凍蛋白及糖蛋白具有優(yōu)良 的保存能力，但用于食物成本太高(JPY1，300，000YEN/g)，更別提用于細(xì)胞及組織。本發(fā)明旨在提供具有優(yōu)良的保護(hù)效果及對(duì)于細(xì)胞或組織的低毒性的冷凍保存劑， 從而取代DMSO。本發(fā)明也旨在提供廉價(jià)的及安全的具有類似于抗冷凍蛋白及糖蛋白的阻止 冷凝的性質(zhì)的冷凍保存劑，從而以使冷凍保存及冷凍干燥物質(zhì)(例如食品及藥學(xué)產(chǎn)品)。解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明的冷凍保存液包括基本上1 50%的具有側(cè)鏈氨基的聚胺；及生理溶液 (例如鹽水或培養(yǎng)基)。發(fā)明效果通過將各動(dòng)物細(xì)胞(包括人細(xì)胞)及植物細(xì)胞浸入冷凍保存液然后于-80°C冷凍 保存或用液體或蒸汽氮冷卻下，而能不使用高度毒性DMSO或其他常規(guī)冷凍保存劑而保持 它們的存活率及生物活性地保存。因?yàn)槲词褂贸Ｒ?guī)冷凍保存劑(例如DMS0，甘油，乙二醇) 等，對(duì)細(xì)胞的毒性保持低，及能不降低細(xì)胞的生物活性地長(zhǎng)時(shí)間冷凍保存細(xì)胞。而且，冷凍 保存液無蛋白成分(例如胎牛血清及白蛋白)，因此，無感染疾病的擔(dān)憂，及不受偶爾見于 由生物材料制成的藥學(xué)產(chǎn)品的巨大變化的影響。具有側(cè)鏈氨基的聚胺(例如ε _聚-L-賴氨酸及聚烯丙胺)由于側(cè)鏈氨基而具有 與細(xì)胞膜的親和力，因此，認(rèn)為具有細(xì)胞保護(hù)效果。具有豐富的羧基的聚合物化合物也具有與水的高親和性，因此，將在冷凍過程中，將細(xì)胞內(nèi)水輔助移出到周圍的培養(yǎng)基，由此預(yù)期 具有冷凍保存效果。以足夠的比例兼有氨基及羧基的聚合物化合物預(yù)期在冷凍時(shí)具有對(duì)細(xì) 胞的進(jìn)一步改善的冷凍保存效果。因此，本發(fā)明以提供具有高有效性及高安全性的冷凍保 存液為目標(biāo)，銳意研究了具有陽離子基團(tuán)(例如側(cè)鏈氨基)的聚合物化合物(例如聚氨基 酸)，或具有陰離子基團(tuán)(例如羧酸基)的聚合物化合物、以及兼有陽離子及陰離子基團(tuán)的 聚合物化合物的條件或要求。本發(fā)明的冷凍保存劑相比DMSO毒性小，及不要求細(xì)胞或組織解凍后洗滌。然后可 將解凍的細(xì)胞或組織直接懸浮于培養(yǎng)基中，以立即開始培養(yǎng)處理。可根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存；及而且期望能通過保持功 能細(xì)胞(例如胰島及干細(xì)胞(例如ES細(xì)胞，間葉干細(xì)胞及iPS細(xì)胞))的細(xì)胞功能來保存。 因此，預(yù)期改善這些細(xì)胞的移植效率。通過使用本發(fā)明的非冷凍聚_氨基酸，能阻止具有生理物質(zhì)的帶水物質(zhì)的冷凍過 程中的生理物質(zhì)的鈍化。而且，通過使用非冷凍聚-氨基酸，可在通過帶水或含水物質(zhì)的冷 凍或冷凍干燥來獲得冷凍的產(chǎn)品或冷凍干燥的產(chǎn)品的過程中達(dá)到不同于水分子的成分的 均勻擴(kuò)散。冷凍的產(chǎn)物可為冰淇淋，果汁牛奶凍，其他冷凍甜食，展覽用冰，速凍湯等；及冷 凍干燥產(chǎn)品可為冷凍干燥的粉末形式的食品或藥學(xué)產(chǎn)品。本發(fā)明的非冷凍試劑也可應(yīng)用于工業(yè)用燃料電池，以阻止它們的由于液體冷凍的 起始表現(xiàn)的劣化。

圖1是顯示ε -聚-L-賴氨酸中阻斷的氨基的百分率與通過使用氨基通過琥珀酸 酐部分阻斷的ε _聚-L-賴氨酸冷凍保存的有活力的L929細(xì)胞的百分率之間的關(guān)系的坐 標(biāo)圖；圖2是顯示部分阻斷的聚-L-賴氨酸的濃度與通過使用已以相當(dāng)于ε _聚-L-賴 氨酸的氨基的63%的摩爾量加入琥珀酸酐的ε -聚-L-賴氨酸(PLL琥珀酸酐63% )冷凍 保存的有活力的L929細(xì)胞的百分率之間的關(guān)系的坐標(biāo)圖；圖3-1是顯示已在10% DMSO/胎牛血清中冷凍，然后解凍及不洗滌或稀釋地立即 培養(yǎng)于平板24小時(shí)的L929細(xì)胞的培養(yǎng)物的顯微鏡圖像；圖3-2是顯示已在含63%琥珀酸酐的7. 5% PLL溶液中冷凍，然后解凍及不洗滌 或稀釋地立即轉(zhuǎn)移到平板24小時(shí)的L929細(xì)胞的培養(yǎng)物的顯微鏡圖像；圖4是顯示在含63%琥珀酸酐和10% DMSO/胎牛血清的7. 5% PLL溶液中冷凍的 大鼠間葉干細(xì)胞(RMSC)，及就它們的分化為骨，脂肪體，及軟骨的多能性進(jìn)行評(píng)估的一組坐 標(biāo)圖。包括未冷凍的及未分化的細(xì)胞用于比較。圖5是顯示通過在30%蔗糖水溶液中加入0. 1 15% PLL ( ε -聚-L-賴氨酸) (PLL琥珀酸酐63% )防止冰重結(jié)晶的一系列顯微鏡圖像。圖6是顯示冷凍的不含琥珀酸酐的5% PLL溶液(ε -聚-L-賴氨酸)及含63% 琥珀酸酐的5% PLL溶液(PLL琥珀酸酐63% )中的晶體結(jié)構(gòu)的顯微鏡圖像。圖7是冷凍干燥的瓊脂凝膠的照片(1)。左邊的凝膠是無添加劑，及右邊的具有含 63%琥珀酸酐的5% PLL0
圖8是冷凍的-解凍的瓊脂凝膠的照片⑵。含63%琥珀酸酐的PLL濃度是0% (左)，1% (中)及3% (右)。實(shí)施方式通過在生理溶液中溶解1 ；優(yōu)選2 ，特別優(yōu)選3 ， 及更優(yōu)選5 10 / %的聚合物(例如聚-賴氨酸)來得到本發(fā)明的冷凍保存液。待使用的 生理溶液是生理鹽水以及用于培養(yǎng)各細(xì)胞及組織的培養(yǎng)基。例如，Dulbecco-改良的eagle MEM培養(yǎng)基(DMEM)可為優(yōu)選的培養(yǎng)基之一。代之以，或除了聚-賴氨酸之外，可使用聚烯丙 胺。代替這些，或除了這些之至少一種之外，待使用的化合物選自其他聚胺(例如導(dǎo)入氨 基的多糖類)及聚-氨基酸(例如聚-精氨酸，聚-谷氨酸及聚-天冬氨酸)；也選自葡聚 糖，糊精，支鏈淀粉及脫乙酰殼多糖的多糖化合物，以及聚羧酸(例如聚丙烯酸)。這些聚合 物中，優(yōu)選的是具有可通過在相同單體分子中兼有陽離子及陰離子取代基的單體化合物的 聚合獲得的結(jié)構(gòu)的聚合物；及尤其優(yōu)選的是聚-氨基酸。更特別是，尤其優(yōu)選的是具有兼有 氨基及羧基的重復(fù)單元的聚合物。待使用的聚-賴氨酸可為ε _聚-L-賴氨酸或ε _聚-D-賴氨酸或α -聚_L_賴 氨酸。冷凍保護(hù)劑聚合物具有100與100，000之間的分子量。最優(yōu)選的聚合物落入常規(guī)用 作食品添加劑的一組ε-聚-L-賴氨酸。這些或者是通過酶合成的或通過鏈霉菌屬真菌 產(chǎn)生的，及具有1000 20，000的平均分子量，及特別具有1000 10，000的平均分子量 (http//www. chisso. co. jp/fine/jp/polylisin/index, html)，嘗試產(chǎn)生有變動(dòng)于 15 35之間的聚合度，及有20或更低聚合度(例如，特開2003-171463及特開2005-318815)。 平均分子量或平均聚合度可容易通過十二烷基硫酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)， 通過例如使用由Atto有限公司提供的電泳設(shè)備及密度計(jì)(AE-6920V型)測(cè)量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白 標(biāo)記物用于測(cè)量?？蔁崽幚砭踎賴氨酸，以增加其分子量大于30，000及用作聚合物化合 物。但是，以上提及的分子量范圍由于隨著分子量的增加的粘度而優(yōu)選。因?yàn)榫哂杏坞x末 端羧基的聚_賴氨酸具有側(cè)鏈伯氨基，它們的如下文所述的通過二羧酸酐的部分酰胺化大 大給出優(yōu)良的混合性及增溶表現(xiàn)。也可根據(jù)本發(fā)明采用的其他特別有利的聚合物化合物是 平均分子量1000 1，000，000，優(yōu)選1000 20，000的聚烯丙胺。例如，所述可采用的聚合 物是向烯丙胺聚合物(日東紡織有限公司的PAA-03)的水溶液加入乙酸酐或乙酸；及部 分-甲氧基-羰基化的烯丙胺聚合物(日東紡織有限公司的PAA-U5000)。烯丙胺聚合物， 如同聚_賴氨酸，僅具有側(cè)鏈基團(tuán)伯氨基，但每單位分子量的伯氨基密度相比在聚_賴氨酸 中，在烯丙胺聚合物中更大。而且，當(dāng)烯丙胺部分羧化時(shí)，得到的聚合物化合物認(rèn)為如同后 述部分_羧化的聚_賴氨酸發(fā)揮作用。優(yōu)選地，聚胺的氨基通過用羧酸酐羧基化或乙?；瘉聿糠肿钄?。此阻斷通過氨基 的羧化或乙?；羶?yōu)選50-99mol %，特別50 93mol %，更優(yōu)選50 90mol %，再更優(yōu)選為 55 80mol %，及最優(yōu)選58 76mol %的程度來進(jìn)行。約50 %的氨基將通過與52 53mol % 的無水羧酸(相對(duì)于聚胺中氨基的摩爾量)反應(yīng)來阻斷。正常反應(yīng)條件下，當(dāng)與IOOmol% 無水羧酸反應(yīng)時(shí)，將阻斷90 95%的氨基。以上提及的范圍以上或以下的阻斷率將降低冷 凍保存效果。本文中可采用的羧酸酐包括乙酸酐，檸檬酸酐，琥珀酸酐，戊二酸酐，蘋果酸 酐，富馬酸酐及蘋果酸酐。這些中，特別優(yōu)選琥珀酸酐及乙酸酐。但是，也可使用氨基未阻斷而處于游離狀態(tài)的聚胺；因此可采用的羧化及乙酰化程度跨0 100mOl/mOl%的范圍。本發(fā)明中，可使用部分羧基胺化的聚羧酸。更特別是，聚 羧酸可通過使其羧基與化合物(例如二胺，三胺及聚胺)反應(yīng)來部分胺化?？刹捎玫亩肥?乙二胺及酰胼，例如己二酸二酰胼。這些氨基化合物與羧酸的反應(yīng)以與碳二亞胺的加成反 應(yīng)方式進(jìn)行。這種情況下，可采用在0 lOOmol/mol %范圍內(nèi)的胺化作用程度。如同氨基阻 斷，殘留羧基的百分率優(yōu)選在50 99mol %范圍內(nèi)，更優(yōu)選在60 97mol %范圍內(nèi)，其中， 殘留百分率是胺化的羧酸基的殘留百分比。例如，使用具有平均分子量1000 3，000，000, 或尤其是1000 10，000的聚丙烯酸 ’及1 50mol%的，優(yōu)選3 40mol%的聚丙烯酸的 羧基用胺類及碳二亞胺(例如乙二胺二酰胼等)阻斷。本發(fā)明的冷凍保存液也可含0.3 15w/w%,或尤其是0. 1 的常規(guī)冷凍保存物質(zhì)，例如DMS0，甘油，乙二醇，海藻糖或 蔗糖。因?yàn)榧?xì)胞在冷凍及解凍期間經(jīng)受氧化應(yīng)激所致的損傷，將抗氧化劑添加到冷凍保護(hù) 劑預(yù)期提高其保存效果。例如，可使用抗氧化劑，例如過氧化氫酶，過氧化物酶，超氧化物歧 化酶，維生素E，維生素C，多酚(例如表沒食子兒茶酚沒食子酸酯)或谷胱甘肽。本發(fā)明的冷凍保存劑的滲透壓是200 1000m0sm/kg，更優(yōu)選為300 700m0sm/ kg,及還優(yōu)選400 600m0sm/kg。本發(fā)明的冷凍保存劑可應(yīng)用于保存不僅細(xì)胞，而且組織。 所述待用冷凍保存劑冷凍保存的細(xì)胞及組織之例是培養(yǎng)的細(xì)胞系，動(dòng)物及人來源的受精 卵。進(jìn)一步例為精子細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞，間葉干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，神經(jīng)元干細(xì) 胞，臍帶血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞及血細(xì)胞。 不僅可包括動(dòng)物或人細(xì)胞，而且包括植物細(xì)胞。能通過根據(jù)本發(fā)明的冷凍保存劑保存的組 織及器官是皮膚，神經(jīng)，血管，軟骨，角膜，肝，腎，心臟及胰島。而且，以上提及的聚合物化合物也可應(yīng)用于通過將聚合物化合物加入食品或藥物 用含水或帶水物質(zhì)，以避免冷凍濃縮及由此獲得成分均勻擴(kuò)散的冷凍的或冷凍干燥的產(chǎn)品 來產(chǎn)生冷凍的或冷凍干燥的食品或藥物。特別可采用通過與琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸 酐反應(yīng)來用羧化或乙?；钄喟被倪x自下列的化合物ε _聚-L-賴氨酸，α -聚-L-賴 氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖類及聚烯丙胺。沒必要使用生理溶液溶解聚合 物化合物。例如，將具有部分阻斷的氨基的聚_賴氨酸，其他聚-氨基酸或胺化的聚-糖 加入前述用于冰淇淋或冷凍干燥的食品的帶水的或含水物質(zhì)，從而聚合物化合物的濃度成 1 15%。用此方式，冷凍濃縮被阻止。如果將琥珀酸酐用于阻斷聚合物基團(tuán)，則當(dāng)相當(dāng)于 氨基的50 85mol %的摩爾量的琥珀酸酐與聚合物反應(yīng)時(shí)(其中實(shí)際氨基-阻斷率在約 48 SOmol %的范圍內(nèi))，得到阻止冷凍濃縮的優(yōu)良效果。上述聚合物化合物可在工業(yè)用燃料電池中應(yīng)用，從而將聚合物化合物加入燃料電 池，以阻止它們的起始表現(xiàn)的劣化(可在起始時(shí)以別的方式液體冷凍所致)。更特別是，可 采用具有氨基的單元形成的聚合物化合物，其選自ε-聚-L-賴氨酸，α-聚-L-賴氨酸， 聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖類及聚烯丙胺；其中聚合物化合物的氨基通過羧化或 乙?；ㄟ^與琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反應(yīng)來阻斷；及聚合物化合物可加入暴露于 燃料電池內(nèi)側(cè)的表面層材料。例如，聚合物化合物可以1 15 / %摻入形成分隔物或固體 電解質(zhì)膜表面的涂層材料，或尤其是UV固化性樹脂液體。
實(shí)施例以下示本發(fā)明的實(shí)施例以及比較例，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1冷凍保存溶液的制備使用ε -聚-L-賴氨酸(由Chisso公司制造；分子量4000)的25%水溶液；及 使用聚烯丙胺(Nittobo，分子量 5000 [PAA-05L]，15000 [PAA-L]，60000 [ΡΑΑ-Η])的 20%水 溶液。相對(duì)于聚胺聚合物的氨基，向各溶液均加入0 IOOmol %琥珀酸酐(和光純藥工 業(yè)制)，以獲得有具有不同氨基_阻斷率的阻斷的氨基的聚_胺類。將各聚_胺溶液加入 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM, Sigma Aldrich)至 0 10w/w%。此時(shí)，將培養(yǎng)基 pH 用IN鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至7. 0 8. 0。而且，用蒸汽壓滲透壓計(jì)(5型520，Wescor)測(cè) 量培養(yǎng)基滲透壓及用10%氯化鈉水溶液調(diào)節(jié)。實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞的冷凍保存在冷凍瓶(SimportPlastics)中，將 1 X IO6 細(xì)胞的 L929，MG63, Caco_2(大日本 住友制藥)，Colon26，HT1080，B16F1及KB細(xì)胞(ATCC)的各細(xì)胞種均懸浮于Iml的各冷凍 液；然后在_80°C冷凍器中冷凍。一周后，將細(xì)胞在37°C水浴中快速解凍，在DMEM中洗滌及 用錐蟲藍(lán)染料進(jìn)行細(xì)胞死亡率測(cè)試。然后將解凍的細(xì)胞以IX IO5細(xì)胞/孔接種于6孔培 養(yǎng)板，及在培養(yǎng)6及24小時(shí)后用錐蟲藍(lán)染料評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。將作為通常使用的冷凍保存 劑的胎牛血清(FBS)中的10% DMSO用作比較例的冷凍保存液。如圖1中所示，當(dāng)在冷凍保存L929細(xì)胞中用作冷凍保存液的是已通過相對(duì)于氨基 加入50%或更多摩爾量的琥珀酸酐來修飾的聚-賴氨酸(PLL)的各7. 5%溶液時(shí)，則達(dá)到 幾乎相同或高于使用DMSO溶液的比較例的細(xì)胞活力。作為通過茚三酮及TNBS方法定量測(cè) 量殘留氨基的結(jié)果，已通過加入100%摩爾量的琥珀酸酐修飾的羧化的聚-賴氨酸(PLL)顯 示具有93 %氨基-阻斷百分率。已通過相對(duì)于聚-賴氨酸的氨基加入IOmol %，27mol %， 4511101%，5211101%，6311101%及7911101%摩爾量的琥珀酸酐修飾的聚-賴氨酸(PLL)分別顯 示具有10%，25%，43%，50%，60%及76%的氨基-阻斷百分率。如圖1中所示，具有在 50 93%范圍內(nèi)的氨基-阻斷百分率的聚-賴氨酸溶液顯示具有冷凍保存效果；及通過具 有60%的阻斷百分率(已加入63mol%的琥珀酸酐)及76%阻斷百分率(已加入79mol% 的琥珀酸酐)的聚-賴氨酸溶液達(dá)到特別高冷凍保存效果。當(dāng)使用具有部分阻斷的氨基的 聚烯丙胺(其為分子量5000的烯丙胺聚合物，已與相當(dāng)于烯丙胺聚合物中的氨基摩爾量的 45 90mol%的琥珀酸酐反應(yīng))水溶液時(shí)也如同上述顯示，隨著氨基-阻斷百分率增加的 細(xì)胞存活率改善。圖2顯示冷凍保存過程中，L929細(xì)胞的細(xì)胞存活率與通過相對(duì)于氨基加 入63%摩爾量的琥珀酸酐來修飾的部分阻斷的ε-聚-L-賴氨酸(其在圖中被表示 為"PLL(0.63)"及在下文說明書通篇稱為"PLL琥珀酸酐63%")的濃度之間的關(guān)系。 如圖2中所示，當(dāng)部分阻斷的聚-L-賴氨酸或PLL琥珀酸酐63%濃度是7. 0%或更高時(shí)， 則細(xì)胞存活率幾乎相同于或高于使用DMSO溶液得到的細(xì)胞存活率。當(dāng)使用具有部分阻斷 的氨基的聚烯丙胺(其為分子量5000的烯丙胺聚合物，已與相當(dāng)于氨基的摩爾量的63 85mol %的琥珀酸酐反應(yīng))水溶液時(shí)也顯示如同上述的趨勢(shì)。在圖1 2中，呈現(xiàn)最佳結(jié)果的范圍如在得到保存液的滲透壓時(shí)顯示，對(duì)應(yīng)于在 400 600m0sm/kg范圍內(nèi)的滲透壓。更特別地，當(dāng)滲透壓在400 600m0sm/kg范圍內(nèi)時(shí)得 到最佳保存效果。表1顯示當(dāng)將細(xì)胞冷凍保存于PLL琥珀酸酐63%的7. 5%溶液時(shí)的其他細(xì)胞種的
8冷凍保存效果。如表1所示，全部細(xì)胞種達(dá)到幾乎相同于或高于由DMSO溶液(10% DMSO/ 胎牛血清)得到的細(xì)胞存活率。盡管未顯示數(shù)據(jù)，有部分阻斷的氨基的聚烯丙胺產(chǎn)生類似 結(jié)果。表17.5% PLL (0. 63)對(duì)各細(xì)胞的冷凍保存效果
權(quán)利要求
1.細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物， 其包括 聚合物化合物，■其包括具有氨基的單元的聚合物，及■其選自ε-聚-L-賴氨酸，α-聚-L-賴氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，導(dǎo)入氨 基的多糖類及聚烯丙胺；及 生理溶液；及將所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至1 50W/W%。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述聚合物化合物的50 99mol%的氨基通過與羧酸酐 反應(yīng)而具有羧酸基或乙?；鶃碜钄唷?br> 3.細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物， 其包括 聚合物化合物，■其包括具有羧基的單元的聚合物，及■其選自聚丙烯酸，α-聚-谷氨酸，γ-聚-谷氨酸，聚-谷氨酸，聚-天冬氨酸，其 他聚-氨基酸及羧化的多糖類；及 生理溶液；及將所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至1 50W/W%。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚合物化合物的1 50mol%的羧基通過與具有多 個(gè)氨基的化合物反應(yīng)來阻斷，所述具有多個(gè)氨基的化合物例如二胺，三胺及聚胺。
5.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述生理溶液是鹽水，Dulbecco-改良的 eagle MEM培養(yǎng)基(DMEM)，或者細(xì)胞或組織用培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000 20，000 范圍內(nèi)的數(shù)平均分子量的ε-聚-L-賴氨酸。
7.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000 3，000, 000范圍內(nèi)的數(shù)平均分子量的聚丙烯酸。
8.食品或藥物的冷凍保存或冷凍干燥用添加劑組合物， 其包括聚合物化合物， 其包括具有氨基的單元的聚合物，及 其選自ε -聚-L-賴氨酸，α -聚-L-賴氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，導(dǎo)入氨 基的多糖類及聚烯丙胺；且其中所述聚合物化合物的氨基通過與羧酸酐反應(yīng)而具有羧酸基或乙酰基來阻斷。
9.制備食品，藥物或燃料電池的方法，包括將權(quán)利要求1中所述的添加劑加入 用于產(chǎn)生食品或藥物的帶水物質(zhì)、或 工業(yè)產(chǎn)品元件，例如燃料電池的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件， 至所述添加劑的濃度成為在1 范圍內(nèi)。
全文摘要
課題提供可不使用二甲基亞砜等的有害的冷凍保存劑地安全地冷凍保存包括人的動(dòng)物或植物的細(xì)胞或組織的冷凍保存用組合物。另外，提供向食品或藥品的冷凍保存或冷凍干燥制品的應(yīng)用。解決手段使ε-聚-L-賴氨酸與無水琥珀酸反應(yīng)使而阻斷ε-聚-L-賴氨酸的氨基的60％以上。將如此得到的高分子化合物以7.5w/w％溶解于市售的培養(yǎng)液之一的Dulbecco-改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中而作為冷凍保存液。另外，向食品或藥品添加0.5～10％ε-聚-L-賴氨酸琥珀酸衍生物而防止冷凍濃縮。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102124098SQ200980130709
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者松村和明, 玄丞烋, 須賀井一 申請(qǐng)人:博傲沃德株式會(huì)社