專利名稱：紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚類雜交方法，尤其涉及鯉科魚類中亞科間的遠緣雜交方法。
背景技術：
雜交技術是改良魚類性狀常用的方法，而親緣關系在種間或種間以上的雜交一般稱為遠 緣雜交。通過遠緣雜交后，雜交后代可以整合親本的優(yōu)良性狀，使其可能在繁殖力、生長速 度、抗病力、體形、肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出雜交品種的優(yōu)勢，進而使魚類的性狀得到改良。如紅 鯽與湘江野鯉的屬間遠緣雜交形成的雜交后代具有生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩、抗病力強、存活 率高等優(yōu)點；紅鯽與團頭魴的亞科間遠緣雜交形成的雜交后代除具有鯽鯉雜交魚以上優(yōu)點外， 體背還明顯增高，外形優(yōu)美，具有良好的經(jīng)濟效應。然而，遠緣雜交也存在雜交后代不可存 活或存活率較低等問題。
CN1108469A號中國專利文獻公開了一種以紅鯽魚為父本、以紅鯉等鯉魚為母本的雜交 和馴養(yǎng)方法，CN1135834A號中國專利文獻則公開了一種以紅鯽魚為父本、以錦鯉為母本的 雜交和馴養(yǎng)方法，這兩篇文獻公開的雜交方法中都是用相同亞科(鯉亞科)內(nèi)的不同品種魚 作為父母本魚，且紅鯽均是作為父本魚進行雜交，雜交方法簡單，后代中性狀改良程度不顯著。
如何在現(xiàn)有的魚品種中挑選更加合適的父、母本親魚進行遠緣雜交，如何改進遠緣雜交 的方法和步驟，以獲得性狀更為優(yōu)良、品種更加豐富、對遺傳研究和育種更具意義的新型雜 交魚，就成為本領域技術人員長期面臨和需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種受精率高、孵化率高、操作 方便、能有效改善雜交后代性狀的紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，該方法在今后的 生物進化研究和遺傳育種等方面也具有非常重要的意義。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案包括以下步驟首先選取性腺成熟、體征 良好的紅鯽、黃尾密鲴分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節(jié)對所述的父、母本 親魚進行人工催產(chǎn)，再選擇催產(chǎn)效果良好的父、母本親魚進行人工干法授精，授精完成后進 行流水自動孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，再對飼養(yǎng)后的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅 鯽與黃尾密鲴雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽。
具體來說，上述方法可按下述操作進行1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特征明顯、體征良好的雌性紅鯽 和雄性黃尾密鲴作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，促進親魚性腺發(fā)育成熟；體征良好的親 魚一般表現(xiàn)為體型好、體色鮮艷、體質(zhì)健壯、無病無傷；
2) 人工催產(chǎn)在繁殖季節(jié)使水溫穩(wěn)定在2(TC以上，然后先向母本親魚注射絨毛膜促性 腺激素(HCG)與地歐酮(DOM)的混合催產(chǎn)劑進行催產(chǎn)，所述絨毛膜促性腺激素的用量為 800 I000IU/kg，所述地歐酮的用量為3 6mg/kg;母本親魚注射后4 5h開始向父本親魚注 射所述混合催產(chǎn)劑，父本親魚的注射劑量減半；注射后按l : (1.5 2)的數(shù)量比將母、父本 親魚放入同一產(chǎn)卵池中直至其開始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精；注射時優(yōu)選采用胸鰭基部無鱗處腹腔一 次性注射的方法，以提高親魚(特別是黃尾密鲴)的存活率；
3) 授精孵化挑選產(chǎn)卵量大的母本和產(chǎn)精量大的父本進行人工干法授精，并將受精卵置 于水溫為22'C 25'C的孵化池中進行流水自動孵化；
4) 飼養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育3 4天，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游、能夠 主動開口攝食后轉(zhuǎn)入池塘飼養(yǎng)，魚苗長成后進行檢測、篩分即可得到紅鯽與黃尾密鲴雜交三 倍體魚、紅鯽與黃尾密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽。
紅鯽(Carassius auratus red var.)屬于鯉科、鯉亞科中的二倍體魚(2n=100)，黃尾密鲴 (Xenocypris davidi Bleeker)屬于鯉科、鲴亞科中的二倍體魚(2n=48)，黃尾密鲴具有內(nèi)臟 少、食性雜、生長快、適應性強、易捕撈等特點，其肉質(zhì)細嫩，味道鮮甜，含肉率高，營養(yǎng) 豐富，深受人們的青睞，但該魚的性情急躁，人工繁殖難度較大。我們通過反復實驗最終選 擇紅鯽為母本，黃尾密鲴為父本，通過遠緣雜交方法獲得了性狀優(yōu)良的紅鯽與黃尾密鲴雜交 魚和天然雌核發(fā)育紅鯽；相比同類雜交試驗，本發(fā)明的受精率和孵化率都得到了顯著提高， 獲得的雜交后代兼有親本的優(yōu)良特征，相比于其他種類父母本親魚得到的遠緣雜交后代，優(yōu) 勢更加明顯。此外，紅鯽與黃尾密鲴雜交魚的父母本隸屬于不同的亞科，在遺傳、分類和體 形等生物學特性方面存在較大的差異，尤其是他們的體細胞染色體數(shù)目之間差異很大(紅鯽 的染色體數(shù)目為100，而黃尾密鲴的染色體數(shù)目為48)，而且不成倍性關系，因此遠緣雜交的 困難程度也比其他種類的雜交更大。在迄今國內(nèi)外尚未出現(xiàn)紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交 成功的報道的情況下，本發(fā)明利用遠緣雜交和天然雌核發(fā)育方法成功獲得了紅鯽與黃尾密鲴 雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽，這些新型雜交魚品種的 成功培育，在今后的生物進化研究和遺傳育種等方面具有非常重要的意義。


圖1為紅鯽(？) x黃尾密鲴(^)后代中四倍體魚的外形照片；圖2為紅鯽($) x黃尾密鲴(61)后代中四倍體魚的染色體圖(4n=148);
圖3為紅鯽($) x黃尾密鲴(3)后代中三倍體魚的外形照片；
圖4為紅鯽($) x黃尾密鲴(3)后代中三倍體魚的染色體圖(3n=124); 圖5為紅鯽(？) x黃尾密鲴(c )后代中天然雌核發(fā)育魚的外形照片； 圖6為紅鯽($) x黃尾密鲴(d)后代中天然雌核發(fā)育魚的染色體圖(2n=100)。
具體實施方式
實施例
一種本發(fā)明的紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟
1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特征明顯、體型好、體色鮮艷、 體質(zhì)健壯、無病無傷的紅鯽和黃尾密鲴個體作為親魚進行專池培育，合理投喂飼料，保持池 水活爽，促進親魚性腺發(fā)育成熟；
2) 人工催產(chǎn)在上述親魚的繁殖季節(jié)(當年4月下旬至五月初)開始進行人工催產(chǎn)，先 使水溫穩(wěn)定在2(TC以上，然后先向雌性親魚體內(nèi)注射絨毛膜促性腺激素與地歐酮的混合催產(chǎn) 劑進行催產(chǎn)，其中絨毛膜促性腺激素的注射用量為800 1000IU/kg,地歐酮的注射用量為3 6mg/kg，向雌性親魚注射后4~5h再向雄性親魚注射該混合催產(chǎn)劑，雄性親魚的注射劑量減半； 上述注射均采用胸鰭基部無鱗處腹腔一次性注射方法，以盡量提高親魚(特別是黃尾密鲴) 的存活率；注射后將親魚按雌雄l : (1.5 2)的比例放入產(chǎn)卵池中，水面吊一紗窗網(wǎng)片，以 檢測親魚的發(fā)情產(chǎn)卵情況；在完全靜水條件下，經(jīng)過6 8h后藥物開始發(fā)揮效用；
3) 授精孵化當發(fā)現(xiàn)親魚在產(chǎn)卵池中呈"螺旋狀"追逐、紗窗網(wǎng)片上沾有適量卵粒后，拉 網(wǎng)并開始打撈親魚進行檢測(注意要用軟質(zhì)網(wǎng)，操作要輕，水中檢測)；挑選產(chǎn)卵順利的母本 和產(chǎn)精量大的父本，揩干體表水分，將精卵擠入干凈的瓷盆中，用干凈的羽毛迅速不停地攪 拌2min 3min,然后鋪于浸入水中的2n^左右的網(wǎng)片之上，密度控制在1萬#勤112左右，于孵 化池中22'C 25'C水溫下流水自動孵化；
4) 飼養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育3 4天，待其出現(xiàn)腰點、開始平游、能夠主 動開口攝食后轉(zhuǎn)入池塘中用適口餌料進行詞養(yǎng)，可先用豆?jié){喂養(yǎng)1~2個星期，再換喂磨碎的 常規(guī)魚飼料，直至魚苗長到能正常攝食。
實驗證明，在紅鯽(？) x黃尾密鲴(d)組合中能夠產(chǎn)生存活的后代，其受精率和孵化 率分別為59.2%和48.7%，相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著地提高。而其 反交組合紅鯽(c ) x黃尾密鲴($)不能產(chǎn)生存活的后代。
對上述長成后的魚苗進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)在紅鯽(？) x黃尾密鲴(cp的雜交后代中出現(xiàn)有三種不同體色的雜交魚， 一種體色為青灰色(圖1所示的雜交后代魚)， 一種體色較深(圖 3所示的雜交后代魚)，還有一種體色呈紅色(圖5所示的雜交后代魚)。在體形上，前兩種 雜交后代魚兼有紅鯽和黃尾密鲴的特征，例如它們的頭部偏像于黃尾密鲴，身體部位卻類似 于紅鯽，體形優(yōu)美，肉質(zhì)鮮嫩。而紅色雜交后代魚則頭小背高、尾巴短小，與圖1、圖3所 示的雜交后代魚存在較明顯的差異。
等魚苗長到適當大小(10g左右)的時候用腎細胞直接制片法對紅鯽(？) x黃尾密鲴(cp 雜交后代魚的體細胞染色體數(shù)目進行檢測。檢測后發(fā)現(xiàn)雜交后代中的青灰色魚為紅鯽(？) 與黃尾密鲴(3)的雜交四倍體魚(4n=148),染色體圖如圖2所示；體色較深的雜交魚為紅 鯽(？)與黃尾密鲴(3)的雜交三倍體魚(3n=124)，其染色體圖如圖4所示；體色為紅色 的雜交魚為天然雌核發(fā)育二倍體紅鯽(2ii=100)，其染色體圖如圖6所示。
腎細胞直接制片法的方法為在18'C 22'C水溫下培育實驗魚l 3d后，對實驗魚注射 PHA1次 3次，每次劑量為2 8ng/克體重，間隔時間為12 24h,在解剖取材前2 6h， 注射秋水仙素，劑量為2 4pg/克體重；取出腎組織，在生理鹽水下剪碎腎組織，0.075 mol/L KCL低滲處理，在2CTC溫度下低滲40 60min;用冰醋酸甲醇為1 : 3的混合液固定腎細 胞1 3次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色一個小時左右，然后鏡檢。
本實施例的方法利用雌性紅鯽與雄性黃尾密鲴進行亞科間遠緣雜交，為四倍體魚的形成 提供了新的途徑，也為生物的進化研究提供了新的證據(jù)。并且，有望進一步選育出可育的四 倍體個體，用其制備具有優(yōu)良性狀的多倍體魚，以期產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。另外，本實施例
獲得的天然雌核發(fā)育紅鯽為天然雌核發(fā)育魚的制備提供了新的方法和途徑。
本實施例方法制備的新型四倍體魚和天然雌核發(fā)育魚在生物進化和魚類遺傳育種方面具 有重要的生物學意義。
權利要求
1、一種紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先選取性腺成熟、體征良好的紅鯽、黃尾密鲴分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節(jié)對所述的父、母本親魚進行人工催產(chǎn)，再選擇催產(chǎn)效果良好的父、母本親魚進行人工干法授精，授精完成后進行流水自動孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，再對飼養(yǎng)后的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅鯽與黃尾密鲴雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽。
2、 根據(jù)權利要求1所述的紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于具體包括 以下步驟1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特征明顯、體征良好的雌性紅鯽 和雄性黃尾密鲴作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，促進親魚性腺發(fā)育成熟；2) 人工催產(chǎn)在繁殖季節(jié)使水溫穩(wěn)定在20'C以上，然后先向母本親魚注射絨毛膜促性 腺激素與地歐酮的混合催產(chǎn)劑進行催產(chǎn)，所述絨毛膜促性腺激素的用量為800 1000IU/kg， 所述地歐酮的用量為3 6mg/kg;母本親魚注射后4 5h再向父本親魚注射所述混合催產(chǎn)劑， 父本親魚的注射劑量減半；注射后按l : (1.5 2)的數(shù)量比將母、父本親魚放入同一產(chǎn)卵池 中直至其開始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精；3) 授精孵化挑選產(chǎn)卵量大的母本和產(chǎn)精量大的父本進行人工干法授精，并將受精卵置 于水溫為22'C 25'C的孵化池中進行流水自動孵化；4) 詞養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育3 4天，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游、能夠 主動開口攝食后轉(zhuǎn)入池塘飼養(yǎng)，魚苗長成后得到紅鯽與黃尾密鲴雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾 密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽。
3、 根據(jù)權利要求2所述的紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于所述人 工催產(chǎn)時對親魚的注射是采用胸鰭基部無鱗處腹腔一次性注射的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅鯽與黃尾密鲴亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先選取性腺成熟、體征良好的紅鯽、黃尾密鲴分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節(jié)對所述的父、母本親魚進行人工催產(chǎn)，再選擇催產(chǎn)效果良好的父、母本親魚進行人工干法授精，授精完成后進行流水自動孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，再對飼養(yǎng)后的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅鯽與黃尾密鲴雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鲴雜交四倍體魚和天然雌核發(fā)育紅鯽。本發(fā)明培育出的雜交后代不僅性狀改善，顯著提高了遠緣雜交的受精率和孵化率，而且是一種產(chǎn)生四倍體魚和天然雌核發(fā)育魚的新途徑，在生物進化和魚類遺傳育種方面具有重要的生物學意義。
文檔編號A01K61/00GK101669448SQ20091004446
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2009年9月30日
發(fā)明者何偉國, 筠 劉, 劉少軍, 純 張, 羅凱坤, 敏 陶 申請人:湖南師范大學