專利名稱：一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿
芙木的方法。
背景技術(shù)：
云南蘿芙木是一種重要的藥用植物，其根中含有利血平、育亨賓、蛇根堿等幾十種 生物堿，是治療高血壓的原料藥；最近幾十年來由于大量挖采作為藥源，野生云南蘿芙木分 別已經(jīng)相當(dāng)稀少。為了滿足國內(nèi)外對蘿芙木原料藥的需求和保護僅有的野生蘿芙木資源， 人工種植蘿芙木具有很好的開發(fā)前景。云南蘿芙木種子繁殖萌發(fā)率低，扦插生根困難，成為 大規(guī)模種植的瓶頸。目前國內(nèi)外關(guān)于云南蘿芙木的組織培養(yǎng)未見其他研究機構(gòu)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法。解決
了云南蘿芙木種子繁殖萌發(fā)率低，扦插生根困難，成為大規(guī)模種植的瓶頸的問題。
—種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法，包括如下步驟 (1)外植體的取材與消毒選取28-32天嫩梢作外植體，剪去葉片留葉柄，清洗、酒
精和升汞消毒，切成0. 8-1. 2cm長的帶芽莖段； (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)將消毒好的帶芽莖段接種在2.0-4.0 mg/L 6-BA+0. 05-0. 1 mg/
L NAA的MS啟動培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生，培養(yǎng)條件為25士2t:，光周期16h/8h，光照強度 1500 20001x，4周后得到4-6cm高的啟動苗; (3)增殖培養(yǎng)將啟動苗的頂芽和帶芽莖段接種在2. 5-5. 0 mg/L 6-BA+0. 1-0. 5
mg/LNAA的MS增殖培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)； (4)生根將增殖培養(yǎng)出的4-6cm高的芽切下轉(zhuǎn)移到1/2MS的生根培養(yǎng)基上進行 生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根激素為1. 0mg/L的NAA、 IBA或兩者的組合；
(5)將生根后的苗進行煉苗與移栽。 所述步驟(1)中的嫩梢來源于春季蘿芙木萌發(fā)的新芽、任何季節(jié)扦插枝條、老 枝打頂所萌發(fā)的嫩芽以及種子萌發(fā)芽。清洗消毒過程具體如下先將外植體用去污劑清 洗20min，再用自來水沖洗2h，在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)70%酒精消毒5_10s和0. 1%升汞消毒 7-10min，無菌水沖洗5-6次。 所述步驟(3)中增殖培養(yǎng)建立的增殖培養(yǎng)體系每4-5周繼代一次，在增殖培養(yǎng)2 周后腋芽開始萌發(fā)，同時在外植體基部產(chǎn)生大量的愈傷組織，并逐漸分化出小芽。4-6周后 芽高可達4-6cm，每個外植體可以產(chǎn)生小芽8-12個。再將4-6cm高的芽直接進行生根誘導(dǎo)。
所述步驟(4)的生根培養(yǎng)基配方中還添加0. 5-lwt^活性炭。
所述步驟(5)具體包括以下煉苗與移栽的過程將生根苗的培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到普通 房間，松開封口膜3天，然后用鑷子將生根苗移出，在自來水下洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有消 毒煉苗基質(zhì)的塑料小缽內(nèi)，澆透水，并用塑料袋套罩在小缽上保持濕度80%以上，于塑料大棚20-3(TC培養(yǎng)；3-4周小苗逐漸適應(yīng)環(huán)境后，移栽到裝有泥土的大缽或野外種植。 所述的煉苗基質(zhì)為珍珠巖河沙泥炭土的重量比為i:i:i的混合物或珍珠 巖泥炭土的重量比為2 : i的混合物。 該發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)外植體采集方便、感染率低；(2)增殖培養(yǎng)通過腋芽和 愈傷組織分化兩種途徑獲得無菌苗，繁殖系數(shù)高；(3)生根率和定植成活率高，遺傳穩(wěn)定性 好。 此方法可以實現(xiàn)快速繁殖云南蘿芙木，為規(guī)模化種植蘿芙木提供優(yōu)質(zhì)種苗。增殖 培養(yǎng)時的增殖系數(shù)為8-12，每4-5周重復(fù)繼代一次，移栽成活率達90%。通過植物組織培 養(yǎng)植株再生可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速繁殖和大規(guī)模種植的目的，該方法已經(jīng)在珍稀花卉、 名貴中藥材的擴大種植和瀕危樹種的拯救方面得到廣泛應(yīng)用。
具體實施例方式
以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而不會限制本發(fā)明。
實施例1 1)外植體的取材與消毒選取1個月左右的嫩梢作外植體，剪去葉片(留葉柄)， 先用去污劑清洗20min，再用自來水沖洗2h，在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)70%酒精消毒8s，0. 1%升 汞消毒10min，無菌水沖洗5-6次，切成lcm左右長的帶芽莖段。 2)誘導(dǎo)培養(yǎng)在超凈工作臺上將消毒好的帶芽莖段接種在MS+6-BA 2.0 mg/ L+NAAO. 05mg/L的啟動培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生，培養(yǎng)條件為25。C，光周期16h/8h，光照強 度20001x，4周后得到4-6cm高的啟動苗。 3)增殖培養(yǎng)以啟動苗的頂芽和帶芽莖段作外植體，接種在MS+6-BA 2.5 mg/ L+NAAO. lmg/L增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟。2周后腋芽開始萌發(fā)，同時在外植 體基部產(chǎn)生大量的愈傷組織，并逐漸分化出小芽。4-6周后芽高可達4-6cm，每個外植體可 以產(chǎn)生小芽6-7個。經(jīng)此建立的增殖培養(yǎng)體系每4-5周繼代一次，同時較高的芽也可以直 接進行生根誘導(dǎo)。 4)生根將4-6cm高的試管苗切下轉(zhuǎn)移到1/2 MS的生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根激素 為NAAl. 0mg/L，2周后開始生根。5_6周后100%生根，在生根培養(yǎng)基中添加1%的活性炭使 生根提前一周。 5)煉苗與移栽將生根苗的培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到普通房間，松開封口膜3天，然后用鑷 子將生根苗小心移出，在自來水下洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有消毒煉苗基質(zhì)的塑料小缽內(nèi)，澆 透水，并用塑料袋套罩在小缽上保持濕度80%以上，于塑料大棚25t:培養(yǎng)。2周后小苗開始 轉(zhuǎn)綠抽新葉，3-4周小苗逐漸適應(yīng)環(huán)境后，移栽到裝有泥土的大缽或野外種植，成活率可達 90%。成活的植株與實生苗無差異，完全保持母本的遺傳特征。
實施例2 具體實施過程同實例1。其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 3. 0 mg/L+NAA0. lmg/L ; 增殖培養(yǎng)基配方同誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為MS+6-BA 3.0+NAA 0. 3mg/L ;增殖系數(shù)8_10，生根培養(yǎng)基 配方為1/2 MS+IBA 1. Omg/L ;生根率90%以上；移栽成活率達90%。
實施例3 具體實施過程同實例1 。其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA4. 0+NAA0. lmg/L ;增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 5.0+NAA 0. 5mg/L ;增殖系數(shù)10-12 ;生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+NAAO. 5+IBA 0. 5mg/L ;生根率100% ;移栽成活率達90%。
權(quán)利要求
一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法，其特征是，包括如下步驟(1)外植體的取材與消毒選取28-32天嫩梢作外植體，剪去葉片留葉柄，清洗、酒精和升汞消毒，切成0.8-1.2cm長的帶芽莖段；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)將消毒好的帶芽莖段接種在2.0-4.0 mg/L 6-BA+0.05-0.1 mg/L NAA的MS啟動培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生，培養(yǎng)條件為25±2℃，光周期16h/8h，光照強度1500～2000lx，4周后得到4-6cm高的啟動苗；(3)增殖培養(yǎng)將啟動苗的頂芽和帶芽莖段接種在2.5-5.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L NAA的MS增殖培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)；(4)生根將增殖培養(yǎng)出的4-6cm高的芽切下轉(zhuǎn)移到1/2MS的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根激素為1.0mg/L的NAA、IBA或兩者的組合；(5)將生根后的苗進行煉苗與移栽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是，所述步驟(1)中的嫩梢來源于春季蘿芙木萌 發(fā)的新芽、任何季節(jié)扦插枝條、老枝打頂所萌發(fā)的嫩芽以及種子萌發(fā)芽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是，所述步驟(1)中的清洗消毒過程具體如 下先將外植體用去污劑清洗20min，再用自來水沖洗2h，在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)70X酒精消毒 5-10s和0. 1%升滎消毒7-10min，無菌水沖洗5_6次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(3)中增殖培養(yǎng)建立的增殖培養(yǎng)體 系每4-5周繼代一次，4-6cm高的芽直接進行生根誘導(dǎo)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是，所述步驟(4)的生根培養(yǎng)基配方中還添加 0. 5-lwt^活性炭。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是，所述步驟(5)具體包括以下煉苗與移栽的過 程將生根苗的培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到普通房間，松開封口膜3天，然后用鑷子將生根苗移出，在 自來水下洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有消毒煉苗基質(zhì)的塑料小缽內(nèi)，澆透水，并用塑料袋套罩在 小缽上保持濕度80%以上，于塑料大棚20-3(TC培養(yǎng)；3-4周小苗逐漸適應(yīng)環(huán)境后，移栽到 裝有泥土的大缽或野外種植。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的煉苗基質(zhì)為珍珠巖河沙泥炭土的重量比為i:i:i的混合物或珍珠巖泥炭土的重量比為2 : i的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖云南蘿芙木的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該方法分為誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗四個階段。以蘿芙木嫩枝帶芽莖段作外植體，經(jīng)消毒后接種在啟動培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生，啟動培養(yǎng)基組成為MS+2.0-4.0mg/LBA+0.05-0.1mg/LNAA。增殖培養(yǎng)MS+2.5-5.0mg/LBA+0.1-0.5mg/LNAA，增殖系數(shù)為8-12，每4-5周重復(fù)繼代一次。生根培養(yǎng)基為添加1.0mg/LNAA或IBA或NAA+IBA＝1.0mg/L的1/2MS培養(yǎng)基，5-6周后將生根苗移栽到煉苗基質(zhì)中，20-30℃保濕遮陰煉苗3-4周轉(zhuǎn)栽或大田種植，成活率達90％。此發(fā)明方法操作簡單，繁殖速度快，遺傳穩(wěn)定性好，為工廠化育苗提供技術(shù)支撐。
文檔編號A01H4/00GK101731149SQ200910312129
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者徐慶軍, 曹福祥, 黃鐵堅, 龍絳雪 申請人:中南林業(yè)科技大學(xué)