專利名稱：方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶降低基于肉的食品的膽固醇含量和/或改進(jìn)基 于肉的食品的性質(zhì)的方法，以及由此獲得的基于肉的食品。
背景技術(shù)：
在肉和香腸產(chǎn)品的生產(chǎn)中，一個(gè)主要目標(biāo)是乳化所添加的脂肪，并且利用來自肉 基質(zhì)的活化蛋白粘合或固定所添加的水。例如，熟香腸的制造技術(shù)包括機(jī)械能以及活化釋 放蛋白的添加劑的影響，所述添加劑例如磷酸酯(鹽)和鹽類。最終結(jié)果應(yīng)當(dāng)是均質(zhì)、經(jīng)精 細(xì)切割且質(zhì)地平滑的產(chǎn)品，其能夠耐受處理而沒有脂肪或水的分離，顯示出堅(jiān)實(shí)的質(zhì)地和 好的咬感(Feiner 2006 Meat products handbook. CRC Press，239—312)。如果沒有正確地遵守負(fù)責(zé)形成和穩(wěn)定肉產(chǎn)品乳液的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，即原料的質(zhì)量波 動(dòng)(例如，肉色蒼白、質(zhì)地松軟且表面有汁液滲出(PSE)的肉和暗紅色、質(zhì)地堅(jiān)硬、表面干 燥(DFD)的肉)、配方、加工條件(例如時(shí)間和溫度)，可能生產(chǎn)出不再符合消費(fèi)者需要的 不穩(wěn)定產(chǎn)品(Fischer et al.，1991 Finely comminuted liver sausage-How the normal commercial emulsifiers work. Fleischwirtsch 71，780-783)。在肉和香腸的加工中使用乳化劑以補(bǔ)償肉原料中的這些質(zhì)量波動(dòng)，從而確保一致 的終產(chǎn)物質(zhì)量，并促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)中涉及的技術(shù)過程(Nau & Adams，1992 Emulsifiers for use in sausage and meat products. Food marketing & technology June,13-20)。在具有大量脂肪含量的乳化肉產(chǎn)品，例如在精膏(fine paste)香腸和肉醬中，期 望其具有脂肪穩(wěn)定性，從而使脂肪損失最小化，并降低可見脂肪的量。此外，還希望肉汁損 失少，并且具有可接受的風(fēng)味、質(zhì)地和外觀?？商砑尤榛瘎┮赃_(dá)到這些效果，且最常見的一 些乳化劑是分離的蛋白或蛋白濃縮物，例如大豆蛋白或酪蛋白酸鈉。然而，這些蛋白的特 征在于相對(duì)昂貴并且在肉產(chǎn)品中的許可含量有限制。也可以使用添加劑，例如甘油單酯和 甘油二酯和檸檬酸酯作為乳化劑(Varnam & Sutherland, 1995 Meat and meat products. Technology, chemistry and microbiology. Chapman & Hall Vol 3, 244-250),但由于價(jià)格或標(biāo)簽(即在肉產(chǎn)品標(biāo)簽上沒有添加劑)的原因，它們的應(yīng)用通常是不期望的。已知酶在食品應(yīng)用中是有優(yōu)點(diǎn)的。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在食物中具有 顯著的酰基轉(zhuǎn)移酶活性。這種活性在食物的制備方法中具有令人驚奇的有益應(yīng)用(參見， 例如 W02004/064537)。由于酶處理必須在約10°C至約55°C之間的溫度下發(fā)生，否則酶可能失活或不能 發(fā)揮最佳的作用，因此在基于肉的食品的制備中，一些酶的應(yīng)用可能是不利的。然而，大部 分腐敗菌、病原體和真菌能夠在這些溫度下增殖。因此，可能期望找到與風(fēng)味、質(zhì)地和外觀 相關(guān)的問題的解決方案，其減少了基于肉的食品中的腐敗菌、病原體和真菌在加工期間的增殖。根據(jù)肉消耗和膽固醇含量數(shù)據(jù)，估計(jì)三分之一至一半的推薦每日膽固醇攝取量 是由肉提供的(Chizzolini et al. , 1999 Calorific value and cholesterol content of normal and low-fat meat and meat products. Trends in food science and technology,10，119-128)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是降低基于肉的食品中的膽固醇?？蛇x地，或除了降低膽固醇 之外，還希望保持和/或改進(jìn)一種或多種以下特征脂肪穩(wěn)定性以使基于肉的產(chǎn)品中脂肪 損失最小化并減少可見脂肪的量、風(fēng)味、質(zhì)地、重量損失和外觀。另一個(gè)目標(biāo)是制備使腐敗菌、病原體和真菌的增殖具有降低的可能性的基于肉的食品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的各個(gè)方面體現(xiàn)于權(quán)利要求書和以下說明中。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過向用于制備基于肉的食品的肉中添加脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移 酶，能夠?qū)崿F(xiàn)所述基于肉的食品中的膽固醇含量顯著下降。此外，還驚訝地發(fā)現(xiàn)，能夠使所 述基于肉的食品中的膽固醇含量下降，而沒有影響以下一個(gè)或多個(gè)特征的任何不良作用 質(zhì)地、重量損失、脂肪穩(wěn)定性(包括油脂性和/或熱加工期間脂肪分離減少)、風(fēng)味和外觀。更驚訝的是，發(fā)現(xiàn)通過向用于制備基于肉的食品的肉中添加脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，能 夠使所述基于肉的食品中的膽固醇含量顯著下降，同時(shí)實(shí)現(xiàn)一種或多種以下效果質(zhì)地改 進(jìn)；重量損失減少；脂肪穩(wěn)定性提高(包括油脂性降低和/或熱加工期間脂肪分離減少)、 風(fēng)味和外觀改進(jìn)。更驚訝的是，發(fā)現(xiàn)通過向用于制備基于肉的食品的肉中添加脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，可 在低溫(例如，低于10°c )或較高溫度(例如，65°C以上)下加工所述肉，即在不太可能導(dǎo) 致腐敗菌、病原體和真菌增殖的溫度下進(jìn)行加工。因此，這使得基于肉的最終食品中的腐敗 菌、病原體和/或真菌負(fù)載減少。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)基于肉的食品的方法，所述方法包 括a)使肉接觸脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；b)在約1°C至約75 °C之間的溫度下溫育所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉；c)由所述肉生產(chǎn)食品；其中步驟b)在步驟C)之前、期間或之后進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于降低基于肉的食品的膽固醇含量和/或 改進(jìn)其一個(gè)或多個(gè)特征(例如一個(gè)或多個(gè)以下特征改進(jìn)基于肉的食品的質(zhì)地和/或減少 重量損失和/或提高脂肪穩(wěn)定性和/或改進(jìn)風(fēng)味和/或改進(jìn)外觀)的方法，所述方法包括a)使肉接觸脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；b)在約1°C至約75 °C之間的溫度下溫育所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉；c)由所述肉生產(chǎn)食品；其中步驟b)在步驟C)之前、期間或之后進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)基于肉的食品中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)基于肉的食品中的應(yīng) 用，其技術(shù)效果是與其中肉未經(jīng)所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的基于肉的相當(dāng)(comparative) 食品相比，所述基于肉的食品的膽固醇量降低。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)基于肉的食品中的應(yīng) 用，其中技術(shù)效果是與其中肉未經(jīng)所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的基于肉的相當(dāng)食品相比，所 述基于肉的食品的膽固醇量降低和/或與其中肉未經(jīng)所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的基于肉 的相當(dāng)食品相比，所述基于肉的食品的一個(gè)或多個(gè)以下特征改善質(zhì)地改進(jìn)和/或重量損 失減少和/或脂肪穩(wěn)定性提高和/或風(fēng)味改進(jìn)和/或外觀改進(jìn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了膽固醇減少或不含膽固醇的基于肉的食品， 其包含至少30%的肉和滅活的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明所述方法可獲得(例如獲得)的基于肉的食品。發(fā)明詳述在一個(gè)實(shí)施方式中，適合地，可將所述肉與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶一起溫育約30分 鐘至M小時(shí)，適合地一起溫育約1小時(shí)至21小時(shí)之間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可在低于約10°C的溫度下將所述肉與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶 一起溫育，例如在約1 °C至約9 0C之間，適合地在約1 °C至約6 0C，適合地在約2 0C至約6 0C之 間，優(yōu)選在約2°C至約5 °C之間溫育。當(dāng)將所述肉與所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在低于約10°C的溫度下，例如在約1°C至約 9 0C之間的溫度，適合地在約1°C至約6 °C之間的溫度，適合地在約2 °C至約6 °C之間的溫度， 優(yōu)選在約2°C至約5°C之間的溫度溫育時(shí)，優(yōu)選將所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶溫育約10小時(shí)至約 24小時(shí)之間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可將所述肉與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在約60°C至約75°C之 間的溫度下，適合地在約62°C至約70°C之間的溫度，適合地在約60°C至約78°C的溫度，優(yōu) 選在約65°C至約70°C之間的溫度溫育。當(dāng)將所述肉與所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在約60°C至約75°C之間的溫度下，適合地在 約62°C至約70°C之間的溫度，適合地在約60°C至約78°C的溫度，優(yōu)選在約65°C至約70°C 之間的溫度溫育時(shí)，將所述肉與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶一起溫育約30分鐘至約2小時(shí)之間， 優(yōu)選約1小時(shí)至1. 5小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉和/或由此獲得的食品 進(jìn)一步加熱至一定的溫度并保持足夠的時(shí)間以將所述酶滅活，例如加熱至約80°C至約6140°C，優(yōu)選90°C至約120°C范圍的溫度。本文使用的術(shù)語“溫育”是指將所述肉和所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶保持在所述酶具有 活性，即能夠進(jìn)行脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)(特別是能夠?qū)⒅舅釓牧字w轉(zhuǎn)移到膽固醇受 體)的條件下。本文使用的術(shù)語“溫育”不意欲包括將肉和酶保持在所述酶失活、所述酶被 滅活和/或所述酶處于被滅活或變性過程中的條件下。在本發(fā)明的一些方面，術(shù)語“提高/增加”或“降低/減少”或“改進(jìn)”(或本文使 用的其他相關(guān)術(shù)語)是指將使用本發(fā)明脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的肉或基于肉的食品與未經(jīng) 本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理的相當(dāng)肉或基于肉的相當(dāng)食品(即由相同組分并以相同方式 生產(chǎn)的食品)進(jìn)行比較。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，“減少膽固醇的量”或“膽固醇減少”是指在 本發(fā)明所述的由脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的肉或基于肉的食品的膽固醇量減少，或低于沒有添 加本發(fā)明所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的相同肉或基于肉的食品(即由相同組分并以相同方式生產(chǎn))。優(yōu)選地，與沒有根據(jù)本發(fā)明用所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理的基于肉的相當(dāng)食品相 比，所述基于肉的食品的中的膽固醇減少至少約15%，優(yōu)選至少約20%，更優(yōu)選至少約 40 %，適合地至少50 %或至少60 %。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基于肉的食品中的膽固醇適合地減少約40%至約70% 之間。本文中所述“膽固醇”是指“未酯化的游離膽固醇”。因此，本文所述膽固醇量減少 是指未酯化的游離膽固醇的量減少。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的基于肉的食品可被視為“不含膽固醇”。術(shù)語“不 含膽固醇”是指所述肉或基于肉的食品中的所有或幾乎所有膽固醇都被轉(zhuǎn)化成膽固醇酯。 在一些實(shí)施方式中，可適合地將80 %以上，適合地90 %以上的未酯化游離膽固醇轉(zhuǎn)化成膽 固醇酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，“不含膽固醇”的產(chǎn)品可以是其中至少90%的未酯化游離膽固 醇已被轉(zhuǎn)化成膽固醇酯的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，可向所述肉或基于肉的食品中添加磷脂(例如來自大豆和/ 或蛋的磷脂)。所述磷脂可在用所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理之前、期間或之后添加。適合地， 所述磷脂的添加可導(dǎo)致所述基于肉的食品中的膽固醇水平進(jìn)一步降低。在一些實(shí)施方式中，本文使用的相關(guān)術(shù)語可用于比較使用本發(fā)明脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移 酶處理的肉或基于肉的食品和使用除脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶之外的酶處理的相當(dāng)肉或基于肉的 相當(dāng)食品，例如與使用常規(guī)磷脂酶，如Lecitase Ultra (Novozymes A/S，Denmark)或 Lipomod 699L，Biocatalyst, UK處理的相當(dāng)肉或基于肉的相當(dāng)食品進(jìn)行比較。為了便于參考，在適合的小節(jié)標(biāo)題下討論本發(fā)明的這些和其他方面。然而，在每個(gè) 部分中的教導(dǎo)不必局限于每個(gè)具體的部分。用于測(cè)定轉(zhuǎn)移酶活性(TrU)的轉(zhuǎn)移酶測(cè)定(膽固醇磷脂)底物將50mg膽固醇(Sigma C8503)和450mg大豆磷脂酰膽堿(PC)，Avanti #441601溶于氯仿，并在40°C真空蒸發(fā)氯仿。在40°C，將 300mg PC 膽固醇(9 1)分散在 IOml 50mM HEPES 緩沖液(pH7) 中。
酶解在40°C，將250 μ 1底物添加到帶蓋玻璃器中。添加25 μ 1酶溶液，并在攪動(dòng)下于40°C溫育10分鐘。在測(cè)定中，所添加的酶應(yīng)當(dāng)將2-5%的膽固醇酯化。此外，同樣分析使用25 μ 1水代替酶溶液的空白對(duì)照。10分鐘后，添加5ml己烷異丙醇(3:2)。使用膽留醇硬脂酸酯(Sigma C3549)作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，通過HPTLC分析膽固醇酯的量。計(jì)算在測(cè)定條件下每分鐘形成的膽固醇酯量，作為轉(zhuǎn)移酶活性。一個(gè)轉(zhuǎn)移酶單位(TrU)被定義為根據(jù)上文所述的轉(zhuǎn)移酶測(cè)定，在40°C，pH 7的條 件下，每分鐘產(chǎn)生膽固醇酯的μπιο 數(shù)。
優(yōu)選在本發(fā)明方法和應(yīng)用中使用的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有至少25TrU/mg酶蛋白的 每mg酶比轉(zhuǎn)移酶單位(TrU)。適合地，用于本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的添加量可為0.05_50TrU/g基于肉的食 品，適合地，所述量為0. 5-5TrU/g基于肉的食品。適合地，所述溫育時(shí)間是有效確保至少5%的轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選至少10%的轉(zhuǎn)移 酶活性，優(yōu)選至少15%、20%、25%、洸％、沘％、30%、40%、50%、60%或75%的轉(zhuǎn)移酶活性。可通過以下方法測(cè)定轉(zhuǎn)移酶活性％ (即轉(zhuǎn)移酶活性占總酶活性的百分比)用于測(cè)定轉(zhuǎn)移酶活性％的方法將肉樣品凍干，并將干燥的樣品在咖啡磨中碾碎。使用氯仿甲醇O 1)提取 0. 5g干肉粉30分鐘。分離有機(jī)相，并通過GLC分析。GLC 分析Perkin Elmer Autosystem 9000毛細(xì)管氣相色譜儀，其配備有WCOT熔凝硅石柱 12.5mX0.25mm IDX0. 1 μ m 膜厚度 5%苯甲基硅酮(CP Sil 8 CB，來自 Crompack)。載氣氦。注射器PSSI冷分流注射(由最初溫度50°C加熱至385°C )，體積1. 0 μ 1。檢測(cè)器FID :395 °C。爐程序(自2OO3年10月3O日開始使用)1 2 3爐溫(V)90 280 350等溫，時(shí)間(分鐘)1 0 10變溫速率(°C /分鐘)15 4樣品制備將從肉樣品提取的脂質(zhì)溶于包含0.5mg/ml十七烷內(nèi)標(biāo)的0.5ml庚 烷吡啶O 1)中。將300μ1樣品溶液轉(zhuǎn)移到鉗口瓶(crimp vial)中，添加300μ1 MSTFA (N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60°C反應(yīng)20分鐘。計(jì)算由純參比物質(zhì)測(cè)定對(duì)游離脂肪酸(FFA)、膽固醇、膽固醇棕櫚酸酯 (Cholesteryl palmitate)和膽固醇硬脂酸酯的反應(yīng)因子?；趯?duì)游離脂肪酸、膽固醇和膽固醇酯的反應(yīng)因子，計(jì)算肉樣品中這些成分的含8量％。將肉產(chǎn)品中脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移酶活性％計(jì)算為相對(duì)于未經(jīng)酶處理的相同肉 產(chǎn)品中的膽固醇量，經(jīng)酶處理的肉中的膽固醇下降％。實(shí)例對(duì)照肉產(chǎn)品0. 075 %膽固醇經(jīng)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的肉產(chǎn)品0. 030%膽固醇轉(zhuǎn)移酶活性=(0.075-0. 030)xl00/0. 075 = 60%轉(zhuǎn)移酶活性基于肉的食品本發(fā)明所述的基于肉的食品是指基于肉的任何產(chǎn)品。基于肉的食品適合于人和/或動(dòng)物作為食品和/或飼料消費(fèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方式中，所述基于肉的食品是用于飼喂動(dòng)物的飼料產(chǎn)品，例如寵物食品。在本發(fā)明的另一 個(gè)實(shí)施方式中，所述基于肉的食品是用于人的食品。基于肉的食品可包含非肉成分，例如水、鹽、面粉、乳蛋白、植物蛋白、淀粉、水解蛋 白、磷酸鹽(酯)、酸、調(diào)料、著色劑和/或調(diào)質(zhì)劑(texturising agent)。本發(fā)明所述的基于肉的食品優(yōu)選包含5-90% (重量/重量)的肉。在一些實(shí)施方 式中，所述基于肉的食品可包含至少30% (重量/重量)的肉，例如至少50%，至少60%或 至少70%的肉。在一些實(shí)施方式中，所述基于肉的食品是熟肉，例如火腿、腰肉、前腿肉、熏肉和/ 或豬胸肉。所述基于肉的食品可以是以下一種或多種干或半干的咸肉，例如用發(fā)酵劑培養(yǎng)物干腌并發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)品，如干香腸、薩拉米 香腸、意大利辣香腸和干火腿；乳化的肉食品(例如，用于冷食或熱食)，例如煙熏香肚、法蘭克福香腸、午餐肉和 肉醬；魚類和海鮮，例如蝦、鮭魚、重配的(reformulated)魚制品、冷凍包裝的魚類；新鮮肌肉，例如注射的整個(gè)肌肉(whole injected meat muscle)，如腰肉、肩肉火 腿、腌制的肉；經(jīng)碾碎和/或重構(gòu)的鮮肉，或重配的肉，例如通過冷凝膠或粘合升級(jí)的切割肉，例 如未烹制的生煎肉排、肉排、烤肉、生香腸、牛肉漢堡、肉丸、水餃子(pelmeni)；家禽產(chǎn)品，例如雞胸肉或火雞胸肉，或重配的禽肉，例如雞肉塊和/或雞肉腸；殺菌產(chǎn)品(retorted product)，即高壓滅菌的肉產(chǎn)品，例如野餐火腿、午餐肉、乳 化廣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，基于肉的食品是經(jīng)加工的肉產(chǎn)品，例如香腸、博洛尼 亞大香腸、肉糕、碎肉制品、肉末、咸肉、波洛尼亞香腸、薩拉米香腸或肉餡。經(jīng)加工的肉產(chǎn)品可以是，例如由基于肉的乳液制備的乳化肉產(chǎn)品，例如煙熏香肚、 博洛尼亞大香腸、意大利辣香腸、肝肉香腸、雞肉香腸、維也納小香腸、法蘭克福香腸、午餐 肉和肉餡?？蓪⒒谌獾娜橐哼M(jìn)行烹制、滅菌或烘焙，例如以烘焙的形式或在將基于肉的乳 液填充到腸衣例如塑料、膠原、纖維素或天然腸衣后進(jìn)行烹制、滅菌或烘焙。經(jīng)加工的肉產(chǎn)品還可以是重構(gòu)的肉產(chǎn)品，例如重構(gòu)的火腿。本發(fā)明的肉產(chǎn)品可經(jīng)歷加工步驟，例如鹽腌， 如干鹽腌；腌制，如鹵水腌制；干燥；熏制；發(fā)酵；烹制；罐裝；殺菌(retort)；切片和/或粉 碎。在一個(gè)實(shí)施方式中，與所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉可以是碎肉(minced meat)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述食品可以是乳化的肉產(chǎn)品。肉本文使用的術(shù)語“肉，，是指源自任何種類動(dòng)物的任何類型的組織。本文使用的術(shù)語肉可以是包含源自動(dòng)物的肌纖維的組織。所述肉可以是動(dòng)物肌 肉，例如整個(gè)動(dòng)物肌肉或由動(dòng)物肌肉切成的片。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肉可包含動(dòng)物的內(nèi)部器官，例如心臟、肝臟、腎臟、脾 臟、胸腺和腦。術(shù)語肉包括經(jīng)研磨、切碎或通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法切成小塊的肉。所述肉可源自于任何種類的動(dòng)物，例如來自牛、豬、羊羔、綿羊、山羊、雞、火雞、鴕 鳥、雉雞、鹿、麋鹿、馴鹿、水牛、野牛、羚羊、駱駝、袋鼠；任何種類的魚，例如西鯡、鱈魚、黑線 鱈、金槍魚、海鰻、鮭魚、鯡魚、沙丁魚、鯖魚、竹莢魚、刀魚、圓腹鯡、青鱈、比目魚、鳳尾魚、小 鯡魚(pilchard)、藍(lán)鱈、太平洋藍(lán)牙鱈、鱒、鯰魚、鱸魚、毛鱗魚、槍魚、紅鯛魚、挪威鱈和/或 海鱈；任何種類的貝類，例如蛤、貽貝、扇貝、鳥蛤、濱螺、蝸牛、牡蠣、蝦、龍蝦、海螯蝦、蟹、小 龍蝦、烏賊、魷魚和/或章魚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肉是牛肉、豬肉、肌肉、羊肉和/或火雞肉。脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在某些方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可包含GD&基序 和/或GANDY基序。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的特征是其為具有?；D(zhuǎn)移酶活性并包含氨基酸序 列基序⑶SX的酶，在⑶SX中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、 Ν、Μ 或 S。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用的編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸 序列或脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以獲自于，優(yōu)選獲自于以下一個(gè)或多個(gè)屬的生物氣單胞菌 屬(Aeromonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、乳球菌屬 (Lactococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、彎 ffi ff ^M (Campylobacter) > ^ M (Vibrionaceae) > 7^ ff ^ M (Xylella) > ψι Bf^M (Sulfolobus)、曲霉屬(Aspergillus)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、李斯特菌 屬(Listeria)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、雷爾氏菌屬 (Ralstonia)、黃桿菌屬(Xanthomonas)和假絲酵母屬(Candida)。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn) 移酶可以獲自于，優(yōu)選獲自于氣單孢菌屬的生物。在本發(fā)明的一些方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶 的核苷酸序列編碼在對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 20所示的殺鮭氣單胞菌(Aeromcmas salmonicida) 脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸殘基的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的一些方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶是在10對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 20所示的殺鮭氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列中的N-80位置上 包含天冬氨酸殘基的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移 酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 41,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20所示的任一氨基酸序列，或與上述序列具有 75 %或更高的同一性的氨基酸序列。此外或可選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷 酸序列編碼可包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列，或與其具有75%或更高同一性的氨基 酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列編碼可包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。此外或可選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷 酸序列編碼可包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或與其具有75%或更高同一性的氨基 酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列編碼可包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有 SEQ ID No. 37或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列，或者具有與SEQ ID No. 37或SEQ ID No. 15具有至少75 %的同一性，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少95 %，優(yōu)選至少 98 %的同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶由SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列編碼，或者由與SEQ ID No.沈具有至少75%的同一性，優(yōu)選至 少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少95%，優(yōu)選至少98%的同一性的核苷酸序列編碼。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以編 碼天然的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶或脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是天然的脂質(zhì)酰 基轉(zhuǎn)移酶或脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體。例如，用于本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以是W02004/064537、 W02004/064987、W02005/066347或W02006/008508中所述的一種。這些文獻(xiàn)通過引用并入本文。本文所用的術(shù)語“脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶”優(yōu)選地是指具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶(通常 被歸類為E. C. 2. 3. 1. χ,如2. 3. 1. 43)，其中所述酶能夠?qū)Ⅴ；鶊F(tuán)從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇，如 膽固醇。優(yōu)選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是能夠?qū)Ⅴ；鶊F(tuán) 從磷脂(如本文所定義)轉(zhuǎn)移到固醇(如膽固醇)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。另一方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以并且能夠?qū)??；鶊F(tuán)從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到固醇(如膽固醇)，此外還能夠?qū)Ⅴ；鶊F(tuán)從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到以下的一 種或多種物質(zhì)碳水化合物、蛋白、蛋白亞基、甘油。優(yōu)選地，脂質(zhì)酰基作用的脂質(zhì)底物是以下脂質(zhì)中的一種或多種磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰膽堿和/或磷脂酰乙醇胺。所述脂質(zhì)底物在本文中可以被稱為“脂質(zhì)酰基供體”。本文所用的術(shù)語卵磷脂涵蓋 磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。如上所述，可通過與pFam00657共有序列(SEQ ID No. 1)的比對(duì)和/或與⑶酰 基轉(zhuǎn)移酶，例如SEQ ID No. 28的比對(duì)來鑒定⑶GANDY和HPT區(qū)的存在，從而鑒定適合用 于本發(fā)明方法的其他?；D(zhuǎn)移酶。為了評(píng)估它們用于本發(fā)明的適宜性，即鑒定具有占總酶 活性至少5 %的轉(zhuǎn)移酶活性，更優(yōu)選至少10 %，更優(yōu)選至少20 %，更優(yōu)選至少30 %，更優(yōu)選 至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選 至少90%，更優(yōu)選至少98%的轉(zhuǎn)移酶活性的那些酶，使用上文詳述的“用于測(cè)定酰基轉(zhuǎn)移 酶活性％的方法”測(cè)試此類?；D(zhuǎn)移酶。在一些方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶優(yōu)選為不能或 基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油單酯和/或2-甘油單酯的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。在一些方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選為不表現(xiàn) 出三?；视?triacylglycerol)脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)或不表現(xiàn)出顯著的三酰基甘 油脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。水解甘油三酯的能力(E. C. 3. 1. 1. 3活性)可以根據(jù)Food Chemical Codex (3rd Ed.，1981，pp 492-493)(其中修改為以葵花油，pH 5. 5替代橄欖油，pH 6. 5)測(cè)定的脂肪 酶活性來測(cè)定。脂肪酶活性以LUS (葵花油的脂肪酶單位)來計(jì)量，其中將1 LUS定義為在 以上測(cè)定條件下每分鐘可以從葵花油中釋放1 μ mol脂肪酸的酶量?；蛘?，也可以使用如 W09845453中定義的LUT試驗(yàn)。此文獻(xiàn)通過引用并入本文。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以為基本上不能作用于 甘油三酯的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500，如 小于300，優(yōu)選為小于200，更優(yōu)選為小于100，更優(yōu)選為小于50，更優(yōu)選為小于20，更優(yōu)選為 小于10，如小于5，小于2，更優(yōu)選為小于1 LUS/mg?？蛇x地，LUT/mg活性小于500，如小于 300，優(yōu)選為小于200，更優(yōu)選為小于100，更優(yōu)選為小于50，更優(yōu)選為小于20，更優(yōu)選為小于 10，如小于5，小于2，更優(yōu)選為小于1 LUT/mg。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是基本上不能作用于 甘油單酯的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以在LUS測(cè)定中使用單油酸酯(M7765 1-油酰-rac-甘油99%)以替代葵花油來確定。將IMGHU定義為在所述測(cè)定條件下每分 鐘可以從甘油單酯中釋放1 μ mol脂肪酸的酶量。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是優(yōu)選基本上不能作 用于甘油三酯的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如 小于1000，如小于500，如小于300，優(yōu)選為小于200，更優(yōu)選為小于100，更優(yōu)選為小于50， 更優(yōu)選為小于20，更優(yōu)選為小于10，如小于5，小于2，更優(yōu)選為小于1 MGHU/mg。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是可以表現(xiàn)出一種 或多種以下磷脂酶活性的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶磷脂酶A2活性(E. C. 3. 1. 1. 4)和/或磷脂酶Al 活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶也可以具有磷脂酶B活性(E. C. 3. 1. 1. 5)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的“酰基受體”可以為植物固醇/留烷醇，優(yōu)選為 膽固醇。
優(yōu)選地，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以使用以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表征所述酶具有可以被定義為酯轉(zhuǎn)移活性的?；D(zhuǎn)移酶活性，由此將脂質(zhì)?；w的 原始酯鍵的?；糠洲D(zhuǎn)移到?；荏w以形成新的酯；和所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種L、 A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。GDSX基序由四個(gè)保守的氨基酸構(gòu)成。優(yōu)選地，該基序中的絲氨酸為所述脂質(zhì) 酰基轉(zhuǎn)移酶的催化絲氨酸。適合地，⑶SX基序的絲氨酸的位置可對(duì)應(yīng)于Brumlik和 Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996，Vol. 178，No. 7，ρ 2060-2064)中教導(dǎo)的嗜 水氣單胞菌脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的kr-16。為了測(cè)定蛋白是否具有本發(fā)明的⑶SX基序，優(yōu)選使用W02004/064537或 W02004/064987(均通過引用并入本文)中公開的方法，將序列與pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾可夫 模型譜(hidden markov model profile) (HMM 譜)進(jìn)行比較。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以使用Pfam00657共有序列進(jìn)行比對(duì)(有關(guān)完整 的解釋參見 W02004/064537 或 W02004/064987)。優(yōu)選地，與pfam00657結(jié)構(gòu)域家族的隱馬爾可夫模型譜(HMM譜)的陽性匹配表示 存在本發(fā)明的⑶SL或⑶SX結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，當(dāng)與Pfam00657共有序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，用于本發(fā)明方法和/或應(yīng)用的脂 質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以具有至少一個(gè)，優(yōu)選為多于一個(gè)，更優(yōu)選為多于兩個(gè)的下述區(qū)(block) ⑶區(qū)、GANDY區(qū)、HPT區(qū)。適合地，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以具有⑶區(qū)和GANDY區(qū)。或 者，所述酶可以具有GD&c區(qū)和HPT區(qū)。優(yōu)選地，所述酶至少包含GD&c區(qū)。更多細(xì)節(jié)請(qǐng)參見 W02004/064537 或 W02004/064987。優(yōu)選地，GANDY基序的殘基選自GANDY、GGNDA, GGNDL,最優(yōu)選為GANDY。Pfam00657⑶SX結(jié)構(gòu)域是區(qū)分有此結(jié)構(gòu)域的蛋白和其它酶的獨(dú)特標(biāo)志。圖3中顯示了 pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)。其源自于對(duì)第6版數(shù)據(jù)庫 pfam家族00657 (在本文中也可以稱為pfam00657. 6)的鑒定。所述共有序列可以通過使用較新版pfam數(shù)據(jù)庫來升級(jí)(如參見W02004/064537 或 W02004/064987)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是可以 使用以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表征的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(i)所述酶具有可以被定義作酯轉(zhuǎn)移活性的?；D(zhuǎn)移酶活性，由此將脂質(zhì)?；?體的原始酯鍵的?；糠洲D(zhuǎn)移到酰基受體以形成新的酯；(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多 種丄、八、￥、1、卩、丫、!1、0、1\1]\1或3;(iii)所述酶包含His-309或在圖2和4(SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3)中所示的 嗜水氣單胞菌脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶中對(duì)應(yīng)于His-309的位置上包含組氨酸殘基。優(yōu)選地，所述⑶SX基序的氨基酸殘基為L(zhǎng)。在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1中，起始的18個(gè)氨基酸殘基形成信號(hào)序列。全長(zhǎng) 序列(即包含信號(hào)序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信號(hào)序列的 序列)中的His491。
在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶為包含 以下催化三聯(lián)體的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶Ser-34、Asp-306和His_309，或在對(duì)應(yīng)于圖4 (SEQ ID No. 3)或圖2(SEQ ID No. 1)中所示嗜水氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中的kr-34、Asp-306和 His-309的位置上分別包含絲氨酸殘基、天冬氨酸殘基和組氨酸殘基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No. 1所示的序列中，起始的18個(gè)氨基酸殘基形成信號(hào)序列。全長(zhǎng)序列(即 包含信號(hào)序列的蛋白)中的％r-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信 號(hào)序列的序列)中的kr-16、Asp-288和Hisj91。在圖3(SEQ ID No. 2)所示的pfam00657 共有序列中，活性位點(diǎn)殘基相應(yīng)于Ser-7、Asp-345和His-348。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是可以 使用以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表征的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶所述酶具有可以被定義作酯轉(zhuǎn)移活性的酰基轉(zhuǎn)移酶活性，由此將第一脂質(zhì)?；?體的原始酯鍵的酰基部分轉(zhuǎn)移到?；荏w以形成新的酯；和所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134 和 His-309，或在對(duì)應(yīng)于 SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示嗜水氣單胞菌脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶中的Gly-32、Asp-33、Ser_34、 Asp-306和His-309的位置上分別包含甘氨酸殘基、天冬氨酸殘基、絲氨酸殘基、天冬氨酸 殘基和組氨酸殘基。合適地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn) 移酶活性的多肽，其中所述多肽是通過表達(dá)SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 25、 SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 5USEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、 SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 31、 SEQ ID No. 52,SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35或SEQ ID No. 36 所示的任一核苷酸序列，或與上述序列具有75%或更高的同一性的核苷酸序列而獲得的。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以由以下核苷酸序列中之-一編碼a) SEQIDNo.21所示的核苷酉堯序列(參見圖21)b)SEQIDNo.47所示的核苷酉堯序列(參見圖60)c) SEQIDNo.25所示的核苷酉堯序列(參見圖25 ；d) SEQIDNo.48所示的核苷酉堯序列(參見圖50)e)SEQIDNo.50所示的核苷酉堯序列(參見圖63)f) SEQIDNo.51所示的核苷酉堯序列(參見圖64)g) SEQIDNo.26所示的核苷酉堯序列(參見圖39)h) SEQIDNo.27所示的核苷酉堯序列(參見圖40)i)SEQIDNo.28所示的核苷酉堯序列(參見圖41)j) SEQIDNo.38所示的核苷酉堯序列(參見圖51)k) SEQIDNo.39所示的核苷酉堯序列(參見圖52)1)SEQIDNo.40所示的核苷酉堯序列(參見圖53)m) SEQIDNo.29所示的核苷酉堯序列(參見圖42)η) SEQIDNo.30所示的核苷酉堯序列(參見圖43)ο) SEQIDNo.31所示的核苷酉堯序列(參見圖44)14
(p)SEQ ID No. 52所示的核苷酸序列(參見圖65)；(q) SEQ ID No. 32所示的核苷酸序列(參見圖45)；(r)SEQ ID No. 33所示的核苷酸序列(參見圖46)；(s)SEQ ID No. 34所示的核苷酸序列(參見圖47)；(t) SEQ ID No. 35所示的核苷酸序列(參見圖48)；(u)SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列(參見圖49)；(ν)或與SEQID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 47,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51 或 SEQ ID No. 52 中所示的任一序列具有 70%或更 高，優(yōu)選為75%或更高同一性的核苷酸序列；或(χ)通過遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與 SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51 或 SEQ ID No. 52 所 示的任一序列相關(guān)的核酸。適合地，所述核苷酸序列可以與SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ IDNo. 51 或 SEQ ID No. 52 中所 示的任一序列具有80%或更高，優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，更優(yōu)選為95% 或更高同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的 核苷酸序列為與 SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36中所示的任一序列具有70%或更高，優(yōu)選為75%或更高同一性的核苷酸序列。適合 地，所述核苷酸序列可以與 SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. ；35 和 SEQ ID No. 36中所示的任一序列具有80%或更高，優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更 高，更優(yōu)選為95%或更高同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的 核苷酸序列為與SEQ ID No.沈中所示的序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，優(yōu) 選為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，更優(yōu)選為95%或更高同一性的核苷酸序列。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以為包含一個(gè)或 多個(gè)以下氨基酸序列的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(i)SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列；(ii)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；(iii)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列；(iv) SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列；(V)SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列；15
(vi)SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列；(vii)SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列；(viii)SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列；(ix) SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列；(X)SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列；(xi)SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列；(xii)SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列；(XV)SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No. 18所示的氨基酸序列；(xvii)SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列；(xviii)SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列；(xix)SEQ ID No. 21所示的氨基酸序列；(XX)SEQ ID No. 22所示的氨基酸序列；(xxi)SEQ ID No. 23所示的氨基酸序列；(xxii)SEQ ID No. M所示的氨基酸序列；(xxiii)SEQ ID No. 41所示的氨基酸序列；(xxiv)或與SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24 或 SEQ ID No. 41 中所 示的任一序列具有75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是包含如SEQ ID No. 37 或 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 或SEQ ID No. 19或SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列，或包含與SEQ ID No. 37所示的氨 基酸序列或SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，或SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 15所示的氨基 酸序列或SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列具有75%或 更高，優(yōu)選為80%或更高，優(yōu)選為85%或更高，優(yōu)選為90%或更高，優(yōu)選為95%或更高同一 性的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是包含與SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13,SEQ ID No. USEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 19 或 SEQ ID No. 20 中所示 的任一序列具有80%或更高，優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，更優(yōu)選為95%或 更高的同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是包含一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基1-100所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基101-200所示的氨基酸序列；(c) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基201-300所示的氨基酸序列；或(d)與以上(a)至(C)中所定義的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高，優(yōu)選 為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，更優(yōu)選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發(fā)明方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以包含一個(gè)或多個(gè)以 下氨基酸序列(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基觀_39所示的氨基酸序列；(b) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基77_88所示的氨基酸序列；(c)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基1沈_136所示的氨基酸序列；(d)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基163-175所示的氨基酸序列；(e) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基304-311所示的氨基酸序列；或(f)以上(a)至(e)中所定義的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高，優(yōu)選為 85%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，更優(yōu)選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。一方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是如EP 1 275 711中教導(dǎo)的來自于近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的脂質(zhì) ?；D(zhuǎn)移酶。因此，一方面，用于本發(fā)明方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以為包含SEQ ID No. 42教導(dǎo)的氨基酸序列的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是這樣的脂質(zhì)酰基 轉(zhuǎn)移酶，其可以為包含SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移 酶，或者包含與SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有75%或更高，優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu) 選為90%或更高，更優(yōu)選為95%或更高，更優(yōu)選為98%或更高，或更優(yōu)選為99%或更高的 同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。該酶可以認(rèn)為是酶的變體。一方面，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是可以為卵磷脂: 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)或其變體(如由分子進(jìn)化產(chǎn)生的變體)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合的LCAT為本領(lǐng)域已知的，且可以獲自于一種或多種如下的生物，如哺 乳動(dòng)物、大鼠、小鼠、雞、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、植物(包括擬南芥 (Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、線蟲、真菌和酵母。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是這樣 的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，其可以是可獲自于，優(yōu)選獲自于含有pPetUaAhydro和pPetUaAMlmo 的大腸桿菌株TOP 10的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，其中所述大腸桿菌株TOP 10由Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K，Denmark根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微 生物保藏布達(dá)佩斯條約保藏在 National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB，保藏日為 2003 年 12 月 22日，保藏號(hào)分別為NCIMB 41204和NCIMB 41205。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是磷脂甘油?；D(zhuǎn)移 酶。磷脂甘油?；D(zhuǎn)移酶包括分離自氣單孢菌，優(yōu)選為嗜水氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌，最優(yōu) 選為殺鮭氣單胞菌或其變體的磷脂甘油酰基轉(zhuǎn)移酶。
用于本發(fā)明的最優(yōu)選脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶由SEQ ID No. 1、3、4、14、19和20編碼。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，優(yōu)選?；D(zhuǎn)移酶的信號(hào)肽在轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)過程中已被切割掉。SEQ ID No. 1、3、4和14的信號(hào)肽為氨基酸1-18。因此，最優(yōu)選的區(qū)域?yàn)镾EQ ID No. 1和SEQ ID No. 3 (嗜水氣單胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 14 (殺鮭氣單胞 菌)中的氨基酸19-336。當(dāng)用于測(cè)定氨基酸序列同一性的同源性時(shí)，優(yōu)選使用成熟序列進(jìn) 行本文所述的比對(duì)。因此，確定同源性(同一性)的最優(yōu)選區(qū)域?yàn)镾EQ ID No. 1和3 (嗜水氣單胞菌) 中的氨基酸19-335，和SEQ ID No. 4和14 (殺鮭氣單胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID No. 19和20是來分別來自嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的成熟蛋白序 列，其可以經(jīng)歷或可以未經(jīng)歷翻譯后修飾。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是還可分離自喜熱裂 孢菌(Thermobifida)，優(yōu)選為褐色喜熱裂孢菌(T. fusca)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，最優(yōu)選為由 SEQ ID No. 43編碼的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合本發(fā)明應(yīng)用和/或本發(fā)明方法的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以包含以下任一氨基酸 序列和/或由以下核苷酸序列編碼a)核酸，其編碼表現(xiàn)出脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性和與SEQ ID No. 15所示的多肽序列或 與SEQ ID No. 37所示的多肽序列具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至 少90%同一性)的多肽；b)(分離的)多肽，其包含SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列(或 由SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列組成)，或包含與SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性)的氨基 酸序列(或由與SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同 一性，更優(yōu)選至少90%同一性)的氨基酸序列組成)；；c)編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核酸，所述核酸包含SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列 (或由SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列組成)，或包含與SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列 具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性)的核苷酸序列(或 由與SEQ ID No. 26所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu) 選至少90%同一性)的核苷酸序列組成)；d)核酸，所述核酸在中等或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID No.沈所示核苷酸序列的 核酸探針雜交，且編碼表現(xiàn)出脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽；e)核酸，其是a)、C)或d)所述核酸序列的片段；或f)多肽，其是b)所述多肽的片段。用于本發(fā)明任一方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是還可分離自鏈霉菌屬，優(yōu) 選為阿維鏈霉菌(S.avermitis)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，最優(yōu)選是由SEQ ID No. 32編碼的脂質(zhì) ?；D(zhuǎn)移酶。用于本發(fā)明的來自鏈霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.5、6、9、10、ll、 12、13、31、33和41編碼的那些酶。用于本發(fā)明的酶也可以分離自棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，優(yōu)選為 C. efficiens，最優(yōu)選由 SEQ ID No. 18 編碼。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是包含SEQ IDNo. 22、23、M、48、44、50或53所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、 85^^90%,95^^96^^97%或98%同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，或可以由SEQ ID No. 36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所編碼，或由與其具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可 以是包含SEQ ID No. 22、23、24、43、45、49或53所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移 酶，或由SEQ ID No.25、47、48、50或51所示的任一核苷酸序列所編碼，或由與其具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所編碼。在另一實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是 包含SEQ ID No. 23、M、45、49或53所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，以用于 本發(fā)明所述的應(yīng)用。
在另一實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是 包含SEQ ID No. 23、45或53所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、 85% ,90^^95% ,96^^97%或98%同一性的氨基酸序列脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，以用于本發(fā)明所 述的應(yīng)用。更優(yōu)選地，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn) 移酶可以是包含SEQ ID似.45所示的氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是可獲自于，優(yōu)選獲自 于鏈霉菌株L130或L131的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，所述鏈霉菌株L130或L131由Danisco A/ S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K, Denmark 根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微 生物保藏布達(dá)佩斯條約保藏在 National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street Aberdeen Scotland，GB，保藏日為 2004 年 6 月 25 日，保藏號(hào)分別為NCIMB 412 和NCMB 41227。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是可使用 Align X(使用默認(rèn)設(shè)置的VectorNTI的Clustal W成對(duì)比對(duì)算法)通過與L131 (SEQ ID No. 22)序列的比對(duì)而鑒定的氨基酸序列。L131與來自阿維鏈霉菌(S. avermitilis)和褐色喜熱裂孢菌的同源物的比對(duì)說 明了 GD&基序(L131以及阿維鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌中為GDSY) ,GANDY框(其為GGNDA 或GGNDL)和HPT區(qū)(被認(rèn)為是保守的催化組氨酸)的保守性。這三個(gè)保守區(qū)突出標(biāo)記在 圖26中。與pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公開的L131 序列(SEQ ID No. 22)比對(duì)時(shí)，可以鑒定出三個(gè)保守區(qū)，GDSx區(qū)、GANDY區(qū)和HTP區(qū)(更多細(xì) 節(jié)請(qǐng)參見 W004/064987)。與pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公開的L131 序列(SEQ ID No. 22)比對(duì)時(shí)，i)用于本發(fā)明任一方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是具有GD&c基序，更優(yōu)選為選自GDSL或GDSY基序的GD&c基序的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；和/或ii)用于本發(fā)明任一方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是具有GANDY區(qū)，更優(yōu) 選包含氨基GGNDx (更優(yōu)選為GGNDA或GGNDL)的GANDY區(qū)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶；和/或iii)用于本發(fā)明任一方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是優(yōu)選具有HTP區(qū)的 脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；和優(yōu)選地，iv)用于本發(fā)明任一方法和應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是優(yōu)選具有GD&c或 ⑶SY基序，和包含氨基GGNDx (優(yōu)選為GGNDA或GGNDL)的GANDY區(qū)，和HTP區(qū)(保守的組氨 酸)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶可優(yōu)選不是磷脂酶，如被歸類為E. C. 3. 1. 1. 32的 磷脂酶Al或被歸類為E. C. 3. 1. 1. 4的磷脂酶A2。優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是使用本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶使基于肉的食品中的膽固醇 減少。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是降低基于肉的食品中的膽固醇，同時(shí)保持和/或改進(jìn)一個(gè) 或多個(gè)以下特征脂肪穩(wěn)定性，從而使脂肪損失最小化并減少基于肉的食品中的可見脂肪； 風(fēng)味、質(zhì)地、重量損失和外觀。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)具有改進(jìn)的脂肪穩(wěn)定性(即減少可見脂肪和/或減少 油脂性和/或減少熱加工期間的脂肪分離)和/或改進(jìn)的質(zhì)地和/或減少的重量損失的基 于肉的食品。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述方法使肉和/或基于肉的食品中的腐敗菌、病原菌和 真菌在加工期間的增殖減少或保持在最低水平。本發(fā)明(例如使用具有大量脂肪含量，例如精膏香腸和肉醬)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提 高了脂肪穩(wěn)定性，從而使脂肪損失最小化并減少可見脂肪的量。此外，可保持低的肉汁損失 和/或可接受的風(fēng)味、質(zhì)地和/或外觀。脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶將磷脂和/或甘油三酯和/或半乳糖脂的sn-2酯鍵轉(zhuǎn)移到?；?受體，例如膽固醇，從而分別形成溶血磷脂和/或甘油單酯和/或甘油二酯和/或溶血半乳 糖酯，和膽固醇酯(圖67以磷脂酶為例證明了這一點(diǎn))。轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致釋放出疏水性更小且 因此水溶性更高的溶血磷脂(底物為磷脂時(shí))，該溶血磷脂由于在水相中的更高的單聚體 濃度，因此具有更高的動(dòng)態(tài)表面活性。
除了其乳化性質(zhì)之外，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶還能通過產(chǎn)生膽固醇酯降低肉中的膽固醇 水平(即使用膽固醇作為?；荏w，由此形成膽固醇酯并減少“游離”膽固醇的量)。在肉 產(chǎn)品的制備和長(zhǎng)期貯存期間，多不飽和脂肪酸和膽固醇可發(fā)生氧化。這種氧化產(chǎn)生大量化 合物(氫過氧化物、醛、酮、膽固醇氧化物，例如氧化固醇等)，其中一些化合物被視為具有 誘變禾口致癌作用，禾口細(xì)胞毒性(Jim6nez-Colmenero et al2001 Wealthier meat and meat products :their role as functional foods. Meat science 59, 5-13)。因此，降低膽固酉享 是有利的，這是因?yàn)槠錆撛诘亟档土擞赡懝檀佳趸纬傻臐撛谟泻衔铩４送?，由于?述基于肉的食品可構(gòu)成健康飲食中經(jīng)常推薦的低膽固醇產(chǎn)品，可將其作為飲食的一部分使 用以減少膽固醇。20
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其產(chǎn)生具有改進(jìn)(提高)的熱穩(wěn)定性的肉或基于肉的食品。宿主細(xì)胞可在宿主細(xì)胞或生物內(nèi)重組生產(chǎn)用于本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。所述宿主生物可以是原核或真核生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如 在細(xì)菌細(xì)胞中，例如在芽孢桿菌，例如在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)宿主細(xì) 胞中表達(dá)?？蛇x的宿主細(xì)胞例如是真菌、酵母或植物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與其它生物如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢 桿菌宿主細(xì)胞可使脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)增加。已經(jīng)將來自于殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶插入 到多個(gè)常規(guī)表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體經(jīng)設(shè)計(jì)分別最適宜在枯草芽孢桿菌、多型漢遜酵 母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)禾口塔賓曲霉 (Aspergillus tubigensis)中表達(dá)。然而，在多型漢遜酵母、粟酒裂殖酵母和塔賓曲霉中僅 檢測(cè)到極低的水平。這些表達(dá)水平低于1 μ g/ml,因此不可能選擇出產(chǎn)生足量蛋白以起始商 業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞(結(jié)果未顯示)。相反，地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生對(duì)商業(yè)可行的生產(chǎn)具有吸引力 的蛋白水平。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌中的表達(dá)比在aprE啟動(dòng)子控制下的枯草 芽孢桿菌表達(dá)高約100倍，或比在A4啟動(dòng)子控制下并與纖維素融合時(shí)變鉛青鏈霉菌 (S. Iividans)中的表達(dá)高約100倍(結(jié)果未顯示在本文中)。所述宿主細(xì)胞可以為除枯草芽孢桿菌之外的任何芽孢桿菌細(xì)胞。優(yōu)選 地，所述芽孢桿菌宿主細(xì)胞可以是以下物種中的一種地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢 桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、環(huán)狀芽孢桿 菌(B. circulans)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、 堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B. firmus)、燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)、緩慢芽孢桿菌(B. Ientus)、 巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、短小芽孢桿菌(B. pumilus)或嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophilus)0本發(fā)明涉及的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括具有以下特征的任何細(xì)胞包含本文所定義的 編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列或本文所定義的表達(dá)載體，且用于重組制備具有如本文 所定義的特異性質(zhì)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，所述宿主細(xì)胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶陰性細(xì)胞株(protease minus strain)和/或α -淀粉酶缺陷或α-淀粉酶陰性細(xì)胞株(α-amylase minus strain)。本文所用的術(shù)語“異源”是指源自分離的遺傳資源或物種的序列。異源序列是非 宿主序列、修飾的序列、來自不同宿主細(xì)胞株的序列、或來自宿主細(xì)胞的不同染色體位置的 同源序列。“同源”序列是指在相同遺傳資源或物種中發(fā)現(xiàn)的序列，即其天然存在于宿主細(xì)胞 的相關(guān)物種中。本文所用的術(shù)語“重組脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶”是指已經(jīng)通過遺傳重組的方式制備的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。例如，將編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列插入克隆載體，得到以存在異源 脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶為特征的地衣芽孢桿菌細(xì)胞。調(diào)控序列在一些應(yīng)用中，可通過如下獲得用于本發(fā)明方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶 序列將其核苷酸編碼序列可操作地連接到能夠通過例如所選宿主細(xì)胞(如地衣芽孢桿菌 細(xì)胞)提供核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列。例如，可以使用包含可操作地連接到此調(diào)控序列的本發(fā)明核苷酸序列的載體，即 所述載體是表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述組件的關(guān)系允許 它們能以其希望的方式發(fā)揮功能?！翱刹僮鞯剡B接”到編碼序列的調(diào)控序列的連接方式使其 能在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)。所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”為本領(lǐng)域的一般含義，如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。也可以通過選擇調(diào)控區(qū)(如啟動(dòng)子、分泌引導(dǎo)子和終止子區(qū))來實(shí)現(xiàn)編碼具有如 本文所定義的特定性質(zhì)的酶的核苷酸序列的增強(qiáng)表達(dá)，其中所述終止子區(qū)本質(zhì)上不是編碼 所述酶的核苷酸序列的調(diào)控區(qū)。適合地，可以將本發(fā)明的核苷酸序列至少可操作地連接到啟動(dòng)子。適合地，編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以可操作地連接編碼終止子序列的 核苷酸序列。用于本發(fā)明載體、宿主細(xì)胞、方法和/或應(yīng)用中任一項(xiàng)的適合的終止子序列的 實(shí)例包括α -淀粉酶終止子序列(例如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTT GTTCATAAA-SEQ ID No. 57)、堿性蛋白酶終止子序列(例如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTT TGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No. 58)、谷氨酸特異性終止子序列(例如，A CGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT-SEQ ID No. 59)、果 聚糖酶終止子序列(例如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT -SEQ ID No. 60)和枯草桿菌蛋白酶 E 終止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAG GAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG-SEQ ID No. 61)。適合地，可以將編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可操作地連接到α -淀粉酶終 止子，如地衣芽孢桿菌α-淀粉酶終止子。啟動(dòng)子根據(jù)本發(fā)明所用的啟動(dòng)子序列可以與編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的序列異源或同源。所述啟動(dòng)子序列可以是能夠指導(dǎo)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何 啟動(dòng)子序列。適合地，所述啟動(dòng)子序列可以與芽孢桿菌(如地衣芽孢桿菌)同源。優(yōu)選地，所述 啟動(dòng)子序列與所選宿主細(xì)胞同源。適合地，所述啟動(dòng)子序列可以與宿主細(xì)胞同源?！芭c宿主細(xì)胞同源”是指來源于宿 主生物內(nèi)；即，在宿主生物中自然發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子序列。適合地，所述啟動(dòng)子序列可以選自由編碼以下啟動(dòng)子的核苷酸序列組成的組 α-淀粉酶啟動(dòng)子、蛋白酶啟動(dòng)子、枯草桿菌蛋白酶啟動(dòng)子、谷氨酸特異性蛋白酶啟動(dòng)子和 果聚糖蔗糖酶啟動(dòng)子。
適合地，所述啟動(dòng)子序列可以是編碼以下啟動(dòng)子的核苷酸序列LAT(如，來自地 衣芽孢桿菌的α -淀粉酶啟動(dòng)子，也稱作AmyL)、AprL (如，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg啟動(dòng) 子),EndoGluC (如，來自地衣芽孢桿菌的谷氨酸特異性啟動(dòng)子)、AmyQ (如，來自解淀粉芽孢 桿菌α-淀粉酶啟動(dòng)子的α-淀粉酶啟動(dòng)子)和&icB(如，枯草芽孢桿菌的果聚糖蔗糖酶 啟動(dòng)子)。適合在本發(fā)明方法中指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括緩慢芽孢桿菌 堿性蛋白酶基因(aprH)的啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyE)的啟動(dòng)子、嗜熱 脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)的 啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子、和/或蘇云金芽胞桿菌擬步行甲亞種 (Bacillus thuringiensis subsp· tenebrionis)CryIIIA 基因的啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子序列為α-淀粉酶啟動(dòng)子(如地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶啟動(dòng)子)。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子序列包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶啟動(dòng)子的-35 至"10序列(參見圖53和圖55)。所述“_35至-10序列”描述的是相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置。“-35”和“-10”均 為框，即多個(gè)核苷酸，各包含6個(gè)核苷酸，且這些框被17個(gè)核苷酸分開。這17個(gè)核苷酸通 常被稱為“間隔子”。圖55對(duì)此進(jìn)行了說明，其中-35框和-10框被加下劃線。為了避免混 淆，本文所用的“_35至-10序列”是指從-35框的起點(diǎn)至-10框的終點(diǎn)的序列，即包括-35 框、長(zhǎng)度為17個(gè)核苷酸的間隔子和-10框。信號(hào)月太根據(jù)所用的序列和/或載體，通過由宿主細(xì)胞表達(dá)編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸 序列所產(chǎn)生的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以被分泌出或包含在細(xì)胞內(nèi)。信號(hào)序列可以用于指導(dǎo)編碼序列分泌通過特定的細(xì)胞膜。所述信號(hào)序列對(duì)脂質(zhì)酰 基轉(zhuǎn)移酶編碼序列來說可以是天然的或外源的。例如，所述信號(hào)肽編碼序列可以是從芽孢 桿菌，優(yōu)選從地衣芽孢桿菌獲得的淀粉酶或蛋白酶基因?？梢杂梢环N或多種以下基因獲得適合的信號(hào)肽編碼序列麥芽糖α-淀粉酶基 因、枯草桿菌蛋白酶基因、內(nèi)酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、PrsA基因和/或酰基轉(zhuǎn)移酶 基因。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的信號(hào)肽、氣單孢菌?；D(zhuǎn)移酶 的信號(hào)肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No. Μ)、枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號(hào) 肽(如，mrskklwi si If alt liftmafsnmsaqa-SEQ ID No. 55)或地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白 酶的信號(hào)肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No. 56)。適合地，所述信號(hào)肽 可以為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的信號(hào)肽。然而，可以使用能夠指導(dǎo)所表達(dá)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)入所選芽孢桿菌宿主細(xì)胞 (優(yōu)選為地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞)分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可以將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接到編 碼所選脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。所選脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以在本文所定義的宿主細(xì)胞中作為融合蛋白表達(dá)。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”是指能夠在體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。
優(yōu)選地，所述表達(dá)載體被引入到生物(如地衣芽孢桿菌宿主)的基因組中。術(shù)語 “引入”優(yōu)選涵蓋穩(wěn)定的引入到基因組中。如本文所定義的編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以存在于載體中，在該載體 中所述核苷酸序列可操作地連接到調(diào)控序列，使得所述調(diào)控序列能夠通過適合的宿主生物 (如地衣芽孢桿菌)表達(dá)所述核苷酸序列，即所述載體是表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可以被轉(zhuǎn)化到上述的適合宿主細(xì)胞中，以表達(dá)具有如本文所定義的 脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。通常根據(jù)其將被引入的宿主細(xì)胞來選擇載體，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載 體、基因組插入物。本發(fā)明可以涵蓋發(fā)揮等同功能且本領(lǐng)域已知或可知的其它形式的表達(dá) 載體。一旦轉(zhuǎn)化到所選擇的宿主細(xì)胞中，載體可以不依賴宿主細(xì)胞的基因組而復(fù)制并發(fā) 揮功能，或可以自行整合進(jìn)入基因組。所述載體可以包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四環(huán)素抗性的基因?；蛘撸部梢酝ㄟ^共 轉(zhuǎn)化完成選擇(如W091/17243中所述)。載體可以在體外使用，例如，用于制備RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。所述載體可以進(jìn)一步包含能使該載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。所述 序列的實(shí)例為質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核 苷酸序列或脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體或者是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體?？墒褂脤?duì)磷脂活性提高，例如對(duì)磷脂的轉(zhuǎn)移酶活性提高的變體。W02005/066347 (其通過引用并入本文)教導(dǎo)了用于改進(jìn)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶以產(chǎn)生 脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶變體的適合方法。一個(gè)優(yōu)選的修飾是N80D。特別地，當(dāng)使用序列SEQ ID No. 20作為骨架時(shí)更是如 此。因此，參考序列可以為SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37。所述修飾可以與一個(gè)或多個(gè)其 它修飾組合。如上指出，當(dāng)在本文中提及具體氨基酸殘基時(shí)，其編號(hào)是通過變體序列與SEQ ID No. 19或SEQ ID No. 20所示的參考序列的比對(duì)獲得的。優(yōu)選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列 可以編碼包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂質(zhì)， 或包含與SEQ ID No. 16或SEQ ID No. 68具有70%或更高、75%或更高，優(yōu)選為85%或更 高，更優(yōu)選為90 %或更高，更優(yōu)選為95 %或更高，更優(yōu)選為98 %或更高，或更優(yōu)選為99 %或 更高同一性的氨基酸序列的脂質(zhì)。該酶可以認(rèn)為是酶變體。定義本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移酶”可以與術(shù)語“脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶”互換。適合地，本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶催化以下一種或多種反應(yīng)酯交換、酯基轉(zhuǎn) 移、醇解、水解。術(shù)語“酯交換”表示?；鶊F(tuán)在脂質(zhì)供體和脂質(zhì)受體之間的酶催化轉(zhuǎn)移，其中所述24脂質(zhì)供體不是游離的?；鶊F(tuán)。本文使用的術(shù)語“酯基轉(zhuǎn)移”表示?；鶊F(tuán)從脂質(zhì)供體(除游離脂肪酸外)向酰 基受體(除水外)的酶催化轉(zhuǎn)移。用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是 優(yōu)選在脂質(zhì)(優(yōu)選磷脂)和固醇(優(yōu)選膽固醇)之間進(jìn)行酯交換反應(yīng)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。本文使用的術(shù)語“醇解”表示通過與醇ROH的反應(yīng)對(duì)酸衍生物的共價(jià)鍵的酶切割， 從而使一個(gè)產(chǎn)物與醇的H結(jié)合，另一個(gè)產(chǎn)物與醇的OR基團(tuán)結(jié)合。本文使用的術(shù)語“水解”表示酰基基團(tuán)從脂質(zhì)向水分子的OH基團(tuán)的酶催化轉(zhuǎn)移。與其他酶的組合在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶與具有一種或多種以下酶活性的 脂肪酶組合使用甘油脂酶活性(E.C. 3. 1.1. 26)、磷脂酶A2活性(E. C. 3.1.1.4)或磷脂 酶Al活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。適合地，脂肪酶是本領(lǐng)域熟知的，舉例而言，包括下列用舉例 方式說明的脂肪酶磷脂酶Al LECITASE ULTRA(Novozymes A/S，丹麥)、磷脂酶A2 (例如 來自 Biocatalysts 的 LIP0M0D 22L 的磷酯酶 A2，來自 Genecor 的 LIP0MAX 和 LysoMax PLA2 )、LIPOLASE (Novozymes A/S,丹麥)。在一些實(shí)施方式中，組合使用脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶和磷脂酶(例如磷脂酶Al、磷脂酶 A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)也可能是有益的。所述組合使用可以依次或同時(shí)進(jìn)行，例如脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶處理可以在所述額外酶 處理前或者處理過程中進(jìn)行?；蛘撸鲱~外酶處理也可以在脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理之前或處理過程中進(jìn)行。在依次酶處理的情況下，在一些實(shí)施方式中，在利用第二個(gè)(和/或第三個(gè)等)酶 處理前，例如通過失活或者通過使用固定化酶除去所使用的第一個(gè)酶可能是有利的。轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾適合地，本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以由本文公開的任一個(gè)核苷酸序列編碼。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后和/或翻譯后修飾。設(shè)想用于本發(fā)明方 法和/或應(yīng)用的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶包括已經(jīng)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后和/或翻譯后修飾的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移 酶。僅作為舉例而言，本文SEQ ID No. 26 (參見圖39)所示的核苷酸序列在宿主細(xì) 胞(例如地衣芽孢桿菌)中的表達(dá)引起轉(zhuǎn)錄后和/或翻譯后修飾，從而產(chǎn)生本文SEQ ID No. 37 (參見圖50)所示的氨基酸序列。SEQ ID No. 37 與 SEQ ID No. 15 (本文圖 1 所示)相同，只是 SEQ ID No. 37 已經(jīng)歷 了翻譯后和/或轉(zhuǎn)錄后修飾從而除去了 38個(gè)氨基酸。分離的一方面，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是回收的/分離的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。因此，所制備的 脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以是分離的形式。另一方面，用于本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以是分離的形式。術(shù)語“分離的(或分離)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一種其它成分，這 些成分原本與所述序列或蛋白天然結(jié)合，并且原本在一起發(fā)現(xiàn)。純化的一方面，所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶可以是純化的形式。
另一方面，用于本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以是純化的形式。術(shù)語“純化的”是指序列處于相對(duì)純的狀態(tài)，如至少約51%純，或至少約75%純， 或至少約80%純，或至少約90%純，或至少約95%純，或至少約98%純?？寺【幋a本發(fā)明多肽的核苷酸序列編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì)的多肽或適合修飾的多肽的核苷酸序列可以 從產(chǎn)生所述多肽的任何細(xì)胞或生物中分離得到。用于分離核苷酸序列的各種方法都是本領(lǐng) 域熟知的。例如，可以使用產(chǎn)生所述多肽的生物的染色體DNA或信使RNA來構(gòu)建基因組DNA 和/或cDNA文庫。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針， 并將其用于從由該生物制備的基因組文庫中鑒定編碼多肽的克隆?；蛘?，也可以使用包含 與另一已知多肽基因同源的序列的經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸探針來鑒定編碼多肽的克隆。在后一種 情況下，使用嚴(yán)謹(jǐn)性較低的雜交和清洗條件。或者，可以通過如下方式鑒定編碼多肽的克隆將基因組DNA的片段插入到表達(dá) 載體(如質(zhì)粒)中，使用所得的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶為陰性的細(xì)菌，并隨后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌 涂布在包含被所述多肽抑制的酶的瓊脂上，由此可以鑒定出表達(dá)所述多肽的克隆。再者，也可以通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過合成來制備編碼所述多肽的核苷酸序列， 如 Beucage S. L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22，ρ 1859-1869 描述的亞磷酰胺法， 或Matthes et al (1984) EMBO J. 3, ρ 801-805描述的方法。在亞磷酰胺法中，在如自動(dòng)DNA 合成儀上合成寡核苷酸，然后將其純化、退火、連接并克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。所述核苷酸序列可以是源自混合的基因組和合成來源、混合的合成和cDNA來源、 或混合的基因組和cDNA來源，其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接源自合成的、基因組的或cDNA的片 段(根據(jù)需要)而制得。每個(gè)連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的不同部分。所述DNA序 列也可以使用特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來制備，如US 4，683，202或Miki R K et al (Science (1988) 239，pp 487-491)中所述。核苷酸序列本發(fā)明還涵蓋編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列。本文所用 的術(shù)語“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其變體、同源物、片段和衍生物 (如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因組或合成物或重組物，其可以是雙鏈的或單 鏈的(無論其代表正義鏈還是反義鏈)。本發(fā)明的術(shù)語“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。優(yōu)選地， 其指DNA，更優(yōu)選為編碼序列的cDNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列本 身不涵蓋在其天然環(huán)境中存在的天然核苷酸序列，此時(shí)該序列與同處于其天然環(huán)境中其天 然結(jié)合序列相連接。為了便于參考，我們將此優(yōu)選實(shí)施方式稱為“非天然核苷酸序列”。由 此，術(shù)語“天然核苷酸序列”是指與處于其天然環(huán)境中并與其天然結(jié)合的完整啟動(dòng)子(同處 于其天然環(huán)境中)可操作地連接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然 生物中表達(dá)本發(fā)明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中與其天然結(jié)合的啟動(dòng) 子的控制。優(yōu)選地，所述多肽不是天然多肽。由此，術(shù)語“天然多肽”是指處于其天然環(huán)境中并已經(jīng)由其天然核苷酸序列表達(dá)的完整多肽。通常，使用重組DNA技術(shù)(即重組的DNA)制備編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì) 的多肽的核苷酸序列。然而，在本發(fā)明的另一個(gè)可選實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域已知的 化學(xué)方法來合成全部或部分核苷酸序列(參見Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225—232)。分子進(jìn)化分離出編碼酶的核苷酸序列或鑒定出編碼假定酶的核苷酸序列后，可能需要對(duì)所 選擇的核苷酸序列進(jìn)行修飾，例如可能需要對(duì)所述序列進(jìn)行突變以制備本發(fā)明的酶?？梢允褂煤铣傻墓押塑账醽硪胪蛔?。這些寡核苷酸包含目標(biāo)突變位點(diǎn)側(cè)翼的核 苷酸序列。Morinaga et al.，(Biotechnology (1984) 2，p646_649)中公開了 適合的方法。 Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, ρ 147-151)中描述了向編碼酶的 核苷酸序列中弓丨入突變的另一種方法。除了如上文所述的定點(diǎn)誘變，可以隨機(jī)引入突變，如使用商品試劑盒，如來自 Stratagene的GeneMorph PCR誘變?cè)噭┖校騺碜訡lontech的DiversifyPCR隨機(jī)誘變?cè)?劑盒。EP O 583 265提到基于PCR的誘變的優(yōu)化方法，其也可以結(jié)合使用DNA突變類似物， 如EP O 866 796中所述的那些。易錯(cuò)PCR技術(shù)也適用于制備具有優(yōu)選性質(zhì)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn) 移酶變體。W00206457提到了脂肪酶的分子進(jìn)化。獲得新型序列的第三種方法是使用任何數(shù)量的限制性酶或如Dnase I的酶將不 同的核苷酸序列片段化，并重新組裝成編碼功能性蛋白的全長(zhǎng)核苷酸序列?；蛘?，可以使 用一個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸序列，并在重新組裝全長(zhǎng)核苷酸序列時(shí)引入突變。DNA改組 (shuffling)和家族改組技術(shù)適用于制備具有優(yōu)選性質(zhì)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體。適合進(jìn) 行“改組”的方法可以參見EPO 752 008、EPl 138 763、EPl 103 606。改組也可以與如US 6，180，406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA誘變相結(jié)合。因此，有可能在體內(nèi)或體外在核苷酸序列中產(chǎn)生大量定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變，并隨 后通過多種手段篩選功能性得到改進(jìn)的編碼多肽?？梢允褂美缬?jì)算機(jī)分析(in silico) 和核酸外切酶介導(dǎo)(exo-mediated)的重組方法(參見WO 00/58517、US 6, 344, 328, US 6，361，974)進(jìn)行分子進(jìn)化，其中所產(chǎn)生的變體保留了與已知酶或蛋白的很低的同源性。由 此獲得的所述變體可與已知的轉(zhuǎn)移酶具有顯著的結(jié)構(gòu)類似性，但卻具有很低的氨基酸序列 同源性。此外，如在非限定性實(shí)例中，多核苷酸序列的突變體或天然變體也可以與野生型 或其它突變體或天然變體重組以生產(chǎn)新的變體。也可以篩選所述新的變體以獲得功能性得 到改進(jìn)的編碼多肽。應(yīng)用以上以及類似的分子進(jìn)化方法能夠在沒有關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)或功能的任何現(xiàn)有 知識(shí)的情況下鑒定和選擇具有優(yōu)選特性的本發(fā)明的酶變體，并能夠產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的但有益 的突變體或變體。在本領(lǐng)域中應(yīng)用分子進(jìn)化來優(yōu)化或改變酶活性的實(shí)例有很多，所述實(shí)例 包括但不限于以下的一種或多種優(yōu)化在宿主細(xì)胞或體外的表達(dá)和/或活性、增加酶活性、 改變底物和/或產(chǎn)物特異性、增加或降低酶穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、改變?cè)趦?yōu)選環(huán)境條件(如 溫度、PH、底物)中酶的活性/特異性。
使用分子進(jìn)化工具可以改變酶以提高該酶的功能性，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來 說是顯而易見的。適合地，用于本發(fā)明的編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列可以編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移 酶變體，即當(dāng)與親本酶比較時(shí)，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以包含至少一個(gè)氨基酸的取代、缺失 或添加。變體酶與親本酶保持至少1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、 60%,70^^80%,90^^95%,97^^99%的同源性。適合的親本酶可以包括具有酯酶或脂肪 酶活性的任何酶。優(yōu)選地，親本酶與pfam00657共有序列相比對(duì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體保留或加入了在GD&uGANDY和HPT區(qū) 中發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)或多個(gè)pfam00657共有序列氨基酸殘基?？梢允褂梅肿舆M(jìn)化工具使酶(如在含水環(huán)境中沒有或具有低脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活 性的脂肪酶)突變，以引入或增強(qiáng)轉(zhuǎn)移酶活性，由此生產(chǎn)適合用于本發(fā)明的組合物和方法 的具有顯著轉(zhuǎn)移酶活性的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。適合地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列 可以編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶變體，與親本酶相比，該變體對(duì)極性脂質(zhì)(優(yōu)選為磷脂和/或糖 脂)具有增強(qiáng)的酶活性。優(yōu)選地，所述變體還可以對(duì)溶血極性脂質(zhì)(lyso polar lipid)具 有低活性或無活性。對(duì)極性脂質(zhì)、磷脂和/或糖脂的活性增強(qiáng)可能是由于水解和/或轉(zhuǎn)移 酶活性或二者組合的結(jié)果。與親本酶相比，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體可以對(duì)甘油三酯和/或甘油單酯和/或 甘油二酯具有降低的活性。適合地，所述酶變體可以沒有對(duì)甘油三酯、和/或甘油單酯和/或甘油二酯的活 性?；蛘?，所述酶變體可以具有提高的熱穩(wěn)定性。所述酶變體可以對(duì)以下的一種或多種具有提高的活性極性脂質(zhì)、磷脂、卵磷脂、 磷脂酰膽堿、糖脂、二半乳糖基甘油單酯、單半乳糖基甘油單酯。脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶變體是已知的，且一種或多種所述變體可以適用于本發(fā)明的方法 和應(yīng)用，和/或本發(fā)明的酶組合物。僅舉例來說，根據(jù)本發(fā)明可以使用以下文獻(xiàn)中闡述的 脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15 :266(2) :997-1000; Robertson et al. , J.Biol. Chem. 1994 Jan 21 ；269 (3) :2146-50 ；Brumlik et al., J.Bacteriol 1996 Apr ； 178 (7) :2060-4 ；Peelman et al.，Protein Sci. 1998 Mar ；7 (3) 587-99。氨基酸序列本發(fā)明還涵蓋由用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核 苷酸序列所編碼的氨基酸序列。本文所使用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白”同義。在一些 實(shí)例中，術(shù)語“氨基酸序列，，與術(shù)語“肽”同義。所述氨基酸序列可以從適合的來源制備/分離，或其可以通過合成制備、或其可 以使用重組DNA技術(shù)制備。適合地，所述氨基酸序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從本文教導(dǎo)的分離多肽獲得。一種適合測(cè)定分離多肽的氨基酸序列的方法如下28
可以將純化的多肽凍干，并將100 μ g的凍干原料溶解于8M尿素和0. 4M碳酸氫銨 (pH 8.4)的50 μ 1混合物中。在覆蓋氮?dú)獠⒓尤?μ1 45mM 二硫蘇糖醇后，可以將溶解的 蛋白在50°C變性并還原15分鐘。冷卻至室溫后，可以加入5μ 1 IOOmM碘乙酰胺，從而使半 胱氨酸殘基在室溫、避光和氮?dú)庀卵苌?5分鐘?？梢韵蛞陨戏磻?yīng)混合物中加入1；35 μ 1水和含5 μ g內(nèi)切蛋白酶Lys_C的5 μ 1 /K 溶液，并在37°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下消化M小時(shí)?？梢允褂萌軇〢 (0. 1% TFA的水溶液)和溶劑B(0. 1% TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18 柱(0. 46x15cm ；10 μ m ；The Separation Group, California, USA)上通過反相 HPLC 分 離所得到的肽。在N-末端測(cè)序前，可以使用相同的溶劑體系在Develosil C18柱上對(duì)所選 擇的肽進(jìn)行重新層析?？梢允褂肁pplied Biosystems 476A測(cè)序儀，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書 (Applied Biosystems，California，USA)使用脈沖液態(tài)快速循環(huán)來完成測(cè)序。序列同一性或序列同源性在此，術(shù)語“同源物”是指與目標(biāo)氨基酸序列和目標(biāo)核苷酸序列具有一定同源性的 實(shí)體。在此，術(shù)語“同源性”可以等同于“同一性”。所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或編碼保留所述酶的功能活 性和/或增強(qiáng)所述酶的活性的多肽。在本文中，認(rèn)為同源序列包括可以與目標(biāo)序列有至少75^^85%或90%同一性， 優(yōu)選為至少95%或98%同一性的氨基酸序列。通常，同源物將包含與目標(biāo)氨基酸序列相同 的活性位點(diǎn)等。雖然同源性也可以被視為相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功 能)，但是在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選同源性表達(dá)序列的同一性。在本文中，認(rèn)為同源序列包括可以與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列(目標(biāo)序列) 有至少75 %、85 %或90 %同一性的核苷酸序列，優(yōu)選為至少95 %或98 %同一性的核苷酸序 列。通常，同源物將包括與目標(biāo)序列相同的活性位點(diǎn)編碼序列等。雖然同源性也可以被視 為相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能)，但是在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選同源 性表達(dá)序列的同一性?？梢酝ㄟ^目測(cè)進(jìn)行同源性比較，或者更通常是借助易于獲得的序列比較程序進(jìn)行 同源性比較。這些商業(yè)性計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列間的同源性％?？梢栽谶B續(xù)的序列中計(jì)算同源性％，即一個(gè)序列與其它序列比對(duì)，且將一個(gè)序列 中的每個(gè)氨基酸與其它序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，每次比較一個(gè)殘基。這被稱為“無缺 口”比對(duì)。通常所述無缺口比對(duì)僅在數(shù)量相對(duì)少的殘基中進(jìn)行。雖然這是非常簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的方法，但是其未能考慮到如在其它方面相同的成對(duì)序 列中，一個(gè)插入或缺失將引起隨后的氨基酸殘基無法比對(duì)，因此可能導(dǎo)致在進(jìn)行整體比對(duì) 時(shí)的同源性％大大降低。因此，大部分序列比對(duì)方法被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生考慮了可能的插入和缺 失而不過度地懲罰整體同源性得分的最佳比對(duì)。這可以通過在比對(duì)序列中插入“缺口”以 試圖使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)。然而，這些更加復(fù)雜的方法給比對(duì)中出現(xiàn)的每個(gè)缺口賦予“缺口罰分”，使得對(duì)于 相同數(shù)目的相同氨基酸，具有盡量少缺口的序列比對(duì)(反映了兩個(gè)比較的序列間更高的相 關(guān)性)將比具有更多缺口的序列比對(duì)具有更高的得分。通常使用“仿射缺口罰分”(Affine gap cost)，即對(duì)缺口的存在處以較高罰分，而對(duì)缺口中的每個(gè)后續(xù)殘基處以較小罰分。這是最常用的缺口評(píng)分系統(tǒng)。高缺口罰分將無疑產(chǎn)生具有更少缺口的優(yōu)化比對(duì)。大多數(shù)比對(duì) 程序允許修正缺口罰分。然而，當(dāng)使用所述軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用默認(rèn)值。因此，最大同源性％的計(jì)算首先需要在考慮缺口罰分下產(chǎn)生最佳的比對(duì)。適 合用于進(jìn)行所述比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序?yàn)閂ector NTI (Invitrogen Corp.)?？梢赃M(jìn)行序 列比較的其它軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST軟件包(參見Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed, Chapter 18)和FASTA(Altschul 等 1990 J. Mol. Biol. 403-410)。BLAST和FASTA均可進(jìn)行離線和在線搜索(參見Ausubel等1999，7-58 頁至7-60頁)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用Vector NTI程序。也可以將稱為BLAST 2 Sequences的新型工具用于比較蛋白和核苷酸序列(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) 187-8 和 tatiana@ncbi.nlm.nih. gov)。雖然可以根據(jù)同一性來測(cè)定最終的同源性％，但是比對(duì)方法本身通常不是基于 全是或全非的成對(duì)比較。作為代替，通常使用尺度相似性評(píng)分矩陣(scaled similarity score matrix)，基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離對(duì)每對(duì)比較評(píng)分。通常所用的此矩陣的實(shí)例為 BL0SUM62矩陣(BLAST程序套的默認(rèn)矩陣)。Vector NTI程序通常使用公開的默認(rèn)值，或者 也可能使用所提供的自定義符號(hào)比較表(詳見用戶手冊(cè))。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用Vector NTI軟件包的默認(rèn)值?；蛘?，也可以使用基于與CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1)， 237-244)類似的算法的Vector NTI (Invitrogen Corp.)中的多重比對(duì)特征來計(jì)算同源性％。一旦軟件生成了最佳比對(duì)，就可以計(jì)算同源性％，優(yōu)選為序列同一性％。軟件通常 將其作為序列比較的一部分來執(zhí)行，并生成數(shù)值結(jié)果。如果在測(cè)定序列同一性時(shí)使用缺口罰分，隨后優(yōu)選使用以下參數(shù)進(jìn)行成對(duì)比對(duì)BLAST缺口開口0缺口延伸0CLUSTALDNA蛋白字長(zhǎng)(WORD21K三聯(lián)體SIZE)缺口罰分1510缺口延伸6.660.1 在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選使用具有以上定義的缺口罰分和缺口延伸設(shè)定的 CLUSTAL來測(cè)定核苷酸序列的序列同一性。
適合地，在至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸中，優(yōu)選為在至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸中，優(yōu)選 為在至少40個(gè)連續(xù)的核苷酸中，優(yōu)選為在至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸中，優(yōu)選為在至少60個(gè) 連續(xù)的核苷酸中，優(yōu)選為在至少100連續(xù)的核苷酸中測(cè)定核苷酸序列的同一性程度。適合地，在全序列中測(cè)定核苷酸序列中的同一性程度。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明氨基酸序列的同一性程度可以通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算 機(jī)程序的方法，如Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.)來適當(dāng)?shù)販y(cè)定。對(duì)于成對(duì)比對(duì)，所用 的矩陣優(yōu)選為缺口開口罰分為10. 0且缺口延伸罰分為0. 1的BL0SUM62。適合地，在至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸中，優(yōu)選為在至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸中，優(yōu)選 為在至少40個(gè)連續(xù)的氨基酸中，優(yōu)選為在至少50個(gè)連續(xù)的氨基酸中，優(yōu)選為在至少60個(gè) 連續(xù)的氨基酸中測(cè)定氨基酸序列的同一性程度。適合地，在全序列中測(cè)定氨基酸序列的同一性程度。所述序列也可以具有產(chǎn)生沉默改變和產(chǎn)生功能等價(jià)物的氨基酸殘基的缺失、插入 或取代?？梢愿鶕?jù)殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)上的相似性來 進(jìn)行謹(jǐn)慎的氨基酸取代，只要該物質(zhì)的次要結(jié)合活性被保持即可。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸 包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不 帶電荷的極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、 谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可以根據(jù)下表進(jìn)行保守取代。在第二列中相同欄中的氨基酸，優(yōu)選為在第三 列中相同行中的氨基酸可以相互取代脂肪族非極性G、A、PI、L、V極性-不帶電荷C、 S、 Τ、 MN、Q極性-帶電荷D、EK、R芳香族H、F、W、Y本發(fā)明還涵蓋可以發(fā)生的同源取代(本文所用的取代和替換均指現(xiàn)存氨基酸殘 基與可選殘基的互換)，即相似取代，如堿性氨基酸取代堿性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性 氨基酸、極性氨基酸取代極性氨基酸等。也可以發(fā)生非同源取代，即從一類殘基變成另一類 殘基，或涉及非天然氨基酸，如鳥氨酸(下文稱為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱為B)、正 亮氨酸鳥氨酸(下文稱為0)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。也可以使用非天然氨基酸進(jìn)行替換。氨基酸變體序列可以包含可以在序列的任何兩個(gè)氨基酸殘基間插入的適合的間 隔子基團(tuán)，除氨基酸間隔子如甘氨酸或丙氨酸殘基外，還包括烷基基團(tuán)如甲基、乙基或 丙基基團(tuán)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可充分理解其它形式的變異，其涉及以類肽(p^toid)形式 存在的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。為了避免爭(zhēng)議，“類肽形式”用來指α-碳取代基基團(tuán)在殘31基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸殘基變體。制備類肽形式的肽的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已 知的，如 Simon RJ 等，PNAS (1992) 89 (20)，9367-9371 和 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995)13(4)，132-134。本發(fā)明所使用的或編碼具有本文定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列可以在其 內(nèi)部包含合成的或修飾的核苷酸。本領(lǐng)域中已知對(duì)寡核苷酸的許多不同類型的修飾。這些 修飾包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或 多賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應(yīng)該理解可以用本領(lǐng)域中可用的任何方法來修飾本文所 述的核苷酸序列?？梢赃M(jìn)行所述修飾以增強(qiáng)核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命。本發(fā)明還涵蓋與本文所討論的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互補(bǔ)的核苷酸 序列的應(yīng)用。如果序列與其片段互補(bǔ)，此序列可以被用作探針以鑒定其它生物等中相同的 編碼序列?？梢砸远喾N方式獲得與本發(fā)明的序列并非100%同源但卻落入本發(fā)明范圍中的多 核苷酸?？梢酝ㄟ^例如探測(cè)由一系列個(gè)體(如來自不同種群的個(gè)體)制備的DNA文庫來獲 得本文所述序列的其它變體。此外，可以獲得其它病毒/細(xì)菌或細(xì)胞同源物，特別是在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞(如大鼠、小鼠、牛和靈長(zhǎng)類細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞同源物，且所述同源物或其片段 將通常能夠選擇性地與本文序列表中所示的序列雜交?？梢酝ㄟ^探測(cè)從其它動(dòng)物物種制備 的cDNA文庫或基因組DNA文庫，并在中度至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下使用包含所附序列表中任何一 個(gè)序列的全部或部分的探針探測(cè)所述文庫來獲得所述序列。類似的考慮用于獲得本發(fā)明多 肽或核苷酸序列的物種同源物和等位基因變體。也可以使用簡(jiǎn)并PCR來獲得變體和株系/物種同源物，所述簡(jiǎn)并PCR將使用設(shè)計(jì) 為靶向變體和同源物中編碼本發(fā)明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通過比對(duì)來 自多個(gè)變體/同源物的氨基酸序列來預(yù)測(cè)保守序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn) 行序列比對(duì)。例如廣泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。簡(jiǎn)并PCR中所用的引物可包含一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位點(diǎn)，且其使用條件的嚴(yán)謹(jǐn)性可低 于使用針對(duì)已知序列的單一序列引物克隆序列所用的那些條件?；蛘?，也可以通過已表征序列的定點(diǎn)誘變來獲得所述多核苷酸。例如當(dāng)需要沉默 密碼序列的改變，從而為表達(dá)多核苷酸序列的特定宿主細(xì)胞優(yōu)化密碼子偏愛性時(shí)，這可能 是有用的。可能需要其它序列改變，以引入限制性多肽識(shí)別位點(diǎn)，或改變由多核苷酸編碼的 多肽的性質(zhì)或功能?？梢允褂帽景l(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)制備引物，如PCR引物，用于可選擴(kuò)增 反應(yīng)的引物；探針，如使用放射性或非放射性標(biāo)記物通過常規(guī)方法用顯色標(biāo)記物標(biāo)記的探 針；或可以將多核苷酸克隆到載體中。所述引物、探針和其它片段的長(zhǎng)度可以是至少15個(gè)， 優(yōu)選為至少20個(gè)、如至少25個(gè)、30個(gè)或40個(gè)核苷酸，且其也涵蓋在如本文所用的術(shù)語多核 苷酸之內(nèi)?？梢灾亟M、合成或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何方法來制備根據(jù)本發(fā)明的多 核苷酸(如DNA多核苷酸)和探針。它們也可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆。通常，可通過合成方法來制備引物，該方法包括以每次一個(gè)核苷酸的方式逐步制 備所需要的核酸序列。本領(lǐng)域中易于獲得使用自動(dòng)化技術(shù)來實(shí)現(xiàn)上述方法的技術(shù)。通常使用重組方法，如使用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)來制備較長(zhǎng)的多核苷酸。這包括制備位于所需要克隆的脂質(zhì)靶向序列區(qū)域側(cè)翼的一對(duì)引物(如約15至30個(gè)核 苷酸)，使引物接觸從動(dòng)物或人細(xì)胞獲得的mRNA或cDNA，在可以使所需區(qū)域擴(kuò)增的條件下 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增的片段(如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)，并回收 擴(kuò)增的DNA。可以設(shè)計(jì)引入使其包含適合的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便可以將擴(kuò)增的DNA克隆 到適合的克隆載體中。雜交本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的序列互補(bǔ)的序列，或能夠與本發(fā)明的序列雜交或與其互 補(bǔ)序列雜交的序列的應(yīng)用。本文所用的術(shù)語“雜交”包括“一條核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程”，以 及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行擴(kuò)增的過程。本發(fā)明還涵蓋所述核苷酸序列的應(yīng)用，所述核苷酸序列能夠和與本文所討論的目 標(biāo)序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互補(bǔ)的序列雜交。本發(fā)明還涵蓋能夠與本文所討論的核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。雜交條件基于核苷酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)，如Berger和Kimmel (1987， Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)中所教導(dǎo)，且給出了如下文所解釋的定義的“嚴(yán)謹(jǐn)性”。最高嚴(yán)謹(jǐn)性通常出現(xiàn)在約(Tm-5)。C (比探針的Tm低5°C )；高嚴(yán)謹(jǐn)性在比Tm以 下約5°C至10°C ；中等嚴(yán)謹(jǐn)性在Tm以下約10°C至20°C ；且低嚴(yán)謹(jǐn)性出現(xiàn)在Tm以下約20°C 至25°C。如本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，最高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交可以用于鑒定或檢測(cè)相同的核苷酸序 列，而中等(或低)嚴(yán)謹(jǐn)性雜交可以用于鑒定或檢測(cè)相似或相關(guān)的多核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明涵蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件或中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與編碼具有如本文 定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列的應(yīng)用。更優(yōu)選地，本發(fā)明涵蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件(如65°C和0. IxSSC{lxSSC = 0. 15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH 7.0})下與編碼具有如本文定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序 列發(fā)生雜交的序列的互補(bǔ)序列的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及能夠與本文討論的核苷酸序列(包括本文討論的那些序列的互補(bǔ) 序列)雜交的核苷酸序列的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及能夠與本文討論的核苷酸序列(包括本文討論的那些序列的互補(bǔ) 序列)雜交的序列的互補(bǔ)核苷酸序列的應(yīng)用。本發(fā)明的范圍還包括能夠在中等至最高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與本文所討論的核苷酸序 列雜交的多核苷酸序列的應(yīng)用。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涵蓋能夠在嚴(yán)謹(jǐn)性條件(如50°C和0. 2xSSC)下與本文所討 論的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的應(yīng)用。在更優(yōu)選的方面，本發(fā)明涵蓋能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件(如65°C和0. IxSSC)下與本文 所討論的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的應(yīng)用。多肽的表達(dá)可以將用于本發(fā)明的核苷酸序列或用于編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì)的多 肽的核苷酸序列引入重組的復(fù)制型載體中。載體可以用于在相容的宿主細(xì)胞中和/或從相 容的宿主細(xì)胞復(fù)制并以多肽形式表達(dá)所述核苷酸序列?？梢允褂冒刂菩蛄衼砜刂票磉_(dá)，33所述控制序列包括含啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)?？梢允褂迷松锏膯?dòng)子和 在真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子?？梢允褂媒M織特異的或刺激特異性啟動(dòng)子。也可以使用包 含來自上述兩個(gè)或更多不同啟動(dòng)子的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。根據(jù)所用的序列和/或載體，通過由宿主重組細(xì)胞表達(dá)核苷酸序列而產(chǎn)生的多肽 可以被分泌，或被包含在細(xì)胞內(nèi)。編碼序列經(jīng)設(shè)計(jì)可以具有信號(hào)序列，該信號(hào)序列指導(dǎo)編碼 序列物質(zhì)分泌通過特定的原核生物或真核細(xì)胞膜。構(gòu)建體術(shù)語“構(gòu)建體”，與術(shù)語如“結(jié)合物(或連接物)”、“盒(cassette)”和“雜合體 (hybrid)，，同義，其包含依照本發(fā)明使用的編碼具有本文所定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷 酸序列，且其直接或間接地與啟動(dòng)子連接。間接連接的實(shí)例是在啟動(dòng)子和本發(fā)明的核苷酸 序列之間提供適合的間隔子基團(tuán)，如內(nèi)含子序列，如Sil內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。本發(fā)明中的 相關(guān)術(shù)語“融合”也是如此，其包括直接或間接連接。在一些情況中，這些術(shù)語不涵蓋編碼 所述蛋白的核苷酸序列與其通常連接的野生型基因啟動(dòng)子的天然組合(此時(shí)這兩者均處 于其天然環(huán)境中)。所述構(gòu)建體甚至可以包含或表達(dá)允許選擇基因構(gòu)建體的標(biāo)記物。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選構(gòu)建體至少包含本發(fā)明的核苷酸序列，或編碼具有如本文定 義的特定性質(zhì)的多肽且可操作地與啟動(dòng)子連接的核苷酸序列。生物與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“生物”包括可包含本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有如本文 定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物的任何生物。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”包括任何包含編碼具有如本文定義的特定性 質(zhì)的多肽的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物的生物，和/或其中啟動(dòng)子能夠允許編碼具 有如本文定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列在所述生物內(nèi)表達(dá)。優(yōu)選核苷酸序列被引入 到生物的基因組中。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”不涵蓋在處于自身天然環(huán)境中并同時(shí)受到其同處于自身天然 環(huán)境中的天然啟動(dòng)子控制的天然核苷酸編碼序列。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括包含以下任何一種或組合的生物編碼具有如本 文定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列、本文定義的構(gòu)建體、本文定義的載體、本文定義的 質(zhì)粒、本文定的細(xì)胞或其產(chǎn)物。例如，所述轉(zhuǎn)基因生物還可以包含編碼具有如本文定義的特 定性質(zhì)的多肽且受到啟動(dòng)子控制的核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子原本并不與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移 酶編碼基因相連。宿主細(xì)胞/生物的轉(zhuǎn)化所述宿主微生物可以是原核或真核生物。合適的原核宿主的實(shí)例包括細(xì)菌，例如大腸桿菌和地衣芽孢桿菌，優(yōu)選地衣芽孢 桿菌。原核宿主的轉(zhuǎn)化的教導(dǎo)在本領(lǐng)域中有詳細(xì)的記載，例如參見Sambrook等 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd edition,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，則在轉(zhuǎn)化前需要適當(dāng)?shù)匦揎椇塑账嵝蛄?，例如?除內(nèi)含子。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所示轉(zhuǎn)基因生物可以為酵母。可以利用本領(lǐng)域已知的多種方法轉(zhuǎn)化絲狀真菌，例如包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì) 體轉(zhuǎn)化，然后以已知的方式重建細(xì)胞壁的方法。在EP 0 238 023中公開了曲霉作為宿主微 生物的應(yīng)用。另一種宿主生物可以為植物。用于轉(zhuǎn)化植物的常用技術(shù)的概述可見 于 Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42 :205-225)禾口 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的其 它教導(dǎo)可見于EP-A-0449375。以下部分為關(guān)于真菌、酵母和植物轉(zhuǎn)化的一般教導(dǎo)。轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物可以為真菌，例如絲狀真菌。此類宿主的合適實(shí)例包括屬于嗜熱菌 屬(Thermomyces)、枝頂抱屬(Acremonium)、曲霉屬、青霉屬(Penicillium)、毛霉菌屬 (Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)和木霉屬(Trichoderma)等的任何成員。關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌教導(dǎo)的概述見于US-A-5741665，其中聲稱用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化以 及真菌培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。應(yīng)用于鏈孢霉(N.crassa)的技術(shù)的研究進(jìn)展 見于，例如 Davis and de Serres，Methods Enzymol (1971) 17A :79_143。關(guān)于絲狀真菌的進(jìn)一步教導(dǎo)的概述見于US-A-5674707。一方面，所述宿主生物可以為曲霉屬，例如黑曲霉。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉屬還可以通過以下制備，例如Turner G. 1994(Vectors for genetic manipulation. In :Martinelli S.D. , Kinghorn J.R. (Editors)Aspergillus :50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)的教導(dǎo)。絲狀真菌的基因表達(dá)的綜述見于Punt等.Q002) Trends Biotechnol 2002 May ； 20(5) :200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997) 17(4) :273_306。轉(zhuǎn)化的酵母在另一個(gè)實(shí)施方式中，所示轉(zhuǎn)基因生物可以為酵母。酵母中異源基因表達(dá)的原則的綜述見于，例如Methods MoI Biol (1995),49 341-54，and Curr Opin Biotechnol(1997) Oct ；8 (5) :554_60。在這一點(diǎn)上，酵母，例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(參見 FEMS Microbiol Rev(2000 24(1) :45-66)可用作異源基因表達(dá)的載體。在釀酒酵母中的異源基因表達(dá)和基因產(chǎn)物的分泌的原則的綜述見于E Hinchcliffe E Kenny (1993， “ Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes“ ，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)0對(duì)于酵母的轉(zhuǎn)染，已經(jīng)開發(fā)出了多個(gè)轉(zhuǎn)染方法。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母可以根 據(jù)以下教導(dǎo)制備Hinnen等，(1978,Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929) ；BeggsiJ D (1978，Nature，London，275，104)；和 Ito，H et a/(1983， J Bacteriology 153，163-168)?？梢岳酶鞣N篩選標(biāo)記物篩選轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，例如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物、顯性抗35生素抗性標(biāo)記物。合適的酵母宿主生物可以選自在生物技術(shù)上相關(guān)的酵母種，例如但不限于選自畢 赤酵母、漢遜酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowinia)、酵母菌(包括釀 酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母種。甲醇營養(yǎng)型酵母種的菌株巴斯德畢赤酵母可以用作宿主生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主生物可以為漢遜酵母種，例如漢森酵母 (H. polymorpha)(如 W001/39M4 中的闡述)。轉(zhuǎn)化的植物/植物細(xì)胞適合用于本發(fā)明的宿主生物可以為植物。常用技術(shù)的綜述可見于以下文 獻(xiàn)Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mo/β/o/[1991] 42 :205-225)禾口 Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)，或者 WO 01/16308。轉(zhuǎn) 基因植物可以產(chǎn)生，例如水平提高的植物固醇酯和植物留烷醇酯。因此，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有增強(qiáng)水平的植物固醇酯和植物留烷醇酯的轉(zhuǎn)基因植 物的方法，其包括以下步驟利用本文定義的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(尤其是利用包含本文定義 的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體或構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)出植 物。分泌通常，期望表達(dá)宿主將多肽分泌到培養(yǎng)基中，由此可以更容易地回收酶。根據(jù)本發(fā) 明，可以基于所需的表達(dá)宿主來選擇分泌前導(dǎo)序列。本發(fā)明中也可以使用雜合信號(hào)序列。原本不與編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列連接的分泌前導(dǎo)序列的典型實(shí)例為 那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18個(gè)氨基酸和M個(gè)氨基酸兩種形式，如來 自曲霉菌屬)、a-因子基因(酵母，如酵母屬、克魯維酵母和漢遜酵母)或α-淀粉酶基因 (芽孢桿菌)的序列。檢測(cè)本領(lǐng)域已知多種用于檢測(cè)和測(cè)定氨基酸序列表達(dá)的操作方法。實(shí)例包括酶聯(lián)免疫 吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種標(biāo)記物和結(jié)合技術(shù)，并可以將其用于各種核酸和氨基酸 分析。許多公司如 Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega(Madison, WI)禾口 US Biochemical Corp (Cleveland, OH)為這些方法提供商業(yè)試劑盒和操作說明。適合的報(bào)告分子或標(biāo)記物包括那些放射性核素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或顯 色劑，以及底物、輔助因子、抑制劑和磁性粒子等。教導(dǎo)這些標(biāo)記物應(yīng)用的專利包括 US-A-3, 817，837、US-A-3, 850，752、US-A-3, 939，350、US-A-3, 996，345、US-A-4, 277，437、 US-A-4, 275，149 和 US-A-4, 366，241。此外，可以如US-A-4，816，567中所示制備重組免疫球蛋白。融合蛋白用于本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可以作為融合蛋白制備，例如以便有助于其提取和 純化。融合蛋白配偶體(partner)的實(shí)例包括谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA 結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)和半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶體和目的蛋白序列之間包含蛋白水解切割位點(diǎn)以去除融合蛋白序列。優(yōu)選地，融合蛋白將不會(huì)妨礙 蛋白序列的活性。Curr. Opin. Biotechnol. (1995)6(5) :501-6已經(jīng)對(duì)大腸桿菌中的基因融合表達(dá) 系統(tǒng)進(jìn)行了綜述。具有如本文定義的特定性質(zhì)的多肽的氨基酸序列可以與非天然序列連接以編碼 融合蛋白。例如，對(duì)于為獲得能夠影響物質(zhì)活性的試劑而進(jìn)行的肽庫篩選，其可用于編碼表 達(dá)可被商購抗體所識(shí)別的非天然表位的嵌合體。下文將參照以下附圖和實(shí)施例，僅以舉例的方式描述本發(fā)明。


圖1顯示了突變的殺鮭氣單胞菌成熟脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(GCAT)的氨基酸序列，該突 變體具有Asn80Asp突變(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID No. 15)；圖2顯示了來自嗜水氣單胞菌(ATCC #7965)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列 (SEQ ID No. 1)；圖3顯示了來自第6版數(shù)據(jù)庫的pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)；圖4顯示了從生物嗜水氣單胞菌獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 3) (P10480 ；GI 121051)；圖5顯示了從生物殺鮭氣單胞菌獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 4) (AAG098404 ； GI :9964017)；圖6顯示了從生物天藍(lán)色鏈霉菌A3⑵獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 5) (Genbank 登錄號(hào) NP_631558)；圖7顯示了從生物天藍(lán)色鏈霉菌A3⑵獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 6) (Genbank 登錄號(hào) CAC42140)；圖8顯示了從生物釀酒酵母獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 7) (Genbank登錄號(hào) P41734)；圖9顯示了從生物雷爾氏菌屬獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 8) (Genbank登錄號(hào) AL646052)；圖 10 顯示了 SEQ ID No. 9。Scoel NCBI 蛋白登錄號(hào) CAB39707. 1 GI :4539178 的 保守的假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 O)]；圖11顯示了如SEQ ID No. 10所示的氨基酸。koe2 NCBI蛋白登錄號(hào)CACO1477. 1 GI =9716139的保守的假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖 12 顯示了氨基酸序列(SEQ ID No. 11)。Scoe4 NCBI 蛋白登錄號(hào) CAB89450. 1 GI =7672261的推定的分泌性蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 O)]；圖 13 顯示了氨基酸序列(SEQ ID No. 12)。Scoe5 NCBI 蛋白登錄號(hào) CAB62724. 1 GI =6562793的推定的脂蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 O)]；圖 14 顯示了氨基酸序列(SEQ ID No. 13)。Sriml NCBI 蛋白登錄號(hào) AAK84028. 1 GI =15082088的GDSL-脂肪酶[龜裂鏈霉菌]；圖15顯示了來自殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida) (ATCC#14174)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 14)；
圖16顯示了核苷酸序列(SEQ ID No. 16)，其編碼來自嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的包含木聚糖酶信號(hào)肽的酶；圖17顯示了用于突變嗜水氣單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體的氨基酸 序列(SEQ ID No. 17)。帶下劃線的氨基酸是木聚糖酶信號(hào)肽；圖18顯示了來自Corynebacterium efficiens GDSx 300個(gè)氨基酸的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn) 移酶多肽(SEQ ID No. 18)；圖19顯示了從生物嗜水氣單胞菌獲得的氨基酸序列(SEQ ID No. 19) (P10480 ； GI :121051)(注意，這是成熟序列)；圖20顯示了殺鮭氣單胞菌成熟脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No. 20)(注意，這是成熟序列)；圖 21 顯示了來自 Sti^ptomyces thermosacchari 的核苷酸序歹Ij (SEQ ID No. 21)；圖 22 顯示了來自 Sti^ptomyces thermosacchari 的氨基酸序歹Ij (SEQ ID No. 22)；圖23顯示了來自褐色喜熱裂孢菌/⑶548個(gè)氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No. 23)；圖M顯示了來自Corynebacterium eff iciens/GDSx 300個(gè)氨基酸的氨基酸序列 (SEQ ID No. 24)；圖 25 顯示了來自 Corynebacterium efficiens 的核苷酸序列(SEQ ID No. 25)；圖沈顯示了 L131與來自阿維鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌的同源物的比對(duì)，說明了 GD&c基序(在L131以及阿維鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌中均為GDSY)、GANDY框(其為GGNDA 或GGNDL)和HPT區(qū)(被認(rèn)為是保守的催化組氨酸)的保守性。這三個(gè)保守部分均被突出 標(biāo)記；圖27顯示了活性位點(diǎn)中具有甘油的1IVN. PDB晶體結(jié)構(gòu)的帶狀顯示圖。此圖使用 Deep View Swiss-PDB 觀測(cè)器制作。圖觀顯示了活性位點(diǎn)中具有甘油的1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖(使用De印View Swiss-PDB觀測(cè)器制作)，黑色部分為活性位點(diǎn)甘油10 A以內(nèi)的殘基。圖四顯示了活性位點(diǎn)中具有甘油的1IVN.PDB晶體結(jié)構(gòu)的俯視圖(使用De印View Swiss-PDB觀測(cè)器制作)，黑色部分為活性位點(diǎn)甘油10 A以內(nèi)的殘基。圖30顯示了比對(duì)1;圖31顯示了比對(duì)2;圖32和33顯示了 IIVN與P10480的比對(duì)(P10480為嗜水氣單胞菌酶數(shù)據(jù)庫序 列)，此比對(duì)從PFAM數(shù)據(jù)庫獲得并用在模型構(gòu)建過程中；圖34顯示了其中P10480為嗜水氣單胞菌數(shù)據(jù)庫序列的比對(duì)。此序列用于模型構(gòu) 建和位點(diǎn)選擇。注意繪制出了完整的蛋白(SEQ ID No. 3)，成熟蛋白(等價(jià)于SEQ ID No. 19) 起始于第19位殘基。A. sal為殺鮭氣單胞菌的⑶SX脂肪酶(SEQ ID No. 4)，A. hyd為嗜水 氣單胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No. 19)。所列序列間的差異位置在共有序列中用*表示。圖35顯示了在實(shí)施例1中使用的基因構(gòu)建體；圖36顯示了在實(shí)施例1中使用的密碼子優(yōu)化的基因構(gòu)建體(no. 052907)；和圖37顯示了包含LAT-KLM3’前體基因的BioI插入物的序列，下劃線處為-35框 和-10框；
圖38顯示了在三丁酸甘油酯瓊脂上于37 °C生長(zhǎng)48小時(shí)后的 BML780-KLM3，CAP50 (包含SEQ ID No. 15-上面的菌落)和BML780 (空宿主菌株-下面的 菌落)。圖39顯示了來自殺鮭氣單胞菌的包含信號(hào)序列(preLAT-從第1位至第87位) 的核苷酸序列(SEQ ID No. 26)；圖40顯示了從生物嗜水氣單胞菌獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸 序列(SEQ ID No. 27)；圖41顯示了從生物殺鮭氣單胞菌獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸 序列(SEQ ID No. 28)；圖42顯示了從雷爾氏菌生物獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列 (SEQ ID No. 29)；圖43顯示了如SEQ ID No. 30所示的核苷酸序列，其編碼NCBI蛋白登錄號(hào) CAB39707. 1 GI :4539178的保守的假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖44顯示了如SEQ ID No. 31所示的核苷酸序列，其編碼koe2，NCBI蛋白登錄號(hào) CACO1477. 1 GI :9716139的保守的假定蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖45顯示了如SEQ ID No. 32所示的核苷酸序列，其編碼koe4，NCBI蛋白登錄號(hào) CAB89450. 1 GI :7672261的推定分泌性蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖46顯示了如SEQ ID No. 33所示的核苷酸序列，其編碼koe5，NCBI蛋白登錄號(hào) CAB62724. 1 GI :6562793的推定脂蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖47顯示了如SEQ ID No. 34所示的核苷酸序列，其編碼Sriml，NCBI蛋白登錄號(hào) AAK84028. 1 GI :15082088 GDSL-脂肪酶[龜裂鏈霉菌]；圖48顯示了來自嗜水氣單胞菌(ATCC #7965)的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序 列(SEQ ID No. 35)；圖49顯示了來自殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(ATCC#14174)的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 36)；圖50顯示了具有AsnSOAsp突變(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)的殺鮭 氣單胞菌成熟脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(GCAT)突變體的氨基酸序列(本文顯示為SEQ ID No. 15)， 和經(jīng)過翻譯后修飾的氨基酸序列(SEQ ID No. 37)。成熟多肽SEQ ID No. 15的翻譯后修飾 包括在位置235-A至(且包括)位置273-R的切割，由此失去38個(gè)氨基酸。-SEQ ID No. 37的第235位和236位氨基酸殘基在翻譯后修飾后并沒有共價(jià)連接。 所形成的兩個(gè)肽通過一個(gè)或多個(gè)S-S橋連接在一起。SEQ ID No. 37中的第236位氨基酸對(duì) 應(yīng)于本文所示的SEQ ID No. 15中的第274位氨基酸殘基。圖51顯示了從生物天藍(lán)色鏈霉菌A3 ( 獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 38) (Genbank 登錄號(hào) NC_003888. 1 :8327480. . 8328367)；圖52顯示了從生物天藍(lán)色鏈霉菌A3 ( 獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 39) (Genbank 登錄號(hào) AL939131. 1 :265480. · 266367)；圖53顯示了從生物釀酒酵母獲得的本發(fā)明的編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列 (SEQ ID No. 40) (Genbank 登錄號(hào) Z75034)；圖 54 顯示了氨基酸序列(SEQ ID No. 41)。Scoe3 NCBI 蛋白登錄號(hào) CAB88833. 139GI =7635996的推定的分泌性蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 O)]；圖55顯示了 SEQ ID No 42，其為來自近平滑假絲酵母的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸 序列；圖56顯示了來自喜熱裂孢菌的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的多肽序列(SEQ ID No. 43)；圖 57 顯示了來自 Novosphingobium aromaticivorans, 284 個(gè)氨基酸的脂質(zhì)?；?轉(zhuǎn)移酶的多肽(SEQ ID No. 44)；圖58顯示了來自天藍(lán)色鏈霉菌，268個(gè)氨基酸的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的多肽(SEQ ID No. 45)；圖59顯示了來自阿維鏈霉菌269個(gè)氨基酸的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的多肽(SEQ ID No.46)；圖60顯示了來自褐色喜熱裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 47)；圖61顯示了來自天藍(lán)色鏈霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 48)；圖62顯示了來自阿維鏈霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No. 49)；圖63顯示了來自阿維鏈霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 50)；圖64顯示了來自褐色喜熱裂孢菌/⑶的氨基酸序列(SEQ ID No. 51)；圖65顯示了如SEQ ID No. 52所示的核苷酸序列，其編碼koe3，NCBI蛋白登錄號(hào) CAB88833. 1 GI :7635996的推定分泌性蛋白[天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)]；圖66顯示了來自褐色喜熱裂孢菌的氨基酸序列(SEQ ID No. 53)；圖67顯示了以磷脂酰膽堿和膽固醇為底物，由脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)示意 圖；圖68顯示了在40°C溫育1小時(shí)(見深色塊)或在2°C溫育20小時(shí)(見淺色塊)， 隨后在75°C熱處理1小時(shí)的精膏肉醬的質(zhì)地測(cè)量結(jié)果；其中#1)是沒有酶添加的對(duì)照 ’#2) 添加T 0. 84TrU/g劑量的酶KLM3，；#3)添加了 4. 2TrU/g劑量的酶KLM3，；和#4)添加了 3LEU/g劑量的磷脂酶Lipomod ；圖69顯示了來自肉樣品的脂質(zhì)的TLC分析(溶劑6)結(jié)果。PE =磷脂酰乙醇胺； PA =磷脂酸；PI =磷脂酰肌醇；PC =磷脂酰膽堿；圖70顯示了來自肉樣品的脂質(zhì)的TLC分析(溶劑5)結(jié)果。CHL =膽固醇；FFA = 游離脂肪酸；圖71顯示了使用對(duì)照乳化劑Citrem或本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(KLM3’)處理的 以及陰性對(duì)照(不含酶或乳化劑)的德國肝肉香腸的照片；和圖72顯示了由HPTLC分析的肝肉香腸中的游離膽固醇；1 =對(duì)照；2 = KLM3_脂質(zhì) ?；D(zhuǎn)移酶(劑量如實(shí)施例3) ；3 = Citrem ；均為基于干重的百分比。實(shí)施例1地衣芽孢桿菌中脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(KLM3')的表達(dá)在地衣芽孢桿菌中將編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(SEQ. ID No. 15，，下文稱為KLM3')的 核苷酸序列(SEQ ID No. 49)與地衣芽孢桿菌α -淀粉酶(LAT)的信號(hào)肽一起作為融合蛋 白表達(dá)(參見圖35和36)。為了優(yōu)化在芽孢桿菌中的表達(dá)，從Geneart (Geneart AG，德國 雷根斯堡)訂購了經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因構(gòu)建體(ηο.05^Κ)7)。構(gòu)建體No. 052907包含位于LAT-KLM3’前體基因之前的不完全LAT啟動(dòng)子(僅_1040序列)和位于LAT-KLM3’前體基因下游的LAT轉(zhuǎn)錄(Tlat)(參見圖35和36)。為了構(gòu)建包 含5’末端側(cè)翼具有完全LAT啟動(dòng)子、3’末端側(cè)翼具有LAT終止子的LAT-KLM3’前體基因 的XhoI片段，以Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV為引物并以基因構(gòu)建體05四07為模板進(jìn)行 PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增。Plat5XhoI_Fff ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaaggggEBS2XhoI_RV :tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用Wiusion高保真度DNA聚合酶(Firmzymes 0Y,芬蘭埃 斯波)在熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR (退火溫度55°C )。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書anvitrogen，Carlsl3ad，Calif. USA)，使用限制性酶XhoI消 化所得PCR片段，并使用T4DNA連接酶將其連接到經(jīng)BioI消化的pICatH中。如美國專利申請(qǐng)US20020182734(國際公布WO 02/14490)所述，將連接混合物轉(zhuǎn) 化進(jìn)入枯草芽孢桿菌株SC6. 1。通過DNA測(cè)序確定包含LAT-KLM3’前體基因的BioI插入 物的序列(BaseClear，荷蘭萊頓)，并將正確質(zhì)粒克隆之一命名為pICatH-KLM3’ (oril) (圖53)。在許可的溫度(37°C )下將pICatH-KLM3’ (oril)轉(zhuǎn)化進(jìn)入地衣芽孢桿菌株 BML780 (BRA7 和 BML612 的衍生物，參見 W02005111203)。選擇一個(gè)新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的轉(zhuǎn)化株并將其命名為 BML780(plCatH-KLM3，(oril))。通過在非許可溫度(50°C )下、于含有5μ g/ml氯霉素的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，使BML780(plCatH-KLM3’ (oril))中的質(zhì)粒整合到地衣芽孢桿菌基因組 的catH區(qū)中。選擇一個(gè)CmR抗性克隆，并將其命名為BML780-plCatH_KLM3，(oril)。再次 在許可溫度、沒有抗生素的情況下培養(yǎng)BML780-plCatH-KLM3’ (oril)數(shù)代以使載體序列環(huán) 出(loop-out)，隨后選擇一個(gè)對(duì)新霉素敏感(neoQ的CmR克隆。在此克隆中，染色體上的 PlCatH載體序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只留下catH-LATKLM3’盒。隨后，通過 在氯霉素濃度增加的培養(yǎng)基中/上培養(yǎng)菌株來擴(kuò)增染色體上的catH-LATKLM3’盒。在擴(kuò)增 數(shù)輪后，選擇一個(gè)克隆(抗5(^8/1111氯霉素)，并將其命名為81^780-1(00’04 50。為了確 定KLM3’表達(dá)，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有三丁酸甘油酯 的 Heart Infusion (Bacto)瓊脂培養(yǎng)板上于 37°C下培養(yǎng) 48 小時(shí)。在 BML780-KLM3，CAP50 菌落周圍明顯可見澄清的區(qū)域(指示脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性)，而宿主菌株BML780周圍則不 可見(參見圖38)。此結(jié)果顯示在地衣芽孢桿菌株BML780-KLM3’ CAP50中表達(dá)了大量的 KLM3’，且這些KLM3’分子是有功能的。所表達(dá)的KLM3’具有翻譯后截短的序列，其在翻譯 后截短后具有SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。實(shí)施例2使用脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(KLM3’)以降低基于肉的食品(即精膏香腸)的膽固醇含量 (同時(shí)保持或改進(jìn)重量損失、質(zhì)地和脂肪穩(wěn)定性)所測(cè)試的酶 本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有SEQ ID No. 37的KLM3，(3158TrU/g)。 出于比較的目的測(cè)試的來自BioCatalysts，UK的Lipomod 699L (胰酶磷脂酶) (根據(jù)廠商的說明為10，000單位/ml)41
配方表1 精膏肉醬(fine paste meat batter)的配方
權(quán)利要求
1.用于降低基于肉的食品的膽固醇量和/或改進(jìn)其質(zhì)地和/或降低其重量損失和/或 提高其脂肪穩(wěn)定性的方法，所述方法包括a)使肉接觸脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶；b)在約1°C至約70°C之間的溫度下溫育所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉；c)由所述肉生產(chǎn)食品；其中步驟b)在步驟c)之前、期間或之后進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉溫育約1小時(shí)至 24小時(shí)之間。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉在 約1°C至約9 °C之間的溫度下溫育。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉在約 1°C至約6 °C之間的溫度下溫育。
5.如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉溫 育約10小時(shí)至約24小時(shí)之間。
6.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉在 約60°C至約70°C之間的溫度下溫育。
7.如權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求6所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶 接觸的肉在約60°C至約68°C之間的溫度下溫育。
8.如權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉溫 育約30分鐘至約2小時(shí)之間。
9.如權(quán)利要求6、權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶 接觸的肉溫育約1小時(shí)至約1. 5小時(shí)之間。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉和 /或由其獲得的食品進(jìn)一步加熱至一定的溫度并保持足夠的時(shí)間以滅活所述酶。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中將所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉和/或由其獲 得的食品加熱到約80°C至約140°C范圍的溫度。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中要與所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶接觸的肉是 碎肉。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述食品是乳化的肉產(chǎn)品。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述食品包含至少15%的肉。
15.脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶用于生產(chǎn)基于肉的食品的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中技術(shù)效果是與肉未經(jīng)所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的 基于肉的相當(dāng)食品相比，所述基于肉的食品的膽固醇量減少。
17.如權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中技術(shù)效果是以下一種或多種與肉 未經(jīng)所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶處理的基于肉的相當(dāng)食品相比，所述基于肉的食品的質(zhì)地改進(jìn)和 /或重量損失減少和/或脂肪穩(wěn)定性提高。
18.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的特征是其為具有?；D(zhuǎn)移酶活性并包含氨基酸序列基序 GDSX的酶，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S。
19.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中在使用“用于測(cè)定轉(zhuǎn)移酶活性％的方法”測(cè)定時(shí)，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在所述基于 肉的食品中具有至少15%，優(yōu)選至少20%，優(yōu)選至少30%，優(yōu)選至少40%的轉(zhuǎn)移酶活性。
20.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的 應(yīng)用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽是通過表達(dá) 任一以下所示的核苷酸序列或與其具有75%或更高同一性的核苷酸序列獲得的SEQ ID No. 2USEQ ID No. 47,SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50,SEQ ID No. 5USEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 52,SEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35 或 SEQ ID No. 36。
21.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶是具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽是通過表達(dá)以 下序列獲得的a.SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列，或與其具有75%或更高同一性的核苷酸序列；b.編碼所述多肽的核酸，其中所述多肽與SEQID No. 15所示的多肽序列或SEQ ID No. 37所示的多肽序列具有至少70%的同一性；或c.在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與包含SEQID No.沈所示核苷酸序列的核酸探針雜交的核酸。
22.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的 應(yīng)用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含任一以 下所示的氨基酸序列或與其具有75%或更高同一性的氨基酸序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 4USEQ ID No. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 37。
23.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列，或與SEQ ID No. 37具 有95%或更高同一性的氨基酸序列。
24.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID No. 37具有98%或更高同一性的氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。
26.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法或如權(quán)利要求15或權(quán)利要求17所述的應(yīng) 用，其中所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。
27.一種膽固醇含量減少或不含膽固醇的基于肉的食品，其包含至少30%的肉和滅活 的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。
28.通過權(quán)利要求1-14或權(quán)利要求18-27中任一項(xiàng)所述的方法可獲得(例如獲得)的 基于肉的食品。
29.參考實(shí)施例和附圖，基本如本文所定義的方法、應(yīng)用或基于肉的食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降低基于肉的食品的膽固醇量和/或改進(jìn)其質(zhì)地和/或降低其重量損失和/或提高其脂肪穩(wěn)定性的方法，所述方法包括a)使肉接觸脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶；b)在約1℃至約70℃之間的溫度下溫育所述與脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶接觸的肉；c)由所述肉生產(chǎn)食品；其中步驟b)在步驟c)之前、期間或之后進(jìn)行。本發(fā)明還涉及脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在減少基于肉的食品的膽固醇中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23K1/18GK102056498SQ200980120783
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者喬恩·B·索伊, 利夫·斯彭納·克里斯蒂安森, 耶斯佩·坎普 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司