專利名稱：黃尾密鲴與翹嘴紅鲌亞科間遠緣雜交的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類亞科間遠緣雜交的方法，尤其涉及一種黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間的遠緣雜交方法。
背景技術(shù)：
魚類遠緣雜交是兩種不同種魚類之間的雜交，可以是同屬魚不同種魚類的雜交、也可以是不同屬間、不同亞科間、不同科間甚至不同目間魚類個體之間的雜交。雜交能整合雙親的優(yōu)點，使雜交后代在外形、生長速度、存活率以及抗病能力等方面均表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，是一種重要的魚類遺傳育種和性狀改良方法。黃尾密鲴(Jenocypris davidiBleeker )屬于鯉科、鲴亞科中的二倍體魚(2n=48)，具有肉質(zhì)好、食性廣等優(yōu)點，翹嘴紅舶{Erythrocul ter iIishaeformis Bleeker )屬于鯉科、舶亞科中的二倍體魚(2n=48 ),為大型淡水經(jīng)濟魚類，具有生長迅速、耐低氧、適應(yīng)性與抗病力極強等優(yōu)點。這兩種魚在分類、體·形等生物學(xué)特性方面存在較大差異，因此這二者間的遠緣雜交存在較大困難。如何利用并改進現(xiàn)有的生物學(xué)技術(shù)以成功獲得具有優(yōu)良性狀的新型雜交魚已成為科學(xué)研究工作者長期面臨和亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種步驟簡單、操作方便、受精率和孵化率高、后代性狀優(yōu)良的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟以雌性黃尾密鲴作為母本親魚，以雄性翹嘴紅舶作為父本親魚，先對所述母本親魚和父本親魚進行人工催產(chǎn)，對催產(chǎn)效果良好的母本親魚和父本親魚進行人工干法授精，授精后在培養(yǎng)皿中流水孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)后經(jīng)檢測獲得黃尾密鲴和翹嘴紅舶的雜交后代。該雜交后代為黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交F1代(簡稱鲴舶F1代)，具有較高受精率、孵化率和存活率；通過進一步利用流式細胞DNA含量檢測技術(shù)、外周血細胞染色體制備方法對鲴舶F1代進行檢測，確證獲得黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交二倍體鲴舶F1代，這為后續(xù)鲴舶的遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。上述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，所述人工催產(chǎn)的具體操作優(yōu)選包括在每年6月下旬(即黃尾密鲴與翹嘴紅舶繁殖季節(jié)的交叉時間)，選取兩齡以上、性成熟特征明顯、體征良好的雌性黃尾密鲴和雄性翹嘴紅舶，首先為雌性黃尾密鲴注射黃體素釋放激素類似物(LRH-A)與絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合催產(chǎn)劑進行催產(chǎn)，黃體素釋放激素類似物的用量為20 μ g/kg，絨毛膜促性腺激素的用量為1500IU/kg ;經(jīng)過4h 5h后再對雄性翹嘴紅舶進行注射；雄性翹嘴紅舶的注射劑量相比雌性黃尾密鲴減半；注射后按I (2 3)的數(shù)量比將雌性黃尾密鲴、雄性翹嘴紅舶放入同一產(chǎn)卵池中，直至催產(chǎn)完成。上述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，所述流水孵化的具體操作優(yōu)選包括挑選產(chǎn)卵量大、產(chǎn)卵質(zhì)量高的母本親魚和產(chǎn)精量大的父本親魚進行人工干法授精后，將人工干法授精后的受精卵均勻鋪于培養(yǎng)皿(例如直徑為22cm的玻璃培養(yǎng)皿)中進行流水孵化，每個培養(yǎng)皿中受精卵的卵粒數(shù)目控制為1500 2000，水溫保持在22°C 26°C。上述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，所述飼養(yǎng)的具體操作優(yōu)選包括待魚苗全部孵出后，先于清水箱中培育I 2天，期間定時換水，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后，將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，3 4天后潑灑豆?jié){，2 3次/天，沿池潑灑，直至魚苗長成。上述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，所述檢測優(yōu)選是采用外周血細胞培養(yǎng)染色體制備方法(外周血細胞培養(yǎng)法)、流式細胞DNA含量測定法(流式細胞測定法)對雜交后代進行染色體數(shù)目、DNA含量的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過反復(fù)試驗最終選擇黃尾密鲴作為母本、選擇翹嘴紅舶作為父本，進行亞科間的遠緣雜交，最終成功獲得了一種在外形、生長速度、存活率以及抗病能力等方面均表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢的二倍體鲴舶。比較同類試驗，黃尾密鲴與翹嘴紅舶間雜交的受精率和孵化率都得到了明顯提高，可以穩(wěn)定重復(fù)獲得大量雜交 后代，雜交F1代性狀整齊一致。同時，遠緣雜交整合了黃尾密鲴和翹嘴紅舶的優(yōu)點，在同等條件下，雜交后代相對其父母本在外形、生長速度、存活率以及抗病能力等方面均表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。另外，以本發(fā)明的遠緣雜交方法為基礎(chǔ)，還有望通過多代選育從二倍體鲴舶中獲得四倍體鲴舶群體。已有的研究表明，在紅鯽(2n=100，早)X湘江野鯉(2n = 100， )的雜交后代中，F(xiàn)1 - F2為二倍體(2η=100)，而在二倍體F2個體中存在能分別產(chǎn)生二倍體卵子和二倍體精子的雌、雄個體，二倍體卵子和二倍體精子結(jié)合，形成了兩性可育的四倍體魚F3(4η= 200)。目前四倍體鯽鯉已連續(xù)繁殖了 20代(F3-F22)，形成了一個遺傳性狀穩(wěn)定的四倍體魚群體。據(jù)此，本發(fā)明二倍體鲴舶的獲得在魚類育種和生物進化方面具有重要意義。


圖I為本發(fā)明實施例中黃尾密鲴(早)X翹嘴紅舶U )后代的外形照片。圖2為本發(fā)明實施例中黃尾密鲴(早)X翹嘴紅舶U)后代的染色體圖(2η=48)。圖3為本發(fā)明實施例中測得的紅鯽的DNA含量圖。圖4為本發(fā)明實施例中測得的黃尾密鲴(早)X翹嘴紅舶U )后代的DNA含量圖。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例
一種本發(fā)明的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，具體包括以下步驟
I.人工催產(chǎn)以雌性黃尾密鲴作為母本親魚，以雄性翹嘴紅舶作為父本親魚，在每年6月下旬，選取兩齡以上、性成熟特征明顯、體征良好的雌性黃尾密鲴和雄性翹嘴紅舶進行催產(chǎn)。先為母本親魚注射黃體素釋放激素類似物(LRH-A)與絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合催產(chǎn)劑進行催產(chǎn)，LRH-A的注射用量為20 μ g/kg, HCG的注射用量為1500IU/kg，采用胸鰭基部凹陷無鱗處傾斜45°胸腔注射；經(jīng)4h 5h后再注射父本親魚，父本親魚的注射劑量相比母本親魚減半，注射方法同母本親魚；注射后按I : (2 3)的數(shù)量比將母本親魚、父本親魚放入同一產(chǎn)卵池中，活水刺激，在繁殖前3h 4h停止加水，讓魚在靜水中催產(chǎn)。2.人工干法授精和孵化當(dāng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵池內(nèi)的親魚出現(xiàn)相互追逐的現(xiàn)象時，開始拉網(wǎng)打撈親魚進行檢測(注意要用軟質(zhì)網(wǎng)，操作要輕，水中檢測)，挑選產(chǎn)卵量大、產(chǎn)卵質(zhì)量高的母本親魚和產(chǎn)精量大的父本親魚進行人工干法授精，把精卵擠入干凈的瓷盆中，用干凈的羽毛迅速不停地攪拌，然后將受精卵均勻鋪于直徑為22cm的玻璃培養(yǎng)皿中進行流水孵化，每個培養(yǎng)皿中的卵粒數(shù)目為1500 2000，水溫保持在22°C 26°C。3.飼養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于清水箱中培育I 2天，在這期間定時換水，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，3 4天后潑灑豆?jié){，2 3次/天，沿池潑灑，直至魚苗長成。孵化期間進行人工計數(shù)，統(tǒng)計胚胎的受精率和孵化率。本實施例中，黃尾密鲴與翹嘴紅舶雜交魚的受精率和孵化率分別為85%和77%，與同類雜交試驗相比，其受精率和孵化率得到了顯著地提高。 隨機選取在相同條件下培育兩年齡的黃尾密鲴、翹嘴紅舶和二倍體鲴舶(二倍體鲴舶的外形照片參見圖I);對它們的外部形態(tài)特征進行檢測，包括背鰭條、腹鰭條、臀鰭條、側(cè)線鱗、側(cè)線上鱗和側(cè)線下鱗，檢測結(jié)果如下表I所示。表I :黃尾密鲴、翹嘴紅舶及雜交后代的可數(shù)性狀比較(單位片或條)
\、特鑛:側(cè)線_ I _線上鑛[側(cè)線下_ 背1 條 Ii葡條~ ~
類別'^______
黃尾密賴—^h0::67—^ ^|012—^^^ SIl + 7 +1'...O 8 ++‘I IEM I ■ 13
8嚼紅 M M)-.... 16...-20 6.-.-7 II!+ 7ΠI+.20 - B
C>414 I 9ill+ s VHR 23
上述可數(shù)性狀的相關(guān)數(shù)據(jù)表明二倍體鲴舶的側(cè)線上鱗處于黃尾密鲴與翹嘴紅舶之間，表現(xiàn)為中間類型，體現(xiàn)出雜交的特性；盡管雜交后代在外形上與父本翹嘴紅舶更為相似，但二倍體鲴舶在側(cè)線鱗和背鰭條上更偏向于母本黃尾密鲴；而側(cè)線下鱗則均偏高于親本，表現(xiàn)出變異的特性。再通過魚類外周血細胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法對二倍體鲴舶淋巴細胞的染色體數(shù)目進行鑒定。外周血細胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法操作步驟為1)在超凈工作臺中配制培養(yǎng)基，IOOml培養(yǎng)基含以下成分84ml RPMI-1640、15ml小牛血清、2支PHA、lml
O.1%肝素鈉、以7. 5% NaHCO3 (無菌)或IN HCl調(diào)pH至7. 2 7. 4 ；2)用注射器吸取少量滅菌肝素鈉溶液，用于碘酒消毒后的實驗魚尾部靜脈取血；3)按每IOml培養(yǎng)液中加入約O. 2ml抗凝血的標(biāo)準(zhǔn)將抗凝血加入培養(yǎng)液中，于24°C、5% 二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h 72h，培養(yǎng)期間定期輕搖勻，以使細胞充分接觸培養(yǎng)基；4)終止培養(yǎng)前3小時，在培養(yǎng)液中加入10 μ g/ml的秋水仙堿，使終濃度為O. 05 μ g/ml O. 07 μ g/ml,以上步驟均需無菌操作；5)將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈的10 ml離心管中，以1500rpm離心5min，棄上清液；6)向離心管中加入IOml低滲液,混勻,低滲25min 30min ;7)加入Iml固定液,輕輕混勻后1500rpm離心5min,棄上清液；8)加入5ml固定液,輕輕混勻，靜置30min后1500rpm離心5min，棄上清液；9)重復(fù)步驟8 一次；10)視最后細胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細胞懸液(一般為Iml 2ml)后，吸取細胞懸液自20cm 30cm高處滴片，輕吹散,空氣中自然干燥；ll)Giemsa染液染色50min 60min，細水流沖洗載玻片背面去除染液，氣干后鏡檢、拍照。用上述實驗方法得到的結(jié)果如圖2所示，黃尾密鲴(早)和翹嘴紅舶(^ )雜交后代F1的染色體數(shù)目為48,證明它們是二倍體(2n=48 )。同時，以紅鯽為參照，用流式細胞儀測定上述二倍體鲴舶紅細胞中的DNA含量。流式細胞DNA含量測定法的大體步驟為用經(jīng)肝素鈉潤濕的一次性注射器從魚尾靜脈血管采血約O. 2 mL，注入裝有O. 8%生理鹽水的Eppendorf管中，在血液和生理鹽水混合液中加入ImL 細胞核提取液 DAPI-A (nuclei extraction solution,德國 Partec Gmbh 提供)，處理時間10 15 min ;樣品經(jīng)過20 um尼龍濾器(德國Partec GmbH提供)過濾；DNA染色液(DAPI-B，德國Partec GmbH提供)靜置于暗處染色樣品約5 10 min，然后上機檢測。測定結(jié)果分別如圖3、圖4所示。分析圖中數(shù)據(jù)可知，紅鯽、二倍體鲴舶的DNA平均含量分別 為97. 35和68. 40，對照紅鯽與二倍體鲴舶的DNA平均含量比值為I. 423，該比值與已有的紅鯽與翹嘴紅舶的比值(紅鯽翹嘴紅舶=101. 29 67. 40=1. 503)無顯著差異。由此表明，流式細胞DNA含量測定法的試驗結(jié)果與外周血細胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法獲得的結(jié)果是一致的。
權(quán)利要求
1.一種黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟以黃尾密鲴作為母本親魚，以翹嘴紅舶作為父本親魚，先對所述母本親魚和父本親魚進行人工催產(chǎn)，對催產(chǎn)效果良好的母本親魚和父本親魚進行人工干法授精，授精后在培養(yǎng)皿中流水孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)后經(jīng)檢測獲得黃尾密鲴和翹嘴紅舶的雜交后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于，所述人工催產(chǎn)的具體操作包括在每年6月下旬，選取性成熟特征明顯、體征良好的雌性黃尾密鲴和雄性翹嘴紅舶，首先為雌性黃尾密鲴注射黃體素釋放激素類似物與絨毛膜促性腺激素的混合催產(chǎn)劑進行催產(chǎn)，黃體素釋放激素類似物的用量為20μ g/kg，絨毛膜促性腺激素的用量為1500IU/kg ;經(jīng)過4h 5h后再對雄性翹嘴紅舶進行注射；雄性翹嘴紅舶的注射劑量相比雌性黃尾密鲴減半；注射后按I : (2 3)的數(shù)量比將雌性黃尾密鲴、雄性翹嘴紅舶放入同一產(chǎn)卵池中，直至催產(chǎn)完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于，所述流水孵化的具體操作包括將人工干法授精后的受精卵均勻鋪于培養(yǎng)皿中進行流水孵化，每個培養(yǎng)皿中受精卵的卵粒數(shù)目控制為1500 2000，水溫保持在22°C 26°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)的具體操作包括待魚苗全部孵出后，先于水箱中培育I 2天，期間定時換水，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后，將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，3 4天后潑灑豆?jié){，2 3次/天，沿池潑灑，直至魚苗長成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黃尾密鲴與翹嘴紅舶亞科間遠緣雜交的方法，其特征在于，所述檢測是采用外周血細胞培養(yǎng)染色體制備方法、流式細胞DNA含量測定法對雜交后代進行染色體數(shù)目、DNA含量的檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃尾密鲴與翹嘴紅鲌亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟以黃尾密鲴作為母本親魚，以翹嘴紅鲌作為父本親魚，先對母本親魚和父本親魚進行人工催產(chǎn)，對催產(chǎn)效果良好的母本親魚和父本親魚進行人工干法授精，授精后在培養(yǎng)皿中流水孵化，待魚苗孵化完成后進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)后經(jīng)檢測獲得黃尾密鲴和翹嘴紅鲌的雜交后代。本發(fā)明的遠緣雜交方法具有步驟簡單、操作方便、受精率和孵化率高、后代性狀優(yōu)良等優(yōu)點。
文檔編號A01K61/00GK102893938SQ20121044955
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者劉少軍, 肖軍, 陶敏, 張純, 羅凱坤, 劉筠, 謝麗華 申請人:湖南師范大學(xué)