專利名稱：文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。背景技術(shù)：
文冠果(fa/^力oce^ss幼j力/Z^ia Bunge.)又名木瓜、文登閣、僧燈毛道，隸屬于無患子科 (Sapindaceae)，文冠果屬Cfe/7^wcaras)，為單種屬，落葉喬木或灌木，原產(chǎn)我國北方，分布在秦嶺、淮 河以北，內(nèi)蒙古以南，東起遼寧，兩至青海，南至河南及江蘇北部。文冠果綜合利用價值高，除在鹽堿地 或積水澇洼地外，到處都能生長，是綠化荒山的先鋒樹種；根系發(fā)達(dá)、根萌蘗性強(qiáng)，是水上保持及防沙改 造環(huán)境的優(yōu)良樹種；文冠果種子含油率3(m、種仁含油率高達(dá)60%,是-種中國特有的木本油料植物，有北 方油茶之稱；其種子油經(jīng)轉(zhuǎn)脂化反應(yīng)可生產(chǎn)生物柴油，是國家林業(yè)局推薦的四種木本生物能源植物之一； 文冠果油富含不飽和脂肪酸，營養(yǎng)價值豐富，可生產(chǎn)高檔食用保健油；其木材紋理致密、結(jié)實(shí)耐用，是家 具、農(nóng)具和手工藝品的好原料；樹枝樹葉入藥可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，具有很好的藥用價值；花色品種多 樣且好看，開花時間相對較長，是珍貴的園林綠化樹種和蜜源植物；根黃色，可以代替染料染布，所以文 冠果具有廣泛的應(yīng)用價值和開發(fā)前景。
植物組織培養(yǎng)的生物學(xué)原理是植物細(xì)胞"全能性"及植物的"再生作用"理論。1902年，德國著名植 物學(xué)家G. Haberlanch根據(jù)細(xì)胞學(xué)理論，提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直到單個細(xì)胞，且 植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛力的觀點(diǎn)。1943年，美國人Wnte 在煙草愈傷組織培養(yǎng)中，偶然發(fā)現(xiàn)形成一個芽，證實(shí)了G. Haberlanch的論點(diǎn)。在許多科學(xué)家的努力下， 植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，其理論和方法趨于完善和成熟，并廣泛應(yīng)用產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和 社會效益。
傳統(tǒng)組培過程繁雜的技術(shù)環(huán)節(jié)，都是圍繞防止污染而制定的，控制污染成了組培中的首要技術(shù)，不能 把污染率降低到可以接受的范圍，也就意味著這項(xiàng)工藝不能進(jìn)行下去。而影響污染的因素多種多樣，如外 植體的種類、取材的季節(jié)、時間、預(yù)處理方法、消毒藥劑的種類、濃度、消毒時間以及消毒方法、培養(yǎng)基 和器皿滅茵、操作人員、工作環(huán)境的要求、超凈工作臺的工作質(zhì)量等都與污染密切相關(guān)，因此，使得污染 問題十分復(fù)雜，也很難防治，成為限制組培產(chǎn)業(yè)化的重要原因之一。
組培過程中的污染，主要表現(xiàn)為培養(yǎng)基的污染，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基為細(xì)菌、真菌提供了適宜的滋生場 所。因此，只要將培養(yǎng)基改造成即保證植物組織正常生長，又具有殺菌、抗菌功能的培養(yǎng)基，菌類一旦失 去滋生場所，就不會對組培過程造成危害。解決了污染問題，使組培過程脫離嚴(yán)格的無菌環(huán)境，從根本上 簡化組培環(huán)節(jié)，進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)是完全可能的。而改造培養(yǎng)基的關(guān)鍵是要找到一種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜性殺菌劑。
長期以來，對常用抗生素、抗菌素、防腐劑做了大暈單一或組合添加到培養(yǎng)基中的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明， 它們在植物組培污染的防治方面有一定的作用，但是針對不同的植物品種要想找到一種廣譜性的處理組合 是比較困難的，往往是當(dāng)培養(yǎng)基抗菌，植物組織的生長將受到抑制；植物組織正常生長，就無法獲得滿意 的抗菌效果。這也是國內(nèi)外專家學(xué)者普遍遇到的、無法逾越的障礙。其原因一是還沒有一種抗生素對所有 的細(xì)菌都有效，而且藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效濃度下，其殺菌、抗菌離子對植物組織直 接產(chǎn)生傷害，有些則產(chǎn)生鹽害。針對抗菌藥劑篩選中的問題，只有選擇與植物組織親和、友好，藥效期長 (至少一個生長周期)，不產(chǎn)生鹽害并具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì)，才是唯一出路。為此，我們運(yùn)用辨證的 中醫(yī)理論，遵循中藥藥性配伍的君、臣、佐、使原則，從多種植物中提取具有殺菌、抗菌活性物質(zhì)，成功 研制出了具有廣譜性殺菌能力的抑生素，并對其有效濃度和使用方法作了大量探索性試驗(yàn)。
植物開放式組織培養(yǎng)，是在開放的、相對無菌的環(huán)境中進(jìn)行接種的，培養(yǎng)基通過附加抑生素來代替高 壓滅菌，因此，在培養(yǎng)基內(nèi)加入適宜濃度的抑生素是至關(guān)重要的。我們的試驗(yàn)證明，，只要對接種室進(jìn)行 較為徹底的消毒殺菌，培養(yǎng)基中抑生素濃度在O. 06%以上，就能夠有效防止開放接種環(huán)境下，由于散落 到培養(yǎng)基上的真菌孢子引起的污染。
隨后，我們做了抑生素對培養(yǎng)基人工接菌有效濃度試驗(yàn)，，隨著抑生素濃度的增大，對真菌的殺滅作 用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)抑生素濃度為O. 15%時，真菌存活率為0。但在此的范圍內(nèi)，對某些細(xì)菌的殺滅效果不明 顯，但濃度從O. 15%升到0. 19V。時，細(xì)菌的存活率迅速下降，說明抑生素對細(xì)菌團(tuán)的有效殺滅濃度為O. 19 % ，由此確定外植體接種培養(yǎng)基的抑生素濃度為0.2%。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用開放式組培技術(shù)對文冠果組培繁殖技術(shù)進(jìn)行了改良，創(chuàng)造了一種簡易的開放式文冠果組織 培養(yǎng)技術(shù)，脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，利用塑料杯代替組培瓶，在自然、開 放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)，從根本上簡化組培環(huán)節(jié)，降低了組培成本。
四具體實(shí)施例方式
1、 初代培養(yǎng)(外植體誘導(dǎo)、無菌體系建立)
在晴天取文冠果萌芽條的半木質(zhì)化莖段，剪掉葉片，用塑料薄膜包回，用流水和洗衣粉反復(fù)沖洗干凈， 將材料修剪成3—4cm的莖斷，帶1 2個腋芽，放入燒杯中，加入洗衣粉，用紗布封口后，流水沖洗l一2h, 將沖洗后的莖斷，浸泡于濃度為錢的抑生素溶液中。培養(yǎng)基用MS0，其中糖30g/L，瓊脂粉4g/L,另加入 一定濃度的抑生素代替高壓滅菌。培養(yǎng)室中白天溫度(26士2rC ，夜間溫度(20土2)'C, —天光照時間16h， 光源采用白熾日光燈。接種后7大腋芽開始腫漲萌動，25天后，腋芽長至l-2on長。
2、 繼代培養(yǎng)(增殖培養(yǎng)、擴(kuò)繁培養(yǎng))
5將初代培養(yǎng)的腋芽切下，接入繼代培養(yǎng)基上，原來的莖段不用，經(jīng)過5-6次繼代培養(yǎng)，形成5-IO個叢 生芽結(jié)構(gòu)，28 30T下，以20天為一個繼代周期。繼代培養(yǎng)基以MS+6BA(0.8mg / L)+KT(0.8mg / L)+NAA(0.01mg/L)+糖(30mg/L)+抑生素(4g/L)為宜。培養(yǎng)過程中，以散射光為最好，這樣芽體粗狀， 過強(qiáng)直射光苗易老化，過弱的光芽易徒長，芽體細(xì)弱，易玻璃化。
3、 生根培養(yǎng)
無菌芽經(jīng)過不斷繼代培養(yǎng)，達(dá)到一定基數(shù)時，即可進(jìn)行生根培養(yǎng)，以獲得完整植株。具體把繼代苗中 較粗壯，木質(zhì)化較好的單芽切下， 一瓶接20個芽，接入生根培養(yǎng)基上，余下的綠芽接入繼代培養(yǎng)基上。生 根培養(yǎng)基以l/2MS+TBA(1.5mg/L)+NAA(0. 5mg/L)十糖(20g/L)+抑生素(4g/L)。切生根芽時，利用1.5cm 頂芽，不用第二節(jié)芽，這樣的生根瓶苗整齊，出根率高。出根時間與溫度有很大關(guān)系，溫度28。C左右時， 第6天根原基凸露，此時可搬至煉苗棚接受自然光煉苗，15天左右，葉片舒張，莖葉略帶紅色，植株健壯， 這樣可以明顯提高瓶苗質(zhì)量，提高上袋成活率。
4、 煉苗與移栽
將生根的試管苗移到遮蔭度為50%的自然條件下煉苗15—20大，取出組培苗，用自來水沖洗干凈基部 的培養(yǎng)基，放入O. 1-0.5g/L的高錳酸鉀溶液中浸泡卜3 min，再用6來水沖洗一遍，蓋上濕毛巾保濕以備 移栽。在試管苗移栽至營養(yǎng)袋前，先用3-5 g/L的高錳酸鉀溶液消毒裝有基質(zhì)的營養(yǎng)袋，再將清洗后的試 管苗直接移栽到營養(yǎng)袋中。移栽后及時淋透定根水。并蓋上塑料薄膜。 一周后逐漸打開塑料薄膜，同時注 意溫度濕度的控制，以此移栽成活率可達(dá)90%以上。當(dāng)營養(yǎng)袋中的小苗長至15cra即可出圃大田造林或培植 為采穗母株。
5、 培養(yǎng)容器的選擇
傳統(tǒng)組培中，培養(yǎng)容器需選擇耐高溫高壓的玻璃瓶和聚丙烯封口膜。而在開放組培中，釆用培養(yǎng)基附 加抑生素代替高壓滅菌，因此，培養(yǎng)容器的選擇范圍較大。本發(fā)明中，我們選用一次性塑料口杯作為培養(yǎng) 容器，用PE保鮮膜封口。由于培養(yǎng)杯透光性和透氣性較好，植物在培養(yǎng)杯中，生長健壯，分化和生根明顯 優(yōu)于傳統(tǒng)組培方式。
6、 接種器具的滅菌
傳統(tǒng)組培中，接種用的剪子、鑷子、刀片等均采用高壓滅菌或酒精燈灼燒滅菌，而在開放組培中，接 種器具用75%酒精擦洗后，放在20X抑生素溶液浸泡lh，接種過程始終浸泡在抑生素溶液中，就可有效的 防止由于接種器具引發(fā)的污染。對高壓滅菌、酒精燈灼燒滅菌和抑生素浸泡滅菌的接種器具，作了大量傳 統(tǒng)接種對比試驗(yàn)。，高濃度的抑生素具有較強(qiáng)的殺菌作用，對接種器具的滅菌效果顯著，濃度越高滅菌效 果越好，當(dāng)濃度為20%時，污染率已降到了3.3%，用20%的抑生素對接種器具的浸泡滅菌，可以有效防 止由于接種器具引起的污染。7、 接種方法
在相對干凈的接種室內(nèi)，用75%的酒精將接種臺面和手擦干凈，揭開封口膜一角，用已滅菌的接種器 具，把植物接種到培養(yǎng)基，然后再將杯口封嚴(yán)即可。
8、 室內(nèi)培養(yǎng)
將己接好的植物材料置于培養(yǎng)架培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，定期對培養(yǎng)室進(jìn)行滅菌，及時清理污染苗，保持 一個相對干凈的培養(yǎng)環(huán)境。
9、 開放組培與傳統(tǒng)組培技術(shù)環(huán)節(jié)對照與成本分析
開放組培省去了高壓滅菌和超凈工作臺接種，簡化了組培環(huán)節(jié)，開放式組培方式和傳統(tǒng)組培方式技術(shù) 環(huán)節(jié)對照見說明書附圖
，說明書附圖是開放式組培與傳統(tǒng)組培流程對比圖。
由于制備抑生素的中藥材料資源豐富，生產(chǎn)工藝簡單，外植體和器具滅菌液能重復(fù)利用，綜合考慮開 放組培與傳統(tǒng)組培成本，包括基礎(chǔ)建設(shè)，試驗(yàn)設(shè)備及損耗，水電費(fèi)用，工人工資，環(huán)境維護(hù)等，開放組培 與傳統(tǒng)組培相比能夠節(jié)省成本60%左右。
權(quán)利要求
1、文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于包括以下步驟初代培養(yǎng)(外植體誘導(dǎo)、無菌體系建立)、繼代培養(yǎng)(增殖培養(yǎng)、擴(kuò)繁培養(yǎng))、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽、培養(yǎng)容器的選擇、接種器具的滅菌、接種方法、室內(nèi)培養(yǎng)。
2、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于初代培養(yǎng)時，在晴天取文冠果萌芽條的半木質(zhì)化莖段，剪掉葉片，用塑料薄膜包回，用流水和洗衣粉反復(fù)沖洗干凈，將材料修剪成3--4cm的莖斷，帶1 2個腋芽，放入燒杯中，加入洗衣粉，用紗布封口后，流水沖洗l一2h,將沖洗后的莖斷，浸泡于濃度為4%的抑生素溶液屮。培養(yǎng)基用MS0，其屮糖30g/L，瓊脂粉4g/L，另加入一定濃度的抑生素代替高壓滅菌。培養(yǎng)室中白天溫度(26士2rC ，夜間溫度(20土2)'C， 一天光照時間16h,光源采用白熾日光燈。接種后7天腋芽開始腫漲萌動，25天后，腋芽長至l-2crn長。
3、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于繼代培養(yǎng)(增殖培養(yǎng)、擴(kuò)繁培養(yǎng)〉時，將初代培養(yǎng)的腋芽切下，接入繼代培養(yǎng)基上，原來的莖段不用，經(jīng)過5-6次繼代培養(yǎng)，形成5-10個叢生芽結(jié)構(gòu)，28 3(TC下，以20天為一個繼代周期。繼代培養(yǎng)基以MS+6BA(0. 8mg / L)+KT(0. 8呢/U+NAA(0.01mg/L)+糖(30mg/L)+抑生素(4g/L)為宜。培養(yǎng)過程中，以散射光為最好，這樣芽體粗狀，過強(qiáng)直射光苗易老化，過弱的光芽易徒長，芽體細(xì)弱，易玻璃化。
4、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于生根培養(yǎng)時，無菌芽經(jīng)過不斷繼代培養(yǎng)，達(dá)到一定基數(shù)時，即可進(jìn)行生根培養(yǎng)，以獲得完整植株。具體把繼代苗中較粗壯，木質(zhì)化較好的單芽切下， 一瓶接20個芽，接入生根培養(yǎng)基上，余下的綠芽接入繼代培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基以l/2MS+IBA(1.5mg/L)+NAA(0. 5mg/U+糖(20g/L)+抑生素(4g/L)。切生根芽時，利用1.5cm頂芽，不用第二節(jié)芽，這樣的生根瓶苗整齊，出根率高。出根時間與溫度有很大關(guān)系，溫度28t左右時，第6天根原基凸露，此時可搬至煉苗棚接受自然光煉苗，15天左右，葉片舒張，莖葉略帶紅色，植株健壯，這樣可以明顯提高瓶苗質(zhì)量，提高上袋成活率。
5、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于煉苗與移栽時，將生根的試管苗移到遮蔭度為50%的自然條件下煉苗15—20天，取出組培苗，用自來水沖洗干凈基部的培養(yǎng)基，放入O. l-0.5g/L的高錳酸鉀溶液中浸泡l-3 niin，再用自來水沖洗一遍，蓋上濕毛巾保濕以備移栽。在試管苗移栽至營養(yǎng)袋前，先用3-5 g/L的高錳酸鉀溶液消毒裝有基質(zhì)的營養(yǎng)袋，再將清洗后的試管苗直接移栽到營養(yǎng)袋中。移栽后及時淋透定根水。并蓋上塑料薄膜。 一周后逐漸打開塑料薄膜，同時注意溫皮濕度的控制，以此移栽成活率可達(dá)90%以上。當(dāng)營養(yǎng)袋中的小苗長至15cra即可出圃大田造林或培植為采德母株。
6、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于培養(yǎng)容器的選擇，傳統(tǒng)組培中，培養(yǎng)容器需選擇耐高溫高壓的玻璃瓶和聚丙烯封口膜。而在開放組培中，釆用培養(yǎng)基附加抑生素代替高壓滅菌，因此，培養(yǎng)容器的選擇范圍較大。本發(fā)明中，我們選用一次性塑料口杯作為培養(yǎng)容器，用PE保鮮膜封口。由于培養(yǎng)杯透光性和透氣性較好，植物在培養(yǎng)杯中，生長健壯，分化和生根明顯優(yōu)于傳統(tǒng)組培方式。
7、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于接種器具的滅菌，傳統(tǒng)組培中，接種用的剪子、鑷子、刀片等均采用高壓滅菌或酒精燈灼燒滅菌，而在開放組培中，接種器具用75%酒精擦洗后，放在20X抑生素溶液浸泡lh，接祌過程始終浸泡在抑生素溶液中，就可有效的防止由于接種器具引發(fā)的污染。對高壓滅菌、酒精燈灼燒滅菌和抑生素浸泡滅菌的接種器具，作了大量傳統(tǒng)接種對比試驗(yàn)。，高濃度的抑生素具有較強(qiáng)的殺菌作用，對接種器具的滅菌效果顯著，濃度越高滅菌效果越好，當(dāng)濃度為20%時，污染率己降到了3.3%，用20%的抑生素對接種器具的浸泡滅菌，可以冇效防止由于接種器具引起的污染。
8、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于接種方法，在相對干凈的接種室內(nèi)，用75%的酒精將接種臺面和手擦干凈，揭開封口膜一角，用己滅菌的接種器具，把植物接種到培養(yǎng)基，然后再將杯口封嚴(yán)即可。
9、 如權(quán)利要求l所述的文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，其特征在于室內(nèi)培養(yǎng)方法，將已接好的植物材料置于培養(yǎng)架培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，定期對培養(yǎng)室進(jìn)行滅菌，及時清理污染苗，保持一個相對干凈的培養(yǎng)環(huán)境。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及文冠果的一種開放式組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。本發(fā)明不僅提供了文冠果的植物組織培養(yǎng)技術(shù)步驟，同時，利用開放式組培技術(shù)對文冠果組培繁殖技術(shù)進(jìn)行了改良，創(chuàng)造了一種簡易的開放式文冠果組織培養(yǎng)技術(shù)，脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，利用塑料杯代替組培瓶，在自然、開放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)，從根本上簡化組培環(huán)節(jié)，降低了組培成本。
文檔編號A01H4/00GK101642051SQ20091008812
公開日2010年2月10日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者孫仲序, 董鳳亮, 馬海淵 申請人:北京金桐福綠色能源科技有限公司