專利名稱：：草魚的雌核發(fā)育方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種魚類的培育和養(yǎng)殖方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種草魚的培育方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：草魚(Ctow/^"o/wgo^"/A//w1y)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一，由于其容易感染出血、腸炎、爛鰓、赤皮等傳染性疾病，導(dǎo)致魚種成活率不高。近年來，不少學(xué)者針對草魚抗病能力差這一問題，通過傳統(tǒng)的雌核發(fā)育方法，采用滅活的鯉魚精子等激活草魚卵子，再經(jīng)過染色體的加倍處理，在篩選具有抗病能力強(qiáng)這一優(yōu)良性狀的草魚個(gè)體方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)并初步論證了雌核發(fā)育草魚的生物學(xué)抗病基礎(chǔ)。但到目前為止，由于雌核發(fā)育操作過程容易損傷草魚卵子，以及精子滅活不適度、單倍體卵子二倍化處理不當(dāng)?shù)榷喾N原因，導(dǎo)致了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚孵化率和成活率不高，誘導(dǎo)方法成本高且過程復(fù)雜，至今沒有大規(guī)模建立雌核發(fā)育草魚純系群體的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了多種草魚的雌核發(fā)育方法以及用該雌核發(fā)育方法制備的草魚進(jìn)行應(yīng)用的方法，本發(fā)明的方法不僅大大提高了雌核發(fā)育二倍體草魚的孵化率和存活率，而且簡化了制備工藝，能制備出性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的雌核發(fā)育草魚群體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種草魚的雌核發(fā)育方法，該方法是以適度滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子為刺激源，刺激草魚成熟卵子，激活后2~3min用4'C6t)的水冷休克處理1012min，然后經(jīng)流水控溫孵化，制備得到抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚。上述技術(shù)方案中，所述異源四倍體鯽鯉(4n=200)的原始母本為紅鯽(CaraM/MaMra加swc/va。，原始父本為鯉魚(q^n'm^cw/7/0)。四倍體鯽鯉兩性能育，且分別能產(chǎn)生二倍體卵子和二倍體精子，兩者交配保證了四倍體性能代代相傳，目前己經(jīng)繁殖到F18，形成了遺傳性狀穩(wěn)定的四倍體魚新種群。雄性四倍體鯽鯉產(chǎn)生二倍體精子，該二倍體精子已經(jīng)通過sox-HMGDNA片段分析被證明為異源精子，既含有紅鯽的遺傳片段，又含有鯉魚的遺傳片段。我們還進(jìn)行了長期的有性雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明以草魚為母本，異源四倍體鯽鯉為父本的雜交組合不能獲得成活魚苗，雜交苗往往在發(fā)育過程中保持明顯區(qū)別于草魚胚胎的外形(如圖1中B圖所示)，如胚胎不同程度的呈現(xiàn)畸形、胚體卵黃囊一直保持圓球形等特征(正常草魚苗卵黃囊隨胚體發(fā)育拉長)，發(fā)育到攝食期即被淘汰。因此，以異源四倍體鯽鯉產(chǎn)生的精子可以作為異源精子刺激源，誘導(dǎo)草魚雌核發(fā)育，但不會(huì)產(chǎn)生存活雜交苗影響后期的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)和觀察；另外，經(jīng)適度滅活后的異源四倍體鯽鯉精子激活但不經(jīng)過染色體加倍處理的雌核發(fā)育草魚胚胎患有明顯的單倍體綜合癥，也不能發(fā)育到攝食期。因此，如果在經(jīng)過二倍化處理的試驗(yàn)中有發(fā)育到攝食期的魚苗(見圖1中A圖)，即可確定為雌核發(fā)育二倍體草魚?？梢?，上述本發(fā)明的技術(shù)方案大大提高了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚的孵化率和成活率，為大規(guī)模、高效率、大批量制備雌核發(fā)育草魚純系群體開辟了新的途徑。基于上述相同的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了另一種技術(shù)方案，也是一種草魚的雌核發(fā)育方法，該方法是以適度滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子為刺激源，刺激草魚成熟卵子，受精后20~22min用4。C6'C水冷休克處理1012min，然后再經(jīng)流水控溫孵化，制備得到抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚。與上述的第一種技術(shù)方案相比，本技術(shù)方案主要是在激活后受精的時(shí)間上作了調(diào)整，同樣能得到一種雌核發(fā)育草魚。上述的各個(gè)技術(shù)方案中，所述滅活的具體操作優(yōu)選為先用Hank's液稀釋異源四倍體鯽鯉的精液，再通過紫外線滅活，滅活程度以鏡檢時(shí)精子尾部擺動(dòng)減弱且80%~90%的精子仍具有良好的游動(dòng)活力為標(biāo)準(zhǔn)。異源四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體精子包含紅鯽跟鯉魚兩套染色體組，頭部明顯比普通二倍體鯉魚產(chǎn)生的精子要大，在經(jīng)紫外線照射滅活過程中，在顯微視野下更容易判斷被照射精子的滅活程度，一般可以前述的鏡檢精子尾部擺動(dòng)較滅活前稍有減弱且80%~卯％的精子仍具有良好的游動(dòng)活力為標(biāo)準(zhǔn)?？梢?，異源四倍體鯽鯉精子是一種既具備遺傳篩選標(biāo)記又易于控制精子適度滅活的適用于草魚雌核發(fā)育操作的優(yōu)良刺激源。所述紫外線滅活時(shí)優(yōu)選使用的是15W的紫外燈，所述紫外燈與所述精液的距離優(yōu)選為10~12cm，所述紫外燈的照射時(shí)間優(yōu)選為2030min。用上述紫外線照射處理的方式進(jìn)行滅活，時(shí)間較鯉魚更短，在批量處理精液時(shí)更容易掌握。用該處理方式滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子激活草魚卵子，不產(chǎn)生雜交魚苗，"異精"效益更加明顯，誘導(dǎo)效果非常好。上述的各個(gè)技術(shù)方案中，所述流水控溫孵化時(shí)的溫度優(yōu)選為21°C~26°C。上述方法制備的雌核發(fā)育草魚群體全部為雌性，由于刺激源為鯽鯉雜交二倍體精子，其產(chǎn)生的"異精"效益有利于篩選優(yōu)質(zhì)高效的雌核發(fā)育抗病草魚。作為上述各技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，可以用上述各雌核發(fā)育方法制備得到的雌核發(fā)育草魚與性反轉(zhuǎn)的雌核發(fā)育草魚純系進(jìn)4行自交，從而使所述雌核發(fā)育草魚的優(yōu)良性狀能夠穩(wěn)定地遺傳。作為上述各技術(shù)方案的進(jìn)一步改迸，本發(fā)明還提出了一種以上述各雌核發(fā)育方法制備得到的雌核發(fā)育草魚作為母本、以普通草魚作為父本(雌核發(fā)育草魚？x普通草魚^)進(jìn)行雜交的方法。通過該雜交方法能夠獲得生長速度快、抗病能力強(qiáng)的雌核發(fā)育草魚后代F1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要在于首先，大大提高了雌核發(fā)育二倍體草魚的孵化率和存活率；其次，本發(fā)明方法中所使用的精子為異源四倍體鯽鯉二倍體精子，具有更好的"異精"效益；再次，異源四倍體鯽鯉二倍體精子用紫外線照射處理所需要的時(shí)間較鯉魚精子短，便于對大量精子進(jìn)行批量處理；最后，鑒別雌核發(fā)育二倍體的方法非常簡單，遠(yuǎn)緣雜交體及單倍體在外形上可區(qū)別于雌核發(fā)育二倍體，且均不能存活至攝食期，確保了存活個(gè)體均為雌核發(fā)育二倍體。本發(fā)明提出的適度控制精子滅活以及減少卵子質(zhì)量受損的人工雌核發(fā)育方法，可以顯著提高人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚生產(chǎn)效率，解決了雌核發(fā)育抗病草魚在大規(guī)模推廣應(yīng)用中的親魚瓶頸問題，為大規(guī)模建立雌核發(fā)育草魚純系群體、同時(shí)也為相關(guān)生物學(xué)理論研究提供了重要的群體基因庫。本發(fā)明的方法在雌核發(fā)育草魚優(yōu)良苗種繁殖、性別控制和全雌育種上具有重大應(yīng)用價(jià)值和廣闊的推廣應(yīng)用前景。圖1為雌核發(fā)育草魚苗與雜交苗外形圖對比；其中A為雌核發(fā)育草魚苗外形圖，B為雜交苗外形圖2為本發(fā)明實(shí)施例中制備的雌核發(fā)育草魚的照片；其中A圖為4月齡的抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚，B圖為4月齡的抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中制備的雌核發(fā)育草魚染色體圖；其中A圖為抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚染色體(2n=48)，圖中箭頭所示為微小染色體(microchromosome),B圖為抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚染色體(2n=48)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明草魚的雌核發(fā)育方法，具體按以下步驟實(shí)施-1、精子滅活擠出達(dá)到性成熟的異源四倍體鯽鯉精液于培養(yǎng)皿中，用Hank's液稀釋精液，Hank's液與精液的體積比為4:1，稀釋的精液在培養(yǎng)皿中以薄層分布，把盛精液的培養(yǎng)皿放在墊有冰袋的搖床上進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速為40~50r/min,并置于兩支功率分別為15W的紫外燈下照射處理，紫外燈與精液的距離為10~12cm，照射時(shí)間為2030min，鏡檢時(shí)精子尾部擺動(dòng)減弱且80%~卯％的精子仍具有良好的游動(dòng)活力，此時(shí)將滅活好的精液避光置于4。C冰箱中保存。Hank's液的配方如下KCL0.40g、NaCl8.00g、NaHC030.35g、KH2P040.06g、Na2HP04*7H200.09g、Na2HP04'12H200.10g、MgS04*7H200.10g、MgCl2.6H200.10g、CaCl20.14g和葡萄糖(Glucose)l.OOg;加蒸餾水配至1L。2、卵子激活將步驟1中經(jīng)紫外線照射處理過的精液與草魚成熟卵子混合，并用干凈的鵝毛將其充分?jǐn)嚢杌靹颍琹min內(nèi)加入清水，并開始計(jì)算受精激活時(shí)間，卵子激活率可達(dá)90%以上。3、染色體加倍處理本實(shí)施例采用冷休克方法抑制第二極體排出和抑制第一次卵裂使激活卵染色體恢復(fù)二倍性。通過設(shè)置溫度梯度和處理時(shí)間對比試驗(yàn)(見表1和表2)，獲得了最佳的工藝處理參數(shù)，艮P:激活后23min，用4'C6。C水冷休克處理1(M2min,以抑制第二極體排出，激活卵子過原腸率可達(dá)60%以上，雌核發(fā)育草魚出苗率可達(dá)40%以上；或者，受精后2022min，用4'C6'C水處理1(M2min，以抑制第一次卵裂，激活卵子過原腸率可達(dá)50%以上，雌核發(fā)育草魚出苗率可達(dá)10%。表l:不同冷休克溫度對草魚雌核發(fā)育誘導(dǎo)效果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2:不同冷休克處理時(shí)間對草魚雌核發(fā)育誘導(dǎo)效果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表注上表1和表2中，過原腸率=過原腸期的胚胎數(shù)/總卵數(shù)><100%;成活率=攝食期的正常苗數(shù)/總卵數(shù)><100%。4、流水控溫孵化將經(jīng)過雌核發(fā)育處理的卵放入孵化桶中進(jìn)行流水控溫孵化，水流速度以卵子能在桶中飄游，既不會(huì)沉入桶底，又不會(huì)被水流沖破卵膜為度。孵化溫度控制在2rC26'C范圍內(nèi)。5、孵化及養(yǎng)殖孵化到鰾充氣期的魚苗即可下到消毒培水后的水泥池塘進(jìn)行前期飼養(yǎng)，兩月后轉(zhuǎn)至土池飼養(yǎng)。通過上述草魚的雌核發(fā)育方法成功獲得了來自同一草魚母本的抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚群體2000尾(見圖2中的A圖)和抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚群體500尾(見圖2中的B圖)。用腎細(xì)胞直接制片法對一齡幼魚染色體數(shù)目進(jìn)行了檢測。腎細(xì)胞直接制片法的方法為在18'C22'C水溫下培育實(shí)驗(yàn)魚l3d后，對實(shí)驗(yàn)魚注射PHA13次，每次劑量為28Kig/克體重，間隔時(shí)間為1224h，在解剖取材前24h，注射秋水仙素，劑量為2"4pg/克體重。取出腎組織，在生理鹽水下剪碎腎組織，0.075mol/LKC1低滲處理，在2(TC溫度下低滲4060min;用l:3的冰醋酸甲醇的混合液固定腎細(xì)胞13次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色。結(jié)果表明抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚(見圖3中的A圖)和抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚(見圖3中的B圖)染色體數(shù)都為211=48。并且在雌核發(fā)育草魚染色體分裂相中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)微小染色體(如圖3中A圖的箭頭所示)，該微小染色體可能導(dǎo)致"異精"效益。大批量不同發(fā)育時(shí)期性腺石蠟切片結(jié)果表明抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚和抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚均為雌性，為全雌群體。石蠟切片方法為每月隨機(jī)取48尾雌核發(fā)育草魚的性腺用Bouin's液固定，石蠟包埋，切片厚度為6pm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，Olympus顯微鏡下觀察，拍照。用上述本實(shí)施例方法制備的雌核發(fā)育草魚與性反轉(zhuǎn)的雌核發(fā)育草魚純系進(jìn)行自交，由于父母本的基因純合度都相當(dāng)高，不容易發(fā)生性狀分離，因此雌核發(fā)育產(chǎn)生的優(yōu)良性狀能通過兩者自交穩(wěn)定遺傳給后代。用上述本實(shí)施例方法制備的雌核發(fā)育草魚作為母本與普通的雄性草魚交配，獲得了大批量的(雌核發(fā)育草魚？x普通草魚^)雜交魚后代F,，兩年對比養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)表明在主養(yǎng)草魚種且不使用抗病疫苗的情況下，F(xiàn)i除極少感染發(fā)生細(xì)菌性爛鰓病例外，對流行危害大的草魚細(xì)菌性腸炎和病毒性出血病基本不感染，生長速度比普通草魚快10%~15%，而普通草魚病害發(fā)生嚴(yán)重，成活率低，產(chǎn)量低。不同省份大面積對照養(yǎng)殖試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)見表3。表3:對比養(yǎng)殖試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)年齡品種平均放養(yǎng)規(guī)格養(yǎng)殖密度(尾/畝)平均收獲規(guī)格(kg/尾)成活率平均凈產(chǎn)量(kg/畝)一齡Ft體長3cm5cm5000~80000.1~0.270%~90%500~750普通草魚體長3cm5cm5000-80000.1~0.230%~50%200~300二齡Fi0.10.2kg/尾15002000卜280%~90%750~1000普通草魚0.10.2kg/尾150020001~230%~50%250-350由上可見，采用本實(shí)施例方法選育雌核發(fā)育草魚，可明顯提高雌核發(fā)育誘導(dǎo)效率，大批量獲得來自同一草魚親本的雌核發(fā)育草魚群體，該遺傳背景一致的雌核發(fā)育草魚群體為相關(guān)的性別決定機(jī)制和進(jìn)化等幾個(gè)重要生物學(xué)問題研究提供了寶貴的研究材料。另外，由本發(fā)明選育的雌核發(fā)育草魚可作為優(yōu)質(zhì)母本，大規(guī)模生產(chǎn)(雌核發(fā)育草魚？x普通草魚^)Fp該Fj在生長速度和抗病能力方面較普通草魚有明顯的優(yōu)勢，一定程度上克服了一、二齡草魚抗病能力差的問題，在生產(chǎn)上顯著提高了養(yǎng)殖草魚的經(jīng)濟(jì)效益。雌核發(fā)育草魚抗病能力增強(qiáng)，不僅與雌核發(fā)育處理導(dǎo)致基因純合、排除有害基因有關(guān)，還與異源四倍體鯽鯉二倍體精子相關(guān)遺傳片段的摻入有關(guān)。8權(quán)利要求1、一種草魚的雌核發(fā)育方法，其特征在于該方法是以適度滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子為刺激源，刺激草魚成熟卵子，激活后2～3min，用4℃～6℃的水冷休克處理10～12min，然后經(jīng)流水控溫孵化，制備得到抑制第二極體排出的雌核發(fā)育草魚。2、一種草魚的雌核發(fā)育方法，其特征在于該方法是以適度滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子為刺激源，刺激草魚成熟卵子，受精后20~22min，用4'C6'C的水冷休克處理1012min，然后經(jīng)流水控溫孵化，制備得到抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雌核發(fā)育方法，其特征在于所述滅活的具體操作為先用Hank's液稀釋異源四倍體鯽鯉的精液，再通過紫外線滅活，滅活程度以鏡檢時(shí)精子尾部擺動(dòng)減弱且80%~90%的精子仍具有良好的游動(dòng)活力為標(biāo)準(zhǔn)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的雌核發(fā)育方法，其特征在于所述紫外線滅活時(shí)使用的是15W的紫外燈，所述紫外燈與所述精液的距離為1012cm，所述紫外燈的照射時(shí)間為2030min。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雌核發(fā)育方法，其特征在于，所述流水控溫孵化時(shí)的溫度為21。C26。C。6、一種用權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)雌核發(fā)育方法制備得到的雌核發(fā)育草魚與性反轉(zhuǎn)的雌核發(fā)育草魚純系進(jìn)行自交，使所述雌核發(fā)育草魚的性狀進(jìn)行穩(wěn)定遺傳的方法。7、一種用權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)雌核發(fā)育方法制備得到的雌核發(fā)育草魚作為母本、以普通草魚作為父本進(jìn)行雜交的方法。全文摘要本發(fā)明公開了一種草魚的雌核發(fā)育方法，該方法是以適度滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子為刺激源，刺激草魚成熟卵子，激活后2～3min或者受精后20～22min，用4℃～6℃的水冷休克處理10～12min，然后經(jīng)流水控溫孵化，制備得到抑制第二極體排出或者抑制第一次卵裂的雌核發(fā)育草魚。本發(fā)明的方法不僅大大提高了雌核發(fā)育二倍體草魚的孵化率和存活率，而且簡化了制備工藝，能制備出性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的雌核發(fā)育草魚群體。文檔編號(hào)A01K61/00GK101669449SQ20091004447公開日2010年3月17日申請日期2009年9月30日優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日發(fā)明者筠劉,劉少軍,周工健,純張,虹張,彭亮躍,羅凱坤,俊肖,肖亞梅,敏陶申請人:湖南師范大學(xué)