專利名稱：：活化的聚噁唑啉及包含該聚噁唑啉的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開涉及聚噁唑啉衍生物、這類聚噁唑啉衍生物的制備中可用的合成方法和中間體、以及用這類聚噁唑啉衍生物產(chǎn)生的水解穩(wěn)定的輩巴分子-聚噁唑啉偶聯(lián)物。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代藥物科學(xué)中，聚合物修飾療法已被證實(shí)具有高實(shí)用性。特別地，與聚乙二醇類(PEGs)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)現(xiàn)已構(gòu)成治療一系列疾病的諸多很重要的療法。由于聚合物修飾療法的成功，故擴(kuò)展具有這類應(yīng)用的聚合物的范圍、尤其是提供具有聚乙二醇所不具有的性質(zhì)的聚合物是人們所感興趣的。圖1示出了2-烷基-2-噁唑啉(如2-乙基-2-噁唑啉)聚合的活性陽離子機(jī)制，其中-OTf為-OS02-CF3或"三氟曱磺酸鹽，，，Nuc-為負(fù)的親核試劑；圖2A和圖2B示出了通過現(xiàn)有技術(shù)的方法制得的M-PEOZ-OH2000的凝膠滲透色譜；圖3示出了聚噁唑啉衍生物(這里以2-乙基-2-噁唑啉示出)的聚合過程中鏈轉(zhuǎn)移的消除-二聚機(jī)制的機(jī)制；圖4A和圖4B示出了通過本發(fā)明的優(yōu)化條件制得的M-PEOZ-OH2000(圖4A)和M-PEOZ-OH5000(圖斗B)的凝膠滲透色譜。發(fā)明詳述定義本文中用到的術(shù)語"POZ"、"POZ化合物"或"POZ聚合物"指含具有結(jié)構(gòu)-[N(COR7)CH2CH2]n-的重復(fù)單元的2-取代-2-噁唑啉聚合物，其中各個(gè)重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或雜環(huán)基烷基，n為3-1000;在一個(gè)實(shí)施方案中，所述未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或雜環(huán)基烷基包含l-10個(gè)碳原子，在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，R7為曱基、乙基或正丙基。本文中用到的術(shù)語"PMOZ"指含具有結(jié)構(gòu)-[N(COCH3)CH2CH2]n-的重復(fù)單元的POZ。本文中用到的術(shù)語"PEOZ"指含具有結(jié)構(gòu)-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-的重復(fù)單元的POZ。本文中用到的術(shù)語M-POZ、M-PMOZ或M-PEOZ指其中引發(fā)端(initiatingend)上的氮與甲基結(jié)合的上述聚合物。本文中用到的術(shù)語"POZ衍生物"或"聚噁唑啉衍生物"指包含POZ聚合物的結(jié)構(gòu)，所述POZ聚合物在POZ聚合物的末端上具有單個(gè)活性官能團(tuán)，所述官能團(tuán)能直接或間接地與靶分子上的化學(xué)基團(tuán)形成連接；在一個(gè)實(shí)施方案中，所述POZ衍生物為單官能POZ衍生物。本文中用到的術(shù)語"靶分子"指具有治療、診斷應(yīng)用或靶向功能的任何分子，其中所述靶分子能與本公開的POZ聚合物或POZ衍生物上的活性官能團(tuán)反應(yīng)，包括但不限于治療部分(例如但不限于藥物)、診斷部分、靶向部分、有機(jī)小分子、低聚核苷酸、多肽、抗體、抗體片段和蛋白質(zhì)。本文中用到的術(shù)語"水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物"指本公開的POZ衍生物與靶分子的偶聯(lián)物，以使POZ偶聯(lián)物與靶分子間的所有化學(xué)連接均水解穩(wěn)定。本文中用到的術(shù)語"水解穩(wěn)定的"指在生理?xiàng)l件下的水溶液中穩(wěn)定的連接；在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的連接將穩(wěn)定至少12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、192小時(shí)或更久；在一個(gè)替選實(shí)施方案中，這樣的連接無限期穩(wěn)定。本文中用到的術(shù)語"水解不穩(wěn)定的"指在生理?xiàng)l件下的水溶液中不穩(wěn)定的連接。本文中用到的術(shù)語"生理?xiàng)l件"指pH為6-8、溫度為30-42攝氏度的水溶液。本文中用到的術(shù)語"活性官能團(tuán)"指與反應(yīng)需要強(qiáng)催化劑、高溫或不切實(shí)際的反應(yīng)條件的那些基團(tuán)相比，易于與親電或親核基團(tuán)反應(yīng)或易于通過環(huán)加成反應(yīng)來反應(yīng)的那些基團(tuán)。本文中關(guān)于本文中所述的POZ衍生物或其組分用到的術(shù)語"連接"、"被連接的"、"連接，，或"連接劑"指通常因化學(xué)反應(yīng)而形成且通常為共價(jià)連接的基團(tuán)或鍵。本文中關(guān)于羥基、胺基、巰基及其他反應(yīng)性基團(tuán)用到的術(shù)語"被保護(hù)的"指經(jīng)本領(lǐng);或才支術(shù)人員熟知的^f呆護(hù)基(如ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Greene,T.W.;Wuts,P.G.M.，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,(第三版，1999)中記載的那些)保護(hù)而避免不希望的反應(yīng)的這些官能團(tuán)形式，所述保護(hù)基可用其中記載的程序添加或除去。被保護(hù)的鞋基的實(shí)例包括但不限于曱硅烷基醚，如通過羥基與試劑(如但不限于叔丁基二曱基氯硅烷、三曱基氯硅烷、三異丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷)的反應(yīng)獲得的那些；取代的曱基和乙基醚，如但不限于曱氧基曱基醚、曱硫基甲基醚、節(jié)氧基曱基醚、叔丁氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基曱基醚、四氳吡喃醚、1-乙氧基乙基醚、烯丙基醚、千基醚；酯，如但不限于苯曱酰曱酸酯、曱酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保護(hù)的胺基的實(shí)'例包括但不限于酰胺，如曱酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯曱酰胺；酰亞胺，如鄰苯二曱酰亞胺和二疏代琥珀酰亞胺；等等。被保護(hù)的巰基的實(shí)例包括但不限于硫醚，如S-千基石克醚和S-4-吡咬曱基硫醚；取代的S-曱基衍生物，如硫代半縮醛、二硫縮醛和氨J^?？s醛；等等。無論單獨(dú)或作為取代基的一部分使用，本文中用到的術(shù)語"烷基"包括包含一到二十個(gè)碳原子的直鏈烴基。因此該表述包括直鏈烷基，如曱基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。該表述也包括直鏈烷基的支鏈異構(gòu)體，包括但不限于作為實(shí)例給出的如下基團(tuán)-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)等。該表述也包括環(huán)狀烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基，以及被如上所定義的直鏈和支鏈烷基所取代的這類環(huán)。該表述也包括多環(huán)烷基，如但不限于金剛烷基冰片基和雙環(huán)[2.2.2]辛基，以及被如上所定義的直鏈和支鏈烷基所取代的這類環(huán)。無論單獨(dú)或作為取代基的一部分使用，本文中用到的術(shù)語"烯基"包括在任何兩個(gè)相鄰的碳原子間具有至少一個(gè)雙鍵的烷基。無論單獨(dú)或作為取代基的一部分使用，本文中用到的術(shù)語"炔基，，包括在任何兩個(gè)相鄰的碳原子間具有至少一個(gè)三鍵的烷基。本文中用到的術(shù)語"未取代的烷基"、"未取代的烯基"和"未取代的炔基，，指不含雜原子的烷基、烯基和炔基。表述"取代的烷基"、"取代的烯基，，和"未取代的炔基"指如上所定義的烷基、烯基和炔基，其中與碳或氬的一個(gè)或多個(gè)鍵被與非氫或非碳原子的鍵所代替，所述非氫或非碳原子如但不限于基團(tuán)如烷氧基和芳氧基中的氧原子；基團(tuán)如烷基和芳基硫化物、石tt、磺?；蛠嗧炕械牧蛟?；基團(tuán)如三烷基曱硅烷基、二烷基芳基曱硅烷基、烷基二芳基曱硅烷基和三芳基曱硅烷基中的硅原子；和各種其他基團(tuán)中的其他雜原子。本文中用到的術(shù)語"未取代的芳基"指環(huán)部分中具有6-12個(gè)碳原子的不含雜原子的單環(huán)或雙環(huán)芳族烴基，如但不限于苯基、萘基、蒽基、聯(lián)苯基和二苯基。雖然表述"未取代的芳基"包括含稠環(huán)的基團(tuán)(如萘)，但其不包括環(huán)成員中的一個(gè)上結(jié)合有其他基團(tuán)(如烷基或卣素基團(tuán))的芳基，因?yàn)槿缦滤?，如曱苯基的芳基在本文中被視為取代的芳基。但未取代的芳基可與母體化合物中的一個(gè)或多個(gè)碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子結(jié)合。本文中用到的術(shù)語"取代的芳基"相對于未取代的芳基具有與取代的烷基相對于未取代的烷基相同的含義。但取代的芳基也包括其中一個(gè)芳族碳與一個(gè)非碳或非氫原子結(jié)合的芳基，所述非碳或非氫原子如但不限于上面關(guān)于取代的烷基所描述的那些原子，而且也包括其中芳基的一個(gè)或多個(gè)芳族碳與如本文中所定義的取代的和/或未取代的烷基、烯基或炔基結(jié)合的芳基。這包括其中芳基的兩個(gè)碳原子與烷基或烯基的兩個(gè)原子結(jié)合而限定稠環(huán)系(如二氫萘基或四氫萘基)的鍵合排列。因此，表述"取代的芳基，，除了別的之外還包括但不限于曱苯基和羥苯基。本文中用到的術(shù)語"未取代的芳烷基"指如上所定義的未取代的烷基或烯基，其中未取代的或取代的烷基或烯基的氫或碳鍵被與如上所定義的取代的或未取代的芳基的鍵所代替。例如，曱基(CH3)為未取代的烷基。如果該甲基的氫原子被與苯基的鍵所代替，例如如果該曱基的碳與苯的碳結(jié)合，則該化合物為未取代的芳烷基(即芐基)。本文中用到的術(shù)語"取代的芳烷基"相對于未取代的芳烷基具有與取代的芳基相對于未取代的芳基相同的含義。但取代的芳烷基也包括其中基團(tuán)的烷基部分的碳或氫鍵被與非碳或非氫原子的鍵所代替的基團(tuán)。本文中用到的術(shù)語"未取代的雜環(huán)基，，指芳族和非芳族環(huán)化合物，包括單環(huán)、雙環(huán)和多環(huán)化合物，如但不限于含3個(gè)或更多個(gè)環(huán)成員的查寧環(huán)基，這些環(huán)成員中的一個(gè)或多個(gè)為雜原子，如但不限于N、O和S。雖然表述"未取代的雜環(huán)基"包括稠合雜環(huán)(如苯并咪唑基)，但其不包括環(huán)成員中的一個(gè)上結(jié)合有其他基團(tuán)(如烷基或卣素基團(tuán))的雜環(huán)基，因?yàn)槿?-甲基苯并咪唑基的化合物為如下面所定義的"取代的雜環(huán)基"。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于含l-4個(gè)氮原子的不飽和3-8'員環(huán)，如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪哇基、吡唑基、吡咬基、二氫吡咬基、嘧咬基、p比p秦基、噠嗪基、三唑基、四唑基；含l-4個(gè)氮原子的飽和3-8員環(huán)，如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌咬基、咪溱基；含l-4個(gè)氮原子的稠合不飽和雜環(huán)基，如但不限于p引咮基、異"l咮基、吲哚啉基、茚滿基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、。引哇基、苯并三唑基；含l-2個(gè)氧原子和l-3個(gè)氮原子的不飽和3-8員環(huán)，如但不限于噁唑基、異噁唑基、噁二唑基；含l-2個(gè)氧原子和1-3個(gè)氮原子的飽和3-8員環(huán)，如但不限于嗎啉基；含1-2個(gè)氧原子和l-3個(gè)氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基，如苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁漆基(如2H-l，4-苯并噁溱基等)；含1-3個(gè)硫原子和1-3個(gè)氮原子的不飽和3-8員環(huán)，如但不限于噻唑基、異遙唑基、瘞二唑基(如1,2,3-p塞二唑基、1,2，4-p塞二唑基、1,3，4-虔二哇基、1,2,5-噻二唑基等)；含1-2個(gè)硫原子和1-3個(gè)氮原子的飽和3-8員環(huán)，如但不限于噻唑烷基；含l-2個(gè)硫原子的飽和和不飽和3-8員環(huán)，如但不限于瘞嗯基、二氫二硫雜環(huán)己二烯基(dihydrodMiiinyl)、二氫二亞硫酰、四氫噻吩、四氫瘞喃；含l-2個(gè)硫原子和l-3個(gè)氮原子的不飽和稠合雜環(huán)，如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻。秦基(如2H-l,4-苯并噻嗪基等)、二氫苯并噻嗪基(如2H-3,4-二氫苯并噻溱基)；含氧原子的不飽和3-8員環(huán)，如但不限于呋喃基；含1-2個(gè)氧原子的不飽和稠合雜環(huán)，如苯并間二氧雜環(huán)戊烯基(如1,3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯基等)；含氧原子和1-2個(gè)硫原子的不飽和3-8員環(huán)，如但不限于二氫氧硫雜環(huán)己二烯基(dihydrooxathiinyl);含1-2個(gè)氧原子和1-2個(gè)硫原子的飽和3-8員環(huán)，如l,4-氧硫雜環(huán)己烷；含l-2個(gè)碌u原子的不飽和稠環(huán)，如苯并p塞嗯基、苯并二硫雜環(huán)己二烯基(benzodithiinyl);以及含氧原子和1-2個(gè)氧原子的不飽和稠合雜環(huán)，如苯并氧硫雜環(huán)己二烯基(benzoxathiinyl)。雜環(huán)基也包括上面描述的其中環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)S原子與一個(gè)或兩個(gè)氧原子雙鍵鍵合的那些(亞石風(fēng)和砜)。例如，雜環(huán)基包括四氫p塞吩、氧化四氫瘞吩、和1,1-二氧化四氫遙吩。優(yōu)選的雜環(huán)基含5或6個(gè)環(huán)成員。更優(yōu)選的雜環(huán)基包括嗎啉、哌溱、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1,2,3-三峻、1,2,4-三唑、四唑、石克代嗎啉、其中碌u代嗎啉的S原子與一個(gè)或多個(gè)O原子結(jié)合的硫代嗎啉、吡咯、高哌溱、噁唑烷-2-酮、吡p各烷-2-酮、噁唑、奎寧環(huán)、瘞唑、異噁唑、吹喃和四氫呋喃。本文中用到的術(shù)語"取代的雜環(huán)基，，相對于未取代的雜環(huán)基具有與取代的烷基相對于未取代的烷基相同的含義。但取代的雜環(huán)基也包括其中一個(gè)碳與一個(gè)非碳或非氫原子結(jié)合的雜環(huán)基，所述非碳或非氫原子如但不限于上面關(guān)于取代的烷基和取代的芳基所描述的那些原子，而且取代的雜環(huán)基也包括其中雜環(huán)基的一個(gè)或多個(gè)碳與如本文中所定義的取代的和/或未取代的烷基、烯基或芳基結(jié)合的雜環(huán)基。這包括其中雜環(huán)基的兩個(gè)碳原子與烷基、烯基或炔基的兩個(gè)原子結(jié)合而限定稠環(huán)系的鍵合排列。實(shí)例除了別的以外還包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-曱基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、l-甲基哌嗪基和2-氯吡咬基。本文中用到的術(shù)語"未取代的雜環(huán)基烷基"指如上所定義的未取代的烷基或烯基，其中未取代的烷基或烯基的氫或碳鍵被與如上所定義的取代的或未取代的雜環(huán)基的鍵所代替。例如，甲基(CH3)為未取代的烷基。如果該曱基的氫原子被與雜環(huán)基的鍵所代替，例如如果該曱基的碳與吡啶的碳2(與吡啶的N結(jié)合的碳中的一個(gè))或吡啶的碳3或碳4結(jié)合，則該化合物為未取代的雜環(huán)基烷基。本文中用到的術(shù)語"取代的雜環(huán)基烷基"相對于未取代的雜環(huán)基烷基具有與取代的芳基相對于未取代的芳基相同的含義。但取代的雜環(huán)基烷基也包括其中非氫原子與雜環(huán)基烷基的雜環(huán)基中的雜原子(如但不限于哌啶基烷基的哌啶環(huán)中的氮原子)結(jié)合的基團(tuán)?？傮w描述聚噁唑啉(POZ)是自2-取代-2-噁唑啉單體制備的聚合物。這些聚合物是水溶性的且據(jù)報(bào)道在哺乳動(dòng)物模型系統(tǒng)中是無毒的。POZ通常通過適當(dāng)化學(xué)計(jì)量的量的2-烷基-2-噁唑啉與親電引發(fā)劑(如對曱苯磺酸曱酯(或"曱苯磺酸酯"，CH3-OS02-C6H4-CH3)或三氟曱磺酸曱酯(CH3-OS02-CF3))反應(yīng)、然后用親核試劑(如氫氧化物或胺)終止制備。所產(chǎn)生的聚合物便于以簡寫形式描述為引發(fā)基團(tuán)由最左側(cè)的基團(tuán)表示、終止基團(tuán)由最右側(cè)的基團(tuán)表示、2-烷基-2-噁唑啉組分在中間。因此，當(dāng)本說明書中使用這種簡寫描述時(shí)，除非另有指出，否則名稱的左側(cè)將代表"引發(fā)劑端"，而名稱的右側(cè)將代表"末端"。例如，當(dāng)2-取代-2-噁唑啉為2-曱基-2-噁唑啉、曱苯磺酸曱酯被用作引發(fā)劑、氫氧化物被用作終止劑時(shí)，將產(chǎn)生如下聚合物CHr[N(COCH3)CH2CH2]n-OH上面的聚合物便于以簡寫符號描述為M-PMOZ-OH，其中曱基引發(fā)劑由最左側(cè)的M(在引發(fā)劑端處)表示，PMOZ代表聚甲基噁唑啉，其中重復(fù)單元的曱基由PMOZ的M表示，終止羥基由-OH(在末端處)表示。聚合度n可在約3到約1000范圍內(nèi)。另一常用的單體為2-乙基-噁唑啉，該單體由三氟曱磺酸曱酯引發(fā)、由氫氧化物終止時(shí)將提供如下POZ聚合物上面的聚合物便于以簡寫符號描述為M-PEOZ-OH,其中曱基引發(fā)劑由最左側(cè)的M(在引發(fā)劑端處)表示，PEOZ代表聚曱基噁唑啉，其中重復(fù)單元的乙基由PEOZ的E表示，終止羥基由-OH(在末端處)表示?？墒褂酶鼜?fù)雜的親電試劑和親核試劑。例如，用千基溴引發(fā)2-乙基-2-噁唑啉聚合并用過量的乙二胺終止產(chǎn)生如下聚合物該聚合工藝被稱為活性陽離子聚合，因?yàn)橛糜H電試劑進(jìn)行的引發(fā)產(chǎn)生噁唑啉鹽(oxazolinium)陽離子，該噁唑啉鹽陽離子然后以鏈反應(yīng)與其他單體單元反應(yīng)產(chǎn)生增長的"活性"陽離子。通過々I定活性陽離子可由下面的非環(huán)形式表示，可以預(yù)測終止的產(chǎn)物，雖然事實(shí)上環(huán)狀形式無疑是最重要的，且所需的產(chǎn)物通過親核攻擊環(huán)的5-位產(chǎn)生:本公開中以M-PMOZ+代表該陽離子。如上面所提到的，該P(yáng)OZ陽離子可通過與親核試劑(如氫氧化物或胺)反應(yīng)而"被終止"。有趣的是，用弱親核試劑水進(jìn)行的終止不產(chǎn)生所需的5-位攻擊產(chǎn)物("熱力學(xué)"產(chǎn)物)，而是產(chǎn)生2-位攻擊("動(dòng)力學(xué)"產(chǎn)物)。該動(dòng)力學(xué)產(chǎn)物不穩(wěn)定且可能重排得到酯產(chǎn)物或變回陽離子(O.Nuyken，G.Maier,A.Gross,Macromol.Chem.Phys.197，83-85(1996))。CHr[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OHC6H5-CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-NH-CH2CH2-NH:此外，CH3-[N(COCH3)CH2CH2]n-N(COCH3)CH2CH2羥基終止的聚合物可經(jīng)進(jìn)一步改性得到所需的衍生物。例如，Zalipsky使端-OH與戊二酸酐反應(yīng)得到由戊二酸酯基團(tuán)終止的POZ(M.C.Woodle，C.M.EngbersandS.Zalipsky，BioconjugateChem.，1994,5，493-496)。M-PMOZ-02C-CH2CH2CH2-C02H上面的聚合物被活化為琥珀酰亞胺基酯、與磷脂偶聯(lián)并用來制備POZ-修飾脂質(zhì)體。已發(fā)現(xiàn)這些脂質(zhì)體與PEG-修飾脂質(zhì)體具有相似的性質(zhì)。胺終止的聚合物也具有可用于進(jìn)一步衍生化的反應(yīng)性基團(tuán)。例如，用曱胺終止得到由活性基團(tuán)-NHCH3終止的POZ。也可用環(huán)狀二胺嗛。秦終止。噁唑啉聚合也可用功能性親核試劑引發(fā)。例如，親電引發(fā)劑3-溴丙酸乙酯已被用來引發(fā)2-乙基-2-噁唑啉聚合。用氫氧化物終止得到如下聚合物H02C-CH2CH2-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-OH值得一提的是，在引發(fā)劑端和末端上具有相同官能團(tuán)的POZ在化學(xué)上是不同的，因?yàn)樵谝l(fā)劑端處的基團(tuán)與氮相連，而在末端處的基團(tuán)與碳相連。例如，下面的兩種聚合物均是PMOZ的丙酸衍生物，但不同在于引發(fā)劑端的丙酸與氮相連，而末端的丙酸與碳相連(為清楚起見示出了開始或結(jié)束單體單元)HOOCCH2CH2-N(COCH3)CH2CH2-PMOZ-OHM-PMOZ-N(COCH3)CH2CH2-0-CH2CH2COOH但制備含活性官能團(tuán)的聚噁唑啉的另一途徑是使單體(如2-乙基-2-噁唑啉)與在2-位上有活性官能團(tuán)的噁唑啉單體共聚。例如，Jordan和其同事已制備了2-位上有乙炔和被保護(hù)的醛、羧酸和胺的噁唑啉(F.C.Gaertner,R.Luxenhofer,B.Blechert,R.JordanandM.Essler,J.ControlledRelease,2007,119，291-300)。這些功能性單體與2-乙基-2-噁唑啉的共聚產(chǎn)生含多個(gè)懸掛或側(cè)鏈活性官能團(tuán)的無規(guī)共聚物。例如，用三氟曱磺酸曱酯引發(fā)2-乙基-2-噁唑啉和2-戊炔基-2-噁唑啉的聚合，并隨后用派溱(NHC4HsNH)終止產(chǎn)生如下無規(guī)共聚物CHr{[N(COCH2CH3)CH2CH2]n-[N(COCH2CH2CH2-CCH)CH2CH2]m}ran-NC4H8NH下標(biāo)"ran"表示該聚合物為無規(guī)共聚物。n的值通常為約20-30而m為約2-5。為使POZ與靶分子(如但不限于多肽)偶聯(lián)，有必要通過在聚合物的至少一個(gè)末端連上能與靶分子上的基團(tuán)形成連接的活性官能團(tuán)來"活化"該聚合物。關(guān)于活化POZ以與靶分子偶聯(lián)所做的工作尚很少?；钚曰鶊F(tuán)可加在引發(fā)劑(左)端處或末(右)端處或兩端處。例如，當(dāng)耙分子為多肽時(shí)，多肽表面上有許多可與POZ上的活性官能團(tuán)反應(yīng)的氨基,在唯一出版了的連接POZ與蛋白質(zhì)的實(shí)例中，Myamoto和其同事將下面的POZ與過氧化氫酶的氨基相連(M.Myamoto,T.Saeg脂，etal"Macromolecules，1990，23，3201-3205):M-PMOZ-02C-CH2CH2CH2-C02-NHS在這種情況下，使M-PMOZ-OH與戊二酸酐反應(yīng)，所得羧酸經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(由NHS表示)活化。NHS活性酯是常用的羧酸活性形式。在本實(shí)例中，POZ-過氧化氫酶偶聯(lián)物經(jīng)證實(shí)是活性的?，F(xiàn)有技術(shù)已描述了三種能與把分子偶聯(lián)的末端活化的POZ化合物。但各個(gè)前述POZ衍生物均受到限制。Zalipsky描述了活化的丙酸POZ化合物NHS-OOCCH2CH2-PEOZ-OH,其中活化基團(tuán)與分子的引發(fā)劑端相連(S.Zalipsky,C.B.Hansen,J.M.OaksandT.M.Allen，丄Pharm.Sci.,85,133-137(1996))。該P(yáng)OZ化合物通過用含活化基團(tuán)的部分引發(fā)聚合來制備。但Jordan、Hoogenboom等已說明用不同的活化基團(tuán)引發(fā)聚合可能需要很不同的反應(yīng)條件，從而需要廣泛的研究來確定最佳反應(yīng)條件。因此，如果選擇引發(fā)劑法來制備活化的POZ化合物，則"、須進(jìn)行探索性工作來為每種新化合物確定適宜的反應(yīng)條件。此外，上面的化合物是雙官能的，因?yàn)槠溆闪u基而非惰性基團(tuán)(如烷基)所終止。另外，如下面所討論的，用面代烷引發(fā)的聚合不經(jīng)由活性陽離子機(jī)制進(jìn)行并因此發(fā)現(xiàn)多分敉性高。Myamoto和Zalipsky已制備了NHS-活化的戊二酸酯衍生物。該衍生物自含OH基團(tuán)作為末端活化基團(tuán)的單官能POZ聚合物(M-PMOZ-OH)制備。但戊二酸酯和琥珀酸酯衍生物具有連接乾分子與POZ化合物的水解不穩(wěn)定的酯連接。例如，NHS-活化的戊二酸酯衍生物將如所示與耙分子(這里以蛋白質(zhì)示意)反應(yīng)M-PMOZ-02C-CH2CH2CH2-C02-NHS+PROTEIN順—+M-PMOZ-02OCH2CH2CHrCONH-PROTEIN由于水解不穩(wěn)定的酯連接，故所產(chǎn)生的靶分子-POZ偶聯(lián)物在生理?xiàng)l件下的生物體系(如人或其他哺乳動(dòng)物)中將不穩(wěn)定，而將水解而使POZ與蛋白質(zhì)分裂M-PMOZ-02OCH2CH2CHrCONH-PROTEIN+->M-PMOZ-OH+HO2C-CH2CH2CHrC0NH-PR0TEIN此外，在上面的圖式中，當(dāng)靶分子-POZ偶聯(lián)物因不穩(wěn)定的酯連接的分裂而水解時(shí)，所得靶分子將含"標(biāo)簽"或"半抗原"，其可導(dǎo)致靶分子的免疫原性。最后，已制備出了鄰二硫吡啶(OPSS)衍生物(G.Hsiue，etal.，BioconjugateChem.,2006,17,781-786)。理論上該衍生物可與蛋白質(zhì)硫醇基團(tuán)偶聯(lián)產(chǎn)生二硫化物連接，雖然Hsiue未進(jìn)行此工作，但眾所周知二硫化物是不穩(wěn)定的而容易在血漿中還原。阻礙已知的POZ聚合物用于修飾耙分子的另一問題在于一些POZ聚合物不具有單個(gè)活性官能團(tuán)；即它們不是"單官能的"。如果要設(shè)法避免交聯(lián)和/或在聚合物主鏈上與多個(gè)靶分子結(jié)合，則單官能性是必要的。例如，Jordan和其同事已發(fā)表著作示出了2-乙基-2-噁唑啉與含官能團(tuán)的噁唑啉單體的共聚。這些懸掛官能團(tuán)有時(shí)能與肽偶聯(lián)。但該技術(shù)未設(shè)計(jì)為提供單官能POZ聚合物，而是產(chǎn)生含沿主鏈的懸掛基團(tuán)的多官能化合物。在POZ主鏈中存在多個(gè)官能團(tuán)有時(shí)可能是有利的，但在與多官能靶分子(如但不限于多肽和蛋白質(zhì))偶聯(lián)時(shí)會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)和團(tuán)聚體形成。此外存在希望單個(gè)靶分子與聚合物偶聯(lián)的情況，而多官能POZ聚合物不允許這樣做。上述官能POZ化合物中的一些具有與靶分子(如蛋白質(zhì)和小分子藥物)偶聯(lián)的潛能。但如對聚乙二醇修飾療法進(jìn)行的工作已表明的，聚合物修飾藥物的商業(yè)開發(fā)通常需要采用分子量(MW)高達(dá)40,000Da或以上以及分子量分布或多分散性(PD)低于1.1的聚合物。大量的工作已表明用常規(guī)技術(shù)的POZ不能獲得在上述范圍內(nèi)的MW和PD。通常見到的是，隨著增長的POZ鏈的分子量達(dá)到大約5，000Da,多分散性也略孩t增高。副反應(yīng)(包括鏈轉(zhuǎn)移)開始大量發(fā)生。非樣的條件對于工業(yè)規(guī)4莫的制備來說是不現(xiàn)實(shí)的(J.S.ParkandK.Kataoka,Macromolecules,39,6622(2006))。Hoogenboom、Schubert及其同事指出，4氐-PDPOZ可通過使用微波照射制備，但用這種技術(shù)同樣不能得到工業(yè)規(guī)模的聚合(R.M.Paulus，，T.Erdmenger,C.R.Becer,R.HoogenboomandU.S.Schubert,Macromol.RapidComm.,28,484-491(2007))。由于通常發(fā)現(xiàn)多分散性寬，故迄今所述的官能POZ化合物在聚合物療法中的使用嚴(yán)重受限。阻礙POZ衍生物用于修飾靶分子的又一問題在于不能得到一系列能在一系列條件下與靶分子反應(yīng)的適宜的活化的POZ分子。此外，目前可得到的POZ分子是多官能的或當(dāng)與靶分子偶聯(lián)時(shí)含水解不穩(wěn)定的鍵，而具有與之相關(guān)的缺點(diǎn)，或活性取代基在引發(fā)反應(yīng)過程中加入，而具有與之相關(guān)的缺點(diǎn)。此外已描述了懸掛官能性，但這些衍生物是多官能的而不適合本應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本公開提供了具有一系列活性基團(tuán)的單官能POZ衍生物，所述活性基團(tuán)可使所述單官能POZ衍生物與廣泛的靶分子在廣泛的反應(yīng)條件下偶聯(lián)以產(chǎn)生水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物，其中，一個(gè)靶分子與POZ衍生物結(jié)合。提供具有一系列能在不同的反應(yīng)條件下與靶分子上的選定基團(tuán)反應(yīng)的活性基團(tuán)的單官能POZ衍生物的能力提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的顯著優(yōu)勢，因?yàn)椴煌陌蟹肿訉Σ煌姆磻?yīng)條件敏感且對于POZ衍生物與靶分子的偶聯(lián)來說最有效的反應(yīng)條件常隨靶分子的褲質(zhì)及靶分子上與POZ衍生物反應(yīng)的基團(tuán)而異。本公開通過提供一系列本領(lǐng)域中先前未知的POZ衍生物解決了前述POZ聚合物的局限。另外，本公開提供了本領(lǐng)域中先前未知的單官能POZ衍生物。此外，本公開提供了在其末端上有活性官能團(tuán)的單官能POZ衍生物。此外，本公方法利用含易于得到且可用熟知的制備化學(xué)獲得的終止劑端基(如但不限于羥基)的POZ分子。然后可通過以逐步方式偶聯(lián)小的活性分子與可利用的端基而在POZ衍生物(如本文中所述)上生成所需的活性官能團(tuán)來制得廣泛的POZ衍生物。此外，本公開通過使用所述的單官能POZ衍生物提供水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物而解決了現(xiàn)有技術(shù)的局限。這樣的方法不僅提供了其中不超過一個(gè)靶分子與每種POZ衍生物結(jié)合的靶分子-POZ偶聯(lián)物，而且提高了靶分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期并減少了與靶分子的"半抗原標(biāo)記"有關(guān)的免疫原性問題。所公開的單官能POZ衍生物、合成方法和所得水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物在現(xiàn)有技術(shù)中尚未i人識到。因此，所述的單官能POZ衍生物和合成方法避免了現(xiàn)有技術(shù)中固有的問題并提供了產(chǎn)生其中一個(gè)靶分子與POZ衍生物結(jié)合的水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物的才幾制。如下面更詳細(xì)地討論的，任何2-取代-2-噁唑啉化合物(如但不限于PMOZ和PEOZ)均可用來產(chǎn)生本公開的POZ衍生物。在某些實(shí)施方案中，PEOZ或PMOZ為2-取代-24惡唑啉POZ分子。如本領(lǐng)域中熟知的，2-烷基-2-噁唑啉分子中不同的烷基可為本文中所述的POZ衍生物提供不同的溶解性、藥代動(dòng)力學(xué)和膜滲透能力。此外，POZ聚合物主鏈中重復(fù)單元的性質(zhì)可相同以產(chǎn)生均聚物(如但不限于PMOZ和PEOZ)或至少一個(gè)重復(fù)單元可不同以l是供共聚物(如但不限于無規(guī)或嵌段共聚物)。此外，本公開提供了合成具有低多分散性(PD)值且由不希望的副反應(yīng)(如但不限于鏈轉(zhuǎn)移)所產(chǎn)生的雜質(zhì)的量減少的POZ聚合物的新方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開描述了最大限度減少不希望的副反應(yīng)(如但不限于鏈轉(zhuǎn)移)的新方法，從而使純度提高的POZ聚合物產(chǎn)物的PD值低。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的方法提供了在提高的MW值下具有低PD值的POZ衍生物。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生的POZ聚合物的雜質(zhì)量減少。本公開中提供的新方法是對現(xiàn)有技術(shù)方法的改進(jìn)并提供了適用于修飾廣泛的靶分子的POZ聚合物的大規(guī)模工業(yè)制備。因此，本公開也提供了純度提高且PD值低的適用于藥物應(yīng)用中的POZ聚合物。如本領(lǐng)域中熟知的，PD值將隨MW而變；一般來說，隨著分子量增大，PD值也增大。使用本公開的方法可以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)各種MW的POZ聚合物，所述POZ聚合物在給定MW下的PD值比用現(xiàn)有4支術(shù)的工業(yè)適用方法可產(chǎn)生的低。例如，使用本乂>開的方法可產(chǎn)生MW為20,000Da或以下、PD值低于或等于l.l的POZ衍生物。在另一特別的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的前述POZ衍生物的雜質(zhì)量減少。如本領(lǐng)域中熟知并在本文中的實(shí)施例中示出的，使用現(xiàn)有技術(shù)的方法合成的POZ衍生物含有某些雜質(zhì)，這些雜質(zhì)在GPC圖中表現(xiàn)為高M(jìn)W肩和低MW尾。這些雜質(zhì)至少部分是通過不希望的副反應(yīng)(如但不限于鏈轉(zhuǎn)移)生成的。因此，所公開的POZ衍生物適用于修飾廣泛的把分子。通過使用本文中所述的方法，可得到一系列具有不同的活性官能團(tuán)的單官能POZ衍生物。此外，本公開提供了以高效方式產(chǎn)生這類單官能POZ衍生物的合成方法。最后，通過^f吏用所述的單官能POZ^f汙生物，可產(chǎn)生其中一個(gè)輩巴分子與POZ衍生物結(jié)合的水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。合成低PDj直POZ書f生物的方法聚合2-芳基-和2-烷基-2-噁唑啉的現(xiàn)有技術(shù)源于Kobayshi、Nuyken和Jordan的出版物(S.Kobayashi,E.Masuda,S.ShodaandYShimano，Macromolecules,1989，22,2878-2884;A.Gross,G.MaierandO.Nuyken，Macromol.Chem.Phys.，1996，197，2811-2826;和F.C.Gaertner，R.Luxenhofer,B.Blechert，R.JordanandM.Essler,J.ControlledRelease,2007,119，291-300)。在這些方法中，聚合由親電試劑(如對甲苯磺酸烷基酯或三氟曱磺酸烷基酯)引發(fā)；在一個(gè)實(shí)施方案中，使用曱苯磺酸曱酯或三氟曱磺酸曱酯。使用這些強(qiáng)親電試劑是為了通過活性陽離子機(jī)制促進(jìn)聚合，因?yàn)槔碚撋显摍C(jī)制不會(huì)產(chǎn)生終止或鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)(Q.Liu,M.KonasandJ.S.Riffle,Macromolecules,1993，26,5572-5576)(參見圖1)。但從現(xiàn)有技術(shù)已知，'鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)確實(shí)發(fā)生且該反應(yīng)不嚴(yán)格按活性陽離子機(jī)制進(jìn)行。如果使用弱親電試劑(如但不限于卣代烷)，則反應(yīng)會(huì)按共價(jià)機(jī)制進(jìn)行，結(jié)果PD顯著增大?，F(xiàn)有技術(shù)聚合方法使用氯苯、二氯苯或乙腈作為溶劑。增長階段在約80。C下進(jìn)行約1-3天。終止通過對碳酸鈉水溶液于80-90。C下加熱進(jìn)行而產(chǎn)生羥基端基或通過與仲胺(如嗎啉或哌咬)反應(yīng)而得到末端的叔胺。這些典型的現(xiàn)有技術(shù)方法的使用導(dǎo)致凝膠滲透色譜中約5-10。/。的高-MW肩及顯著的低-MW尾的存在。本領(lǐng)域中已注意到這樣的結(jié)果(參見J.ParkandK.Kataoka,Macromolecules，2006，39，6622-6630)。文獻(xiàn)中常見才是到，這種MW分布的變寬是由于通過消除-二聚機(jī)制進(jìn)行的鏈轉(zhuǎn)移，雖然該過程的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和實(shí)驗(yàn)支持是有限的(M.Litt,A.LevyandJ.Herz,J.Macromol.Sci.-Chem.,1975,A9，703-727)。到鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)確實(shí)發(fā)生的程度，這樣的反應(yīng)不能祐」認(rèn)為是真正的活性聚合。因此，減少不希望的副反應(yīng)(如鏈轉(zhuǎn)移)的發(fā)生是有利的。本申請人已弄清了消除-二聚機(jī)制的細(xì)節(jié)、為該機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支持并提出了關(guān)于終止步驟的機(jī)制的推論。這一新近進(jìn)展特別重要，因?yàn)槠浣沂玖藶楹文承┙K止反應(yīng)會(huì)失敗而使我們選擇成功的終止反應(yīng)。這樣的發(fā)現(xiàn)在本領(lǐng)域中尚未見述及且其為創(chuàng)建最大限度地減少不希望的副反應(yīng)的發(fā)生并產(chǎn)生所需的終止產(chǎn)物的合成方法提供了指導(dǎo)。如本文中所討^侖的j吏用現(xiàn)有:f支術(shù)方法產(chǎn)生的POZ產(chǎn)物中含占POZ產(chǎn)物總質(zhì)量的約5-10%的高M(jìn)W肩。該高M(jìn)W肩導(dǎo)致用現(xiàn)有技術(shù)合成方法獲得的PD值不可接受?，F(xiàn)有技術(shù)方法中觀察到的高M(jìn)W肩至少部分由聚合和/或終止步驟過程中形成的高-MW二聚體組成(參見圖3)。消除-二聚機(jī)制預(yù)計(jì)，如果鏈轉(zhuǎn)移在終止步驟過程中發(fā)生，則高M(jìn)W肩中的物質(zhì)將約是所需產(chǎn)物的MW的兩倍。此外，如果鏈轉(zhuǎn)移在增長步驟過程中發(fā)生，則將引發(fā)新的聚合物鏈，且由于此時(shí)單體濃度較低，故該聚合物的MW將低于聚合物本體的MW。此外，由于該新的聚合物鏈由鏈轉(zhuǎn)移得到，故其必須由質(zhì)子而不是曱基引發(fā)，因此該聚合物的MALDI譜將呈現(xiàn)出一組比主峰的低14Da的峰。關(guān)于終止步驟也有迄今尚未認(rèn)識到的推論。例如，為強(qiáng)堿和弱親核試劑的終止親核試劑的加入預(yù)計(jì)將導(dǎo)致顯著的消除和二聚。此外，噁唑啉鹽陽離子是離域的或"軟"親電試劑，且理論預(yù)測"軟"或彌散的親核試劑會(huì)更可能用作終止親核試劑而非用作堿。舉例來說，可以預(yù)期"軟"硫醇鹽是比"硬"醇鹽更有效的終止劑。上面的預(yù)測得到了實(shí)驗(yàn)的確認(rèn)。在一個(gè)實(shí)施例中，加入了空間受阻的乙基二異丙基胺(強(qiáng)堿和弱親核試劑)來終止2-乙基-2-噁唑啉聚合。該反應(yīng)導(dǎo)致高M(jìn)W二聚體產(chǎn)物增多至75%(參見實(shí)施例3)。經(jīng)確認(rèn)，GPC中雜質(zhì)峰的MW約為所需產(chǎn)物的MW的兩倍。此外，MALDI-TOF譜確認(rèn)，部分主峰具有比預(yù)期的小14質(zhì)量單位的第二組峰。我們已觀察到，該第二組峰的MW稍小于所需產(chǎn)物的MW的兩倍。這大概因?yàn)樵诰酆衔锿耆纬啥鴨误w被耗盡之前、在增長階段過程中發(fā)生了某鏈轉(zhuǎn)移而發(fā)生；在這種情況下，所述堿必定是單體，因?yàn)槠涫窃鲩L過程中存在的最強(qiáng)的堿。此外，由已知為硬親核試劑的醇鹽進(jìn)行終止導(dǎo)致大量的高M(jìn)W二聚體而沒有源自所需親核攻擊的產(chǎn)物(參見實(shí)施例5)。此外，由已知為軟親核試劑的硫醇鹽進(jìn)行終止確實(shí)如預(yù)測的那樣導(dǎo)致了所需的親核攻擊產(chǎn)物(參見實(shí)施例11)。基于前述觀察，本申請人已開發(fā)出了新的合成方法，所述新的合成方法減少了不希望的副反應(yīng)(如鏈轉(zhuǎn)移)，并可制備出比現(xiàn)有技術(shù)具有更優(yōu)異的性質(zhì)的POZ聚合物和衍生物。所述改進(jìn)的方法可用到如下改進(jìn)中的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，POZ聚合反應(yīng)由強(qiáng)親電試劑(如但不限于對曱苯磺酸烷基酯或三氟曱磺酸烷基酯)引發(fā)；在一個(gè)實(shí)施方案中，使用曱苯磺酸曱酯或三氟曱磺醆曱酯。消除-二聚機(jī)制也表明，增長和終止應(yīng)在低溫下進(jìn)行，因?yàn)楦邷赜兄陔p分子消除。實(shí)施例通過示出降低增長和終止的溫度會(huì)減少高M(jìn)W二聚體的形成來確認(rèn)了此言論。此預(yù)測也已得到了Kataoka的確認(rèn)(參見J.ParkandK.Kataoka,Macromolecules,2006,39,6622-6630)。但如果降j氐溫度至足以消除所有鏈轉(zhuǎn)移，則可能要花數(shù)周來達(dá)到反應(yīng)的完成，因此這樣的反應(yīng)在工業(yè)上是不可行的。本公開下面描述的方法是工業(yè)上可行的。我們已觀察到，在增長完成或接近完成后繼續(xù)加熱將引起消除-二聚的產(chǎn)生。本公開已驚人地發(fā)現(xiàn)，通過比現(xiàn)有技術(shù)方法中早得多地且在更低溫度下終止聚合，POZ衍生物的質(zhì)量大大改進(jìn)。此外，增長反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間為單體完全或基本完全(高于或等于90%)消耗所需的最短時(shí)間。應(yīng)指出，增長反應(yīng)的溫度和持續(xù)時(shí)間是相互關(guān)聯(lián)的。換句話說，可使用較高的增長溫度和較短的增長反應(yīng)時(shí)間。相反，如果使用較長的增長反應(yīng)時(shí)間，則應(yīng)相應(yīng)降低溫度。也已發(fā)現(xiàn)，溶劑(如但不限于氯苯)的使用比對于POZ產(chǎn)物的工業(yè)大規(guī)模制備來說關(guān)鍵性的常用乙腈溶劑提供更快的聚合。雖然現(xiàn)有技術(shù)已認(rèn)識到以氯苯作溶劑，但尚未認(rèn)識到對反應(yīng)速率的改進(jìn)。使用氯苯作溶劑提供更快的反應(yīng)時(shí)間這一出乎意料的結(jié)果4吏聚合反應(yīng)可較早地在較高溫度下終止，而不增加高M(jìn)W二聚體產(chǎn)物的形成。這樣的改進(jìn)是本領(lǐng)域中未認(rèn)識到的。此外，POZ產(chǎn)物、特別是用OH基團(tuán)終止的那些，通過陽離子交換樹脂的過濾改善PD值。據(jù)認(rèn)為這樣的過濾將除去低-MW和高-MW產(chǎn)物。對于較高分子量的POZ產(chǎn)物(例如10,000Da及以上的那些產(chǎn)物)，過濾的效果尤其顯著；但過濾為POZ衍生物提供的好處與MW無關(guān)。給出該改進(jìn)的一個(gè)實(shí)例，未經(jīng)過濾的M-PEOZ-OH10,000(通過本乂>開的方法制備)顯示出Mn為7950Da、PD為1.21(GPC),具有顯著的低-MW尾。該產(chǎn)物通過羧乙基-瓊脂糖凝膠過濾后得到的Mn為9180Da、PD為1.05(根據(jù)GPC),以及Mn為9780、PD為l.Ol(根據(jù)MALDI)，且沒有可觀察到的低-MW尾，而有微不足道的2。/。的高-MW肩(才艮據(jù)GPC測定)。粗產(chǎn)物未呈現(xiàn)出高-MW肩的事實(shí)表明，陽離子交換過濾既除去了低-MW雜質(zhì)也除去了高-MW雜質(zhì)。此外，在某些情況下，如果POZ產(chǎn)物包含羧酸作為端基，則可使用陰離子交換色譜來分離所需的產(chǎn)物和除去所形成的任何高分子量產(chǎn)物。我們已對M-PEOZ-S-CH2CH2-C02H進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)。值得一提的是，該色譜實(shí)驗(yàn)表明高-MW二聚體是中性的。因此，主要的二聚產(chǎn)物必定為圖3的鏈烯。在該實(shí)驗(yàn)中，粗產(chǎn)物的Mn為9600Da，PD為1.09(GPC)，并有6%的高-MW肩。在DEAE-瓊脂糖凝膠上的陰離子交換色譜后，Mn為9500Da,PD為1.06(GPC)，且無高-MW肩。在另一實(shí)施方案中，終止反應(yīng)在低溫(在一個(gè)實(shí)施方案中，低于80。C;在一個(gè)可替選的實(shí)施方案中，15-4(TC)下用比作為堿更好的親核試劑的親核試劑進(jìn)行；示例性的親核試劑包括W旦不限于軟親核試劑，如石危醇鹽。本申請人已發(fā)現(xiàn)，醇鈉化合物作為終止劑的使用不產(chǎn)生所需的產(chǎn)物；而是保留未終止的陽離子。但硫醇鈉和相關(guān)化合物(如但不限于NaS-CH2CH2-C02Et)的使用產(chǎn)生高效的終止并得到具有所需性質(zhì)(如但不限于低PD值)的POZ產(chǎn)物。陰離子交換色譜后，該酯水解成為羧酸而產(chǎn)生具有低PD值和無高-MW肩的高質(zhì)量POZ產(chǎn)物。在一個(gè)這樣的實(shí)例中，M-PEOZ-S-CH2CH2-C02H的Mn為9600Da、PD為1.09(GPC)并有6%的肩。在DEAE-瓊脂糖凝膠上的陰離子交換色譜得到Mn為9500、PD為1.06(GPC)、且無肩。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠明白，合成中的這些改進(jìn)可以各種組合使用；前述內(nèi)容不應(yīng)理解為需要在給定的合成中使用各個(gè)所述改進(jìn)。使用兩種現(xiàn)有技術(shù)方法合成M-PEOZ-OH2000。這些POZ書f生物的合成的描述在實(shí)施例1(對于圖2A)和實(shí)施例2(對于圖2B)中給出。分析所產(chǎn)生的POZ衍生物。對于圖2A的POZ衍生物，GPC呈現(xiàn)出具有可感知的高-MW肩(Mn=3600Da，9%)的單個(gè)峰。主峰的Mn為1980Da，PD為1.08。NMR呈現(xiàn)出預(yù)期的峰(參見實(shí)施例6)。MALDI-TOFMS呈現(xiàn)出一組最大值在2000Da、PD1.04和分離99.1Da的峰。MALDI譜也呈現(xiàn)出具有分離99.1Da的第二組峰，但各峰比主要的那組^氐14Da。這組峰的最大^f直發(fā)生在1600Da。對于圖2B的POZ衍生物，GPC呈現(xiàn)出具有可感知的高-MW肩(Mi^3300Da,6%)的單個(gè)峰。主峰的Mn為2200Da,PD為1.06。NMR呈現(xiàn)出預(yù)期的峰(參見實(shí)施例6)。MALDI-TOFMS呈現(xiàn)出一組最大值在2300Da和分離99.1Da的峰。MALDI譜也呈現(xiàn)出具有分離99.1Da的第二組峰，但備峰比主要的那組低14Da。這組峰的最大值發(fā)生在2100Da。使用本公開的方法合成用于比較的兩種POZ衍生物M-PEOZ-OH2000(圖4A)和M-PEOZ-OH5000(圖4B)。這些POZ衍生物的合成的描述在實(shí)施例6(對于圖3A)和實(shí)施例7(對于圖4B)中給出。圖4A和圖4B中給出了GPC色譜。圖大改進(jìn)的GPC。對于M-PEOZ2000，反應(yīng)條件為(a)三氟甲磺酸曱酯引發(fā)，在氯苯中于110。C增長1.5小時(shí)，以及在室溫下用碳酸鹽水溶液終止。觀察到M-PEOZ2000衍生物的Mn為1900Da(根據(jù)MALDI和GPC)、PD為1.07(GPC)和1.03(MALDI)、且無高國MW肩也無低畫MW尾。對于M畫PEOZ畫OH5000，反應(yīng)條件為(a)三氟曱磺酸曱酯引發(fā)，在氯苯中于42。C增長1小時(shí)，然后于80°C增長3.75小時(shí)，以及在室溫下用碳酸鹽水溶液終止。觀察到M-PEOZ5000衍生物的Mn為4卯0Da(根據(jù)MALDI)、PD為1.06(GPC)和1.02(MALDI)、有非常輕微的高-MW肩(P/。)、無低-MW尾。在類似條件下制得的M-PEOZ-OH10,000的Mn為9780Da(MALDI)、PD為1.01(MALDI)和1.05(GPC),有2%的非常輕微的高-MW肩?？傊?，本公開的申請人已弄清了當(dāng)使用現(xiàn)有技術(shù)的合成方法時(shí)發(fā)生的不希望的副反應(yīng)的性質(zhì)，從而使本申請人確定最大限度地減少這類副反應(yīng)的影響的反應(yīng)條件。因此，本公開的方法可制備出比現(xiàn)有技術(shù)中可得到的那些具有更優(yōu)異的性質(zhì)的POZ聚合物和衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的方法可制備出具有低PD值的POZ聚合物和書f生物；在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本公開的方法可制備出在高M(jìn)W值下具有低PD值的POZ聚合物和衍生物。此外，本公開的方法可以適于大規(guī)模生產(chǎn)的方式生產(chǎn)前述POZ聚合物和書f生物。具有這類特征的這類POZ聚合物和衍生物及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域中缺乏的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的方法通過提供完全或部分地減少POZ合成的引發(fā)、聚合或終止過程中發(fā)生的一種或多種副反應(yīng)而在POZ聚合物合成中提供這樣的好處。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述副反應(yīng)為鏈轉(zhuǎn)移過程。這類不希望的副反應(yīng)(如但不限于鏈轉(zhuǎn)移過程)是制備POZ產(chǎn)物的現(xiàn)有技術(shù)程序中存在的問題。這樣的副反應(yīng)使POZ衍生物具有不希望的特征，如高PD值。合成單官能POZ衍生物的方法本公開提供了合成所述單官能POZ衍生物的新方法。該新的合成方法在本文中通常稱為構(gòu)建單元法(buildingblockmethod)。在構(gòu)建單元法的一個(gè)實(shí)施方案中公開了一步合成法。在構(gòu)建單元法的一個(gè)可替選的實(shí)施方案中公開了兩步法。在構(gòu)建單元法的另一可替選的實(shí)施方案中描述了活性聚合物合成。每種方法均將在下面更詳細(xì)地描述。構(gòu)建單元一步法在構(gòu)建單元法的第一個(gè)實(shí)施方案中公開了一步法。在一步法中，通過單個(gè)末端官能化的POZ分子與含所需活性基團(tuán)的一組化合物間的反應(yīng)在單個(gè)步驟中生成一系列單官能POZ衍生物。這樣，單個(gè)末端官能化的POZ分子可被轉(zhuǎn)化為一系列活化的單官能POZ衍生物。該方法意味著僅需要優(yōu)化制備單個(gè)單官能POZ衍生物的聚合化學(xué)。POZ端基(下面的Y)經(jīng)仔細(xì)選取以使這一系列反應(yīng)可提供一系列活性基團(tuán)。所述一步法的一般形式可由如下圖式1代表Ri國POZ-Y—R廣POZ-Pp-Qq-XI圖式l其中，POZ為-[N(COR7)CH2CH2]n-;各重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在一個(gè)實(shí)施方案中含1-12個(gè)碳；R,為氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合；R2-R4、Ru和R『Ri5各自獨(dú)立地選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一個(gè)實(shí)施方案中含1-10個(gè)碳；R8為《61110-0"12-(環(huán)己亞曱基)；R23為未取代的或取代的烷基、烯基、炔基或芳烷基集合(在一個(gè)實(shí)施方案中含l-10個(gè)碳原子)、或?yàn)槿〈幕蛭慈〈姆蓟?；Y為-OH、-SH、-S-(CH2)k-C02H、哌溱基、取代哌嗪基、取代哌啶基、或-NHR2;P為連接基團(tuán)；P可為任何能形成圖式l中所示的連接的基團(tuán)并可根據(jù)與其形成連接的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)來選擇；代表性的P基團(tuán)包括但不限于-O-、-S-、-NH-、-NR-、或未取代的雜環(huán)基(如但不限于派溱基(NC4H8N));Q為連接基團(tuán)；Q可為任何能形成圖式l中所示的連接的基團(tuán)并可才艮據(jù)與其形成連接的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)來選擇；代表性的Q基團(tuán)包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或畫CO-Rs、-(1115)1-或-(CR3R4)m;n為3-1000的整數(shù)；k和m為獨(dú)立地選自l-10的整凄t;p和q為獨(dú)立;也選自0或1的整數(shù)；X為能與靶分子形成連接而產(chǎn)生水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物的活性官能團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性官能團(tuán)選自如下大類的化合物醛(-CHO)、活性碳酸鹽(-O-CO-Z)、馬來酰亞胺、磺酸酯(-OS02-R23)(包括但不限于三氟乙基磺酸酯(2，2,2-三氟乙基磺酸酯)和曱磺酸酯(-0-S02-CH3或-OMs))、酰肼(_CONHNH2)、環(huán)氧化物、碘乙酰胺、炔、疊氮化物(-N3)、異氰酸鹽(-OCN)、氰酸鹽(-NCO)、異硫氰酸鹽(-SCN)、硫氰酸鹽(-NCS)、腈(-CN)、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卣、活性酉旨(-CO-Z)和羧酸(-C02-H);以及Z為活化基團(tuán)，本領(lǐng)域內(nèi)熟知的活性基團(tuán)有很多，包括N-琥珀酰亞胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亞胺氧基、對硝基苯氧基、1-咪唑基和l-苯并三唑氧基；活性官能團(tuán)也可通過本領(lǐng)域中熟知的方法保護(hù)起來而產(chǎn)生被保護(hù)的活性官能團(tuán)。例如，縮醛[CH(OR44)2]為示例性的保護(hù)基，其可水解產(chǎn)生醛基?；钚怨倌軋F(tuán)可被基團(tuán)(如但限于關(guān)于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或雜環(huán)基烷基所描述的那些基團(tuán))所取代。此外，活性官能團(tuán)包括可轉(zhuǎn)化為活性官能團(tuán)的那些化合物。例如，X基團(tuán)可包括被在某些反應(yīng)條件下可被水解的連接改性的化合物(如用來連接POZ衍生物與把分子的那些)，從而斷開連接而暴露活性官能團(tuán)以與靶分子上的基團(tuán)反應(yīng)。在圖式l中，反應(yīng)物RHPOZ-Y為POZ聚合的直接產(chǎn)物，Y基團(tuán)能直接轉(zhuǎn)化為一系列能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物的單官能POZ衍生物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，Y等于-OH且當(dāng)POZ聚合反應(yīng)由氫氧化物終止時(shí)獲得。在一個(gè)可替選的實(shí)施方案中，Y等于-NHR2且當(dāng)POZ聚合反應(yīng)由含氨基的化合物R2NH2終止時(shí)獲得。提供可用的Y基團(tuán)的其他可用的胺終止劑有艱，秦或取代的哌喚，如l-哌溱丙醇(H-NC4H8N-CH2CH2CH2-OH)。取代的派啶也可用，因?yàn)樗鼈兲峁┌吠ǔＬ峁┑目焖俳K止，且它們也引入一系列官能團(tuán)。市場上可獲得的取代的哌啶包括4-哌啶丁酸、3-哌咬羧酸和4-哌啶曱醇。在一個(gè)可替選的實(shí)施方案中，Y等于-S-CH2CH2-C02H且當(dāng)POZ聚合反應(yīng)CH2CH2-C02-CH3終止(隨后不經(jīng)分離即水解)時(shí)獲得。下面示出了說明經(jīng)由RHPOZ-X衍生物的一步法的制備的各種示例性反應(yīng)。在下面給出的反應(yīng)中，R!和R7為曱基，Y為-OH或-NHR2，其中112為CH3。,M-PMOZ-0-C02NHS可以看出上面的結(jié)構(gòu)落在圖式1的描述內(nèi)。例如，對于上面的活性碳酸鹽(M-PMOZ-OC02-NHS),Ri和R7為曱基，p和q為0,以及X為琥珀酰亞胺基碳酸酯。對于上面的活性酯(M-PMOZ-0-CH2-C02NHS)，R4和R7為甲基，P為-O-，p為l，Q為-CHr，q為l,以及X為-C02NHS。含上述活性基團(tuán)的單官能POZ衍生物提供若干有用而不同的性質(zhì)，從而可根據(jù)靶分子的性質(zhì)和所需的反應(yīng)條件選擇具有所需活性官能團(tuán)的特定單官能POZ布f生物。例如，當(dāng)活性官能團(tuán)為醛時(shí)，單官能POZ^f汙生物在限定的pH范圍內(nèi)主要與靶分子的N-端胺反應(yīng)以形成亞胺(其通常被氫硼化物還原為仲胺)。當(dāng)活性官能團(tuán)為活性酯時(shí)，單官能POZ衍生物主要與胺(包括但不限于靶分子上的非末端賴氨酸基團(tuán))反應(yīng)。同樣，當(dāng)活性官能團(tuán)為活性碳酸鹽或三氟乙基磺酸酯時(shí)，單官能POZ衍生物易于與胺反應(yīng)，但反應(yīng)條件和選擇性不同于活性酯和醛。此外，當(dāng)活性官能團(tuán)為乙烯基砜或馬來酰亞胺時(shí)，單官能POZ衍生物主要與硫醇反應(yīng)，但反應(yīng)條件隨各個(gè)基團(tuán)而不同，從而提供了一系列適合于一系列靶分子的反應(yīng)條件。重要的是，用上面的合成圖式形成的各個(gè)單官能POZ衍生物能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。構(gòu)造單元兩歩法在一個(gè)可替選的實(shí)施方案中公開了兩步合成法。在兩步法的第一步中，通過如上所述的聚合制得的起始聚合物產(chǎn)物(下面的RrPOZ-Y)與所需的化合物反應(yīng)產(chǎn)生POZ中間體(下面的RrPOZ-Y，)。在兩步法的第二步中，該P(yáng)OZ中間體再與一系列包含一系列活性官能團(tuán)的化合物反應(yīng)形成一系列能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶^:物的單官能POZ^f汙生物(下面的RrPOZ-X)。該兩步合成法具有僅用兩個(gè)反應(yīng)并從單個(gè)起始聚合物產(chǎn)物(R!-POZ-Y)開始提供一系列單官能POZ衍生物的優(yōu)勢，從而最大限度地減少針對多個(gè)聚合物產(chǎn)物優(yōu)化聚合條件的需要。該兩步法提供用一步法不能得到的單官能POZ衍生物。構(gòu)造單元兩步法的轉(zhuǎn)化的最一般形式在下面的圖式2中示出。R廣POZ-Y—R廣POZ-Y，—R廣POZ-XII圖式2構(gòu)造單元兩步法可以圖式3中的如下詳細(xì)形式示出。在圖式3中，Y，為能與T基團(tuán)所代表的功能性親核試劑反應(yīng)的活性基團(tuán)，包括但不限于活性酯和活性碳酸鹽。步驟1R廣POZ-Y—R廠POZ-Pp-Qq-Y，步驟2R廣POZ-Pp國Qq-Y，+T-Uu-X—R廣POZ誦Pp-Qq-Ww-Uu-XIII圖式3其中，R廠R4、R7、R8、Ru、Ri4-Ris、R23、POZ、P、Q、k、m、n、p、q、Y和X同如上所述；U為連接基團(tuán)；U可為任何能形成圖式3中所示的連接的基團(tuán)并可根據(jù)與其形成連接的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)來選擇；代表性的U基團(tuán)包括但不限于-(R^)。-、-(CR5R6)0-、-NH-R2rNHCO-R"-;o為一到十的整數(shù)；w和u為獨(dú)立地選自1或0的整數(shù)；R5、Re、R16、1121和1122各自獨(dú)立地選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在一個(gè)實(shí)施方案中含1-10個(gè)碳原子；R17選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合(在一個(gè)實(shí)施方案中含l-10個(gè)碳原子)、或取代的或未取代的芳基。Y'和T為反應(yīng)形成水解穩(wěn)定的連接W的反應(yīng)性對，其中Y，和T反應(yīng)性對和所得W連接選自表1中所示的那些基團(tuán)和連接。Y，和T基團(tuán)可反過來而不影響W連4姿的性質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>下面示出了說明水解穩(wěn)定的RrPOZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X衍生物的制備的示例性反應(yīng)。在該反應(yīng)中，Rt為氫，117為曱基，Y為-OH,p和q為O,11為-012012-,u為1，反應(yīng)性對T和Y，分別為-NH2和-0-C02-NHS,它們形成氨酯W連接，w為1，以及X為縮醛0皮保護(hù)的醛)H-PMOZ-OH今M-PMOZ~0-COrNHSH-PMOZ，OCOrNHS+NH2-CH2CHrCH(OEt)2+H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CH(Oa)2，其在水解后產(chǎn)生H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CHO。下面示出了圖式3的另一實(shí)例。在該反應(yīng)中，&和117為曱基，Y為-OH,P為-O-,p為l，Q為-CH2CH2-,q為l,反應(yīng)性對T和Y，分別為-NH2和-C02H，它們形成酰胺(-CONH)W連接，w為1,U為-CH2CH2-,u為1,X為縮醛0皮保護(hù)的醛)M-PMOZ-OH^M-PMOZ^>€H2CHrC02HM-PMOZ>OCH2CHrC+NH2-CH2CHrCH(OEt>2+M-PMOZ-0-CH2CHrCONH-CH2CHrCH(OEth其在水解后產(chǎn)生M-PMOZ-0-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CHO。如上面所討論的，圖式3的各活性官能團(tuán)在與靶分子的反應(yīng)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和特殊性。此外，T和Y，基團(tuán)與彼此的反應(yīng)性可通過Q和U基團(tuán)的性質(zhì)控制。通過如所述地增大Q和U基團(tuán)的尺寸來增大T和Y，和/或T和X基團(tuán)間的化學(xué)距離，改變Y，和T基團(tuán)的反應(yīng)性。此外，活性官能團(tuán)X與靶分子的反應(yīng)性可類似地調(diào)節(jié)。與一步法一樣，用上面的兩步合成圖式形成的各單官能POZ衍生物能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物?；钚跃酆衔锓椒ㄔ诒景l(fā)明的另一可替選的實(shí)施方案中，可使用小的活性分子來終止噁唑啉聚合以直接提供單官能POZ衍生物，其可與靶分子反應(yīng)形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。該方法被稱為活性聚合物方法?；钚跃酆衔锓椒ǖ淖钜话阈问娇捎扇缦聢D式4表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>圖式4其中，R廣R4、R7、Rs和Ri4-R！5、R23、POZ、Q、k、m、n、q、Y和X同如上所述；POZ+代表噁唑啉聚合過程中形成的陽離子-[N(COR7)CH2CH丄+;R,9選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一個(gè)實(shí)施方案中含l-10個(gè)碳原子；以及Nuc為能通過與末端陽離子-N(COR7)CH2CH2+相互作用終止活性POZ聚合反應(yīng)而形成水解穩(wěn)定的連接C的親核試劑，其中Nuc基團(tuán)和所得C連接可選自表2中所示的那些基團(tuán)和連接。表2-—些可能的Nuc基團(tuán)和C連接<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>下面給出了說明RrPOZ-C-Qq-X衍生物的制備的示例性反應(yīng)。在下面所示的反應(yīng)中，R!和R7為曱基，Nuc為-NH2，C為-NH-,Q為-CHr,q為l，以及X為-C02H(注曱酯在下面的反應(yīng)過程中水解)CH3-PMOZ++-S-CH2-C02CH3—CHrPMOZ-S-CH2-C02H與本領(lǐng)域中的意見相反，本公開表明，醇鹽(如-0-CH2-C02-CH3)捕獲陽離子不產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。如表2中所提及的，當(dāng)使用哌溱和旅咬作為Nuc基團(tuán)時(shí)，C連接將結(jié)合進(jìn)哌溱和哌啶環(huán)結(jié)構(gòu)中。下面提供了用旅溱和哌咬作為Nuc基團(tuán)所得到的C連接及結(jié)構(gòu)的實(shí)例。在該反應(yīng)的一個(gè)實(shí)施方案中，硫醇鹽化合物被用來終止噁唑啉聚合。在該噁唑啉鹽陽離子的POZ聚合物。通過向反應(yīng)中加入親核硫醇鹽分子來終止該反應(yīng)，從而終止活性POZ聚合。硫醇鹽分子包含能與靶分子上的基團(tuán)反應(yīng)而形成水解穩(wěn)定的連接的活性官能團(tuán)(該活性官能團(tuán)可如本文中所述被保護(hù)起來)。在該方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，疏醇鹽具有結(jié)構(gòu)R25S-Dd-X，其中X的定義同上；R25為金屬；在一個(gè)實(shí)施方案中，R25為Li、Na或K;D為連接基團(tuán)，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)b-CONH-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b、-CO-(CH2)b-、-CO-C6H4-、或-CO腸R26或-(CR27R28)b;R27和R28各自獨(dú)立地選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一個(gè)實(shí)施方案中含1-10個(gè)碳；R26為《6111()-012-(環(huán)己亞曱基)；d為0或1;以及b為1-10的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性官能團(tuán)為凈皮保護(hù)的官能團(tuán)或可轉(zhuǎn)化為活性官能團(tuán)的化合物。如上面所討論的，各活性官能團(tuán)在與靶分子的反應(yīng)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和特殊性。如同上述，用上面的合成圖式形成的各單官能POZ衍生物能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。特定的POZ衍生物本公開描述了多種可通過上述方法制備的單官能POZ衍生物。此外，本公開描述了許多可用于合成本公開的單官能POZ衍生物的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，單官能POZ衍生物由通式(I)、(III)或(IV)描述R廣POZ-Pp-Qq國XR廣POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-XR廣POZ隱C畫Qq-X(I)(HI)(IV)其中通式(i)、(n)和(ni)中的定義與上面關(guān)于圖式1-4中所提供的相同。此外，下面提供了本公開的單官能POZ衍生物的若干具體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)僅為示例的目的給出，而非意在限制本文中所述的單官能poz衍生物的范圍。同上，當(dāng)在下面提及時(shí)，上面的圖式1-4中給出的定義適用于下面的結(jié)構(gòu)；下面的定義也適用于可應(yīng)用的地方。此外，對于下面提供的所有結(jié)構(gòu)，R,基團(tuán)應(yīng)理解為含在SI發(fā)劑基團(tuán)的位置處(POZ基團(tuán)的左側(cè))。R9為連接部分，如-(R!6)o-或國NH-R2廣NHCO-R22國；G為未取代的或取代的芳基或取代的或未取代的烷基、烯基或炔基，如但不限于氟代烷基；以及Ar為未取代的芳基或取代的芳基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供了通過構(gòu)造單元一步法制得的單官能POZ衍生物。源自該途徑的示例性結(jié)構(gòu)包括但不限于如下結(jié)構(gòu)。POZ-P-(CR3R4)rCH<OR14)2POZ-P-(CR3R4)ra-eHOandPOZ-NHCO-C^LrCHOPOZ-P-(CR3R4)mC02H<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>POZ-P-(CR3R4)m-CO-NH-NH2說明POZ-NH-COC6H4-NHCO-CH2-lPOZ-P-(CR3R4)rt-CCH在另一實(shí)施方案中，本公開提供了通過構(gòu)造單元兩步法利用POZ磺酸酯(源自POZ-OH的中間體)上的親核取代制得的單官能POZ衍生物POZ-N3POZ-P-(CR3R4)『CH(ORw)2POZ-P-(CR3R4)n-CHOPOZ-OCNPOZ-SCNPOZ.CNPOZ-P-(CR3R4)n-CCHPOZ~IHCR3R4kCCbH和P02;-P-(dCOZPOZ-P-Ar-CdH和POZ"P-Ar,CO-Z在另一實(shí)施方案中，本公開提供了通過構(gòu)造單元兩步法利用POZ活性碳酸鹽(源自POZ-OH的中間體)上的親核取代制得的單官能POZ衍生物POZ"OCONH-(CR3R4)n-C02HPOZ^OCONH-QlirCHO在另一實(shí)施方案中，本公開提供了通過任何上述活性酯上的親核取代制得的結(jié)合了馬來酰亞胺的單官能POZ衍生物poz-l"conh-r9—n'其中，POZ-L-CO-源自任何本文中所述的活性羧酸酯；以及L為任何上面所示的連接POZ與羧基的連接部分，包括-P-(CR3R3)m-、-P-Ar-、和吡咬鹽-NC5H4+-?？梢钥闯鲞@些馬來酰亞胺適合上面的POZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X式，其中L包含Pp-Qq段，-CONH-包含Ww段，以及R9包含Uu段。在另一實(shí)施方案中，本公開提供了通過利用親核攻擊2-烷基-24惡唑啉的聚合過程中生成的POZ陽離子的活性陽離子方法制得的POZ衍生物POZ-P'(CR3R4)n-C02HPOZ-P-AivC和POZ-P-Af-CO，ZPOZ—nPOK'，、,〃禾:口Qo所有上面的POZ衍生物與靶分子上的基團(tuán)反應(yīng)以在靶分子與PO衍生物間形成水解穩(wěn)定的連才妄。源自哌咬或哌喚的特定POZ衍生物如本文中所討論的，活性POZ陽離子可用取代的或未取代的哌啶或哌漆或其衍生物終止。取代基包括但不限于關(guān)于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、芳烷基或雜環(huán)基烷基所描述的那些基團(tuán)。這些POZ衍生物難以用上面的圖式1-4說明，因?yàn)檫B接基團(tuán)(圖式4中指定的C)是哌啶或哌。秦環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分。例如，POZ陽離子可被4-哌啶曱醇捕獲而產(chǎn)生POZ醇，被4-哌啶丁酸捕獲而產(chǎn)生POZ羧酸，或被哌溱本身捕獲而產(chǎn)生POZ胺POZ"+HNV~CHrOH——POZ——n')-CHpoz++hn)-(ch2)3-cooh--一poz十+hnnh-poz-nnh用這類哌啶和哌。秦的終止是有用的，因?yàn)閺?qiáng)氮親核試劑賦予快速并完全的終止而引入末端活性官能團(tuán)。市場上可獲得的哌啶和哌溱衍生物有至少四種，包括l-哌溱丙醇、4-哌啶丁酸、3-派咬羧酸和4-哌咬曱S事，其他的可容易地合成。應(yīng)理解，任何上述自POZ醇、酸或胺制得的POZ書f生物也可自這類口底，定或哌。秦制備，其中的含氮環(huán)提供醇、酸或胺。例如，如下化合物可自上面的用4-哌啶曱醇終止的POZ來制備42<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>這些化合物可再轉(zhuǎn)化為一系列有用的衍生物，包括縮醛、馬來酰亞胺和活性酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>POZ衍生物的使用所述單官能POZ衍生物可用來通過活性官能團(tuán)產(chǎn)生水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。此外，使用本文中所述的單官能POZ衍生物，一個(gè)靶分子被每個(gè)POZ衍生物結(jié)合。換句話說，各POZ衍生物上結(jié)合的耙分子不超過1個(gè)。單官能POZ衍生物中存在的活性官能團(tuán)的多樣性使單官能POZ衍生物可用多種反應(yīng)化學(xué)與靶分子上的多種基團(tuán)偶聯(lián)。例如，當(dāng)活性官能團(tuán)為醛時(shí)，單官能POZ衍生物在限定的pH范圍內(nèi)主要與靶蛋白分子的N-端胺反應(yīng)。當(dāng)活性官能團(tuán)為活性酯時(shí)，單官能POZ衍生物主要與胺(包括但不限于華巴分子上的賴氨酸基團(tuán))反應(yīng)。同樣，當(dāng)活性官能團(tuán)為活性碳酸鹽或三氟乙基磺酸酯時(shí)，單官能POZ衍生物與胺反應(yīng)，但反應(yīng)條件和選擇性不同于活性酯和醛。此外，當(dāng)活性官能團(tuán)為乙烯基砜、馬來酰亞胺或換乙酰胺時(shí)，單官能POZ衍生物主要與硫醇反應(yīng)，但反應(yīng)條件隨各個(gè)基團(tuán)而不同，從而提供了一系列適合于一系列靶分子的反應(yīng)條件。重要的是，用上面的合成圖式形成的各個(gè)單官能POZ衍生物均能形成水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子為多肽，如但不限于蛋白質(zhì)。例如，單官能POZ衍生物可與治療學(xué)重要的蛋白質(zhì)(如但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF))偶聯(lián)。該示例性的反應(yīng)在下面通過如下反應(yīng)示意性地說明M~POZ-OCOO-NHS+GCSF-NH2,M-PO^OCONH-GCSF在該實(shí)施方案中，GCSF上所示的胺代表若干可利用的賴氨酸基團(tuán)中的一種。同樣，GCSF含可利用的硫醇基團(tuán)，且在適當(dāng)?shù)臈l件下，含馬來酰亞胺作為活性官能團(tuán)的單官能POZ衍生物可與該硫醇基團(tuán)反應(yīng)?；钚訮OZ衍生物也可與肽偶聯(lián)。例如，含活性酯作為活性官能團(tuán)的單官能POZ4汙生物可與胰島素上可利用的氨基偶聯(lián)M-POZ-0-CH2-C02-NHS+胰島素-麗2—M-POZ-OCH2-CONH-胰島素在一個(gè)可替選的實(shí)施方案中，靶分子為小分子、藥物或診斷劑。靶分子-POZ偶聯(lián)物如上所討論的，本公開描述了多種能與靶分子形成連接而產(chǎn)生水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物的單官能POZ衍生物。在一般的實(shí)施方案中，本公開提供了具有通式(IV)的水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物A-B國TM(IV)其中，A為本文中所述的單官能POZ衍生物減去POZ衍生物上的活性官能團(tuán)與靶分子上的結(jié)合對象的反應(yīng)過程中消除的任何離去基團(tuán)；TM為耙分子；以及B為本公開的單官能POZ衍生物的活性官能團(tuán)與靶分子上的結(jié)合對象間形成的水解穩(wěn)定的連接，應(yīng)理解，水解穩(wěn)定的B連接的性質(zhì)將取決于單官能POZ衍生物上的活性官能團(tuán)及靶分子上的結(jié)合對象的性質(zhì)。示例性的活性官能團(tuán)、結(jié)合對象和B連接在下表3中給出。表3中的列舉不是詳盡無遺漏的，根據(jù)本公開可想到其他組合和所得的B連接。表3活性官能團(tuán)靶分子上的結(jié)合對象B連接三氟乙基磺酸酯SH硫醚(-S-)馬來酰亞胺SH硫醚(-S畫)活性碳酸鹽NH2氨酯(-NH-CO-O畫)活性酯NH2酰胺(-NH-CO-)醛畫2(胺)胺(-NH-)實(shí)施例試劑購自EMScience或Aldrich并在用前蒸餾。氯苯和噁唑啉從氫化鈣中餾出。凝膠滲透色譜(GPC)在具有1100四元泵和RI檢測器的AgilentTechnologies機(jī)器上進(jìn)行。在柱加熱器(60。C)中串聯(lián)地使用兩個(gè)PhenogeFMGPC柱(Phenomenex,5p,500A。，300x7.8醒)。流動(dòng)相為100%的N,N，-二曱基曱酰胺(DMF)，流速為lmL/min。校準(zhǔn)曲線用據(jù)MALDI測得具有不同分子量(750,1K,2K，5K和IOK)的M-PEOZ-OH樣品生成。凝膠過濾色譜(GFC)用使用ShodexKW-803柱的相同系統(tǒng)進(jìn)行，以pH7.0的lmMHEPES緩沖溶液作流動(dòng)相。使用UV檢測器對228nm加以監(jiān)測。MALDI-TOFMS用Bruker,MicroflexTM儀器使用蒽三酚作為基質(zhì)進(jìn)行。NMR在Varian500MHz儀器上進(jìn)行。實(shí)施例1:M-PEOZ-OH2000的典型現(xiàn)有技術(shù)制備。向2-乙基-2-噁唑啉(2.02mL,0.020mol)/乙腈(3.0mL,6.7M)溶液中加入三氟曱磺酸曱酯(0.113mL,O.OOlmol)，溶液攪拌10分鐘。然后將反應(yīng)加熱至80。C并攪拌18小時(shí)。加入碳酸鈉(1.167g)和水(lmL),并且所得混合物于9(TC加熱整夜。45冷卻至室溫后，混合物用二氯曱烷(40mL)稀釋，然后移入分液漏斗中。加入水(5mL)和鹽水(3mL)并搖動(dòng)。棄去底層，水層用二氯曱烷萃取兩次(2x20mL)。結(jié)合的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將粗油溶解在丙酮中并通過逐滴加到二乙醚(80mL)中而沉淀。所得粉末經(jīng)真空干燥(1.90g,產(chǎn)率94%)。GPC呈現(xiàn)出具有可感知的高-MW肩的單個(gè)峰(癒=3600Da,9%)(圖2A)。主峰的Mn為1980Da,PD為1.1。NMR呈現(xiàn)出預(yù)期的峰(參見實(shí)施例6)。MALDI-TOFMS呈現(xiàn)出一組最大值在2000Da、PD1.04和分離99.1Da的峰。MALDI譜也呈現(xiàn)出分離99.1Da的第二組峰，但^^比主要的那組低14Da。該組峰的最大值發(fā)生在1600Da。實(shí)施例2:M-PEOZ-OH2000的第二種現(xiàn)有l(wèi)支術(shù)制備。將氯苯(6.9mL)、乙腈(2.3mL)和三氟曱磺酸曱酯(0.164mL,1.5mmole)在氮?dú)夂铜h(huán)境溫度下混合。然后在攪拌下緩慢加入2-乙基-2-噁唑啉(3.05mL，3.0g，30mmole)?；旌衔锉患訜嶂?0。C并攪拌8小時(shí)。然后通過浸沒在水浴中將反應(yīng)混合物冷卻至室溫。加入氫氧化鉀(2mmol)/甲醇(lmL)，混合物攪拌1小時(shí)。然后用二氯曱烷(40mL)萃取混合物。分離出二氯曱烷層并用水(總共40mL)洗滌三次。有機(jī)層被干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5mL。產(chǎn)物通過加到二乙醚(100mL)中沉淀并在真空下干燥(產(chǎn)量0.7g)。GPC呈現(xiàn)出具有可感知的高-MW肩的單個(gè)峰(Mr^3300Da,6%)(圖2B)。主峰的Mn為2200Da,PD為1.07。NMR呈現(xiàn)出預(yù)期的峰(參見實(shí)施例6)。MALDI-TOFMS呈現(xiàn)出一組最大值在2300Da和分離99.1Da的峰。MALDH普也呈現(xiàn)出分離99.1Da的第二組峰，但各峰比主要的那組低14Da。該組峰的最大值發(fā)生在2100Da。實(shí)施例3:乙基二異丙基胺對M-PEOZ+終止的影響。在室溫下向2-乙基-2-噁唑啉(1.01mL，10.0mmol)/氯苯(5mL，2M)溶液中加入三氟曱磺酸曱酯(0.0566mL,0.5mmo1)，溶液攪拌10分鐘。然后將溶液加熱至110。C并攪拌30分鐘。將溶液冷卻至0°C，加入二異丙基乙基胺(0.261mL.1.5mmo1),所得混合物于50。C攪拌18小時(shí)。將混合物冷卻至室溫并逐滴加到二乙醚(50mL)中，以得到白色沉淀。固體物于真空下以幾乎為定量產(chǎn)率進(jìn)行干燥。GPC呈現(xiàn)出兩個(gè)峰，一個(gè)在約2000Da處(24%),—個(gè)在約3800Da處(76%)。MALDI鐠確認(rèn)了高-和低-MW產(chǎn)物的存在。實(shí)施例4:2,6-二甲基吡定對M-PEOZ+終止的影響。在室溫下向2-乙基-2-噁唑啉(0.758mL,7.5mmol)/氯苯(3.75mL)溶液中加入三氟曱磺酸曱酯(0.0424mL,0.375mmo1)，溶液攪拌10分鐘。然后將溶液加熱至110。C并攪拌30分鐘。將溶液冷卻至0°C，加入2，6-二曱基吡啶(0.170mL.1.5mmo1),所得混合物于50。C攪拌18小時(shí)。將混合物冷卻至室溫并逐滴加到二乙醚(20mL)中，得到白色沉淀。固體物于真空下以幾乎為定量產(chǎn)率進(jìn)行干燥。GPC呈現(xiàn)出兩個(gè)峰，一個(gè)在約2000Da處(89%)，一個(gè)在約4000Da處(11%)，這與某些二聚相一致。NMR譜在4.2和5.0ppm處呈現(xiàn)出峰，這與未終止的噁唑啉鹽陽離子的存在相一致。實(shí)施例5:嘗試用乙醇酸曱酯終止噁唑啉聚合。在室溫下向2-乙基-2-噁唑啉(4.04mL,0.040mol)/氯苯(5mL,2M)溶液中加入三氟甲磺酸曱酯(0.453mL,0.004mo1),溶液攪拌10分鐘。然后將溶液加熱至110。C并攪拌30分鐘。將溶液冷卻至(TC,加入2,6-二曱基吡啶(0.929mL.0.008mol)和乙醇酸曱酯(0.609mL，0.008mol),所得混合物于室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物冷卻至室溫并逐滴加到二,乙醚(1500mL)中，得到白色沉淀。固體物于真空下以幾乎為定量產(chǎn)率進(jìn)^f亍干燥。NMR在4.46和4.99ppm處呈現(xiàn)出峰，這與噁唑啉鹽離子相一致，并與乙醇酸酯未能終止聚合相一致。實(shí)施例6:最適條件下M-PEOZ-OH2000的制備。將氯苯(30mL)和MeOTf(344fiL，3.0mmol)在氮?dú)庀掠谑覝鼗旌喜⒓拥?_Et-2-Ox(6.06mL,GOmmol)/氯苯pOmL)中?；旌衔飻嚢?5分鐘，同時(shí)加熱到ll(TC。接著將混合物冷卻至0。C,然后加入碳酸鈉(2.12g)/水(40mL)溶液并攪拌整夜。將混合物倒進(jìn)分液漏斗中并加入40mL水。除去底層，水層用二氯曱烷萃取(3x60mL)。結(jié)合的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將稠油狀殘余物溶解在7mL二氯甲烷中并于0'C逐滴加到二乙醚(80mL)中。重復(fù)此沉淀作用，得到4.2g白色粉末(產(chǎn)率84%)。NMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDCl3)在1.12ppm(s,3H,C5CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH3Ci72CO-)、及3.47ppm(s，4H，-NCH2C&N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以l外pm(小)和3.05ppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(Cflj-NCH2CH2)。末端亞曱基(-CflVOH)出現(xiàn)在3.8ppm(s)處。GPC呈現(xiàn)出單個(gè)峰,無高M(jìn)W肩并無可感知的譜尾；Mn=WOODa,多分散性(PD)4.03(圖3A)。MALDI譜的Mn=1900Da，且有99.1Da質(zhì)量單位的分離。計(jì)算的PD.為1.03。對硝基苯基碳酸酯衍生作用。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為對硝基苯基碳酸酯，其然后經(jīng)純化并在0.2NNaOH溶液(pH8)的存在下水解。對硝基苯酚的測定(400nm處的UV吸收，s=l8,000M"cm")表明-OH取代度為99%。實(shí)施例7:最適條件下M-PEOZ-OH5000的制備。將氯苯(80mL)和MeOTf(354^L,3.2mmole)于室溫在氮?dú)庀掠?50mL單頸圓底燒瓶中混合。攪拌的同時(shí)向燒并瓦中緩慢加入2-Et-2-Ox(16.4mL,16.0g，160mmo1)。.加入噁唑啉后混合物即變混濁?；旌衔镉?2。C加熱并攪拌一'J、時(shí)。隨著加熱混合物，混合物變澄清。然后將混合物加熱至80。C并攪拌3.75小時(shí)。接著通過浸沒在冰浴中15分鐘而將混合物冷卻至室溫。聚合通過加入40mL水和2g碳酸鈉并然后攪拌30分鐘凈皮終止。分離出水層，有機(jī)層被再次用40mL水和lg碳酸鈉并然后攪拌30分鐘來萃取。分離出水層并與第一水層合并，合并得到的水溶液于室溫下攪拌整夜?；旆ǖ乃畬?80mL)48然后用0.5MHC1(40mL)酸化直至pH低于6(pH試紙)，并獲得澄清溶液。然后聚合物用二氯甲烷萃取4次(每次200mL)，合并的有機(jī)層在攪拌的同時(shí)用無水硫酸鎂干燥一小時(shí)。在真空下蒸發(fā)二氯曱烷溶液，將所得殘余物溶解在25mL干燥的二氯曱烷中并通過逐滴加到250mL乙醚(室溫)中而沉淀。然后將所得白色固體物在真空爐中于50。C干燥整夜。干燥得到白色粉末(14.1g,產(chǎn)率88%)。NMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDCl3)在1.12ppm(s,3H,Ci^CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H,CH3Cff2CO-)、及3.47ppm(s,4H,-NC^C^N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以l外pm(小)和!3.0Sppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(C^j-NCH2CH2)。末端亞曱基(-C7^-OH)出現(xiàn)在3.8ppm(s)處。GPC呈現(xiàn)出單個(gè)峰，保留時(shí)間為13.5分鐘。Mn-4100Da，多分散性(PD)-1.06。Mn(理論)=4980Da。12.4分鐘處的小肩表明有約1%的高M(jìn)W雜質(zhì)；Mn=8900Da(圖3B)。MALDI譜的Mn=4910Da，且有99.1Da質(zhì)量單位的分離。PD為1.02。對硝基苯基碳酸酯衍生作用。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為對硝基苯基碳酸酯，其然后經(jīng)純化并在0.2NNaOH溶液(pH8)的存在下水解。對硝基苯酚的測定(400nm處的UV吸收，s-lS,000M"cm")表明-OH取代度為"％。實(shí)施例8:POZ對硝基苯基碳酸酯的合成用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮M-PEOZ-OH(10.0g,1.0mmol)/乙腈(80mL)溶液。將殘余物溶解在二氯曱烷(40mL)中并在0°C下加入對硝基苯基氯甲酸酯(1.61g,7.96mmo1)。逐滴加入吡啶(0.80mL,9.95mmo1)，混合物于室溫下攪拌三小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮混合物，然后加到二乙醚中，得到白色沉淀。輕輕倒出溶劑，真空下干燥沉淀。將產(chǎn)物溶解在略酸性的水中，攪拌20分鐘并過濾。產(chǎn)物在二氯嘧咬MeCNorCH2CI2說明書第39/60頁曱烷中萃取并用硫酸鎂干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液并加到二乙醚中沉淀。輕輕倒出溶劑，產(chǎn)物在真空下干燥。產(chǎn)量8.7g。NMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDCl3)在U2ppm(s,3H，CHjCH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(總面積2H,CH3Cff"2CO-)、3.47ppm(s,4H，-NCff^Cff^N-h7.38ppm(d,2H,J-5.2Hz)和8.29ppm(d，2H，J-5.2Hz)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(C73-NCH2CH2)。末端亞甲基(-C好rO-CO-)出現(xiàn)在4.42ppm(s)處。對硝基苯基碳酸酯取代。使產(chǎn)物在0.2NNaOH溶液的存在下水解。游離對硝基苯酚的測定(400nm處的UV吸收，s=17,000M"cm")表明-OH取代度為100%。實(shí)施例9:M-PEOZ胺的合成5f丫關(guān)v^/^剛丫911CH2CI2、NO^^5^0*C~+r.t,o'H將M-PEOZ-PNPC(3.60g，0.694mmol)/二氯曱烷(20mL)溶液冷卻至0°C并加入乙二胺(233mL，34.7mmol)。溶液在冷態(tài)攪拌一小時(shí)，然后于室溫?cái)嚢?8小時(shí)?；旌衔镉眯D(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，通過加入正丁醇(20mL)稀釋，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醇(以共沸除去二胺)。將殘余物溶解在二氯曱烷中并加到二乙醚中。輕輕倒出溶劑并將白色粉末溶解在二氯甲烷(100mL)中。溶液用1NNaOH溶液洗滌。水相用二氯甲烷洗滌兩次(2x70mL)，合并有機(jī)層，并用石危酸《美干燥。溶液;故過濾、濃縮并加到乙醚中。輕輕倒出溶劑，白色粉末在真空下干燥。NMR(Varian,500MHz，10mg/mLCDCl3)在U2ppm(s，3H，Ci^CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H,013<:恥0-)和3.47ppm(s，4H,-NCff2C^N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm(小)和3.05ppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(Ci^-NCH2CH2)。末端亞曱基(-Cfl^OCO-NH-)出現(xiàn)在4.2ppm(brs,2H)處，與乙二胺有關(guān)的質(zhì)子出現(xiàn)在2.82ppm(m,2H,-腿-(^12-<^^-雨2)和503.23ppm(m，2H,-NH-OT2-CH2-。實(shí)施例10:POZ琥珀酰亞胺基碳酸酯的合成在5mL干燥的二氯曱烷或干燥的乙腈中制備M-PEOZ-OH(0.5g,0.23mmo1)的溶液并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。制備二琥珀酰亞胺基碳酸酯(0.24g,0.9mmol)在5mL干燥的二氯甲烷或干燥的乙腈中的懸浮液。向該懸浮液中加入吡啶(0.094mL，1.16mmo1)。向上面的懸浮液中逐滴加入M-PEOZ-OH溶液，混合物于室溫下攪拌整夜?；旌衔锉贿^濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加到二乙醚中。輕輕倒出溶劑，'白色粉末在真空下干燥。將粉末溶解在干燥的丙酮中并通過加到二乙醚中沉淀。產(chǎn)量0.6g。NMR(Varian,500MHz，1Omg/mLCDC10在1.12ppm(s，3H:C^3CH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(總面積2H,CH3CH2CO-)、3.47ppm(s,4H,-NCZ^Ci^N-),2.70ppm(s，4H，SC基團(tuán))處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm(小)和1(Bppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(Cffj-NCH2CH2)。末端亞甲基(-C02-O-CO-)出現(xiàn)在4.24ppm(s)處。實(shí)施例11:M-PEOZ-T-COOH2000的合成a.曱酯的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>按如上所述在氯苯中制備lmmolM-PEOZ+的溶液。將溶液冷卻至室溫。在(TC下向NaH(0.12g,5mmol)/THF懸浮液中逐滴加入3-巰基丙酸曱酯(0.65mL,6mmo1)。然后將M-PEOZ+溶液緩慢加到THF溶液中。使所得混合物升溫至室溫并攪拌整夜。反應(yīng)混合物被過濾并加到醚中，得到白色沉淀。輕輕倒出溶劑，固體物在真空下干燥得到i.5g白色粉末。NMR(Varian,500MHz，10mg/mLCDCl3)在1.12ppm(s,3H，C5CH2CO-)、2.31ppm(小m)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH3C^CO-)、3.47ppm(s，4H，-^^^<7^61^)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm(小)和:3.(Bppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(C03-NCH2CH2)。末端亞曱基(-Cfl"rCOO-CH3)出現(xiàn)在2.Mppm(s)處，其鄰近的亞曱基(S-Cfl^CH2-CO-)出現(xiàn)在2.81ppm(s)處，與硫基團(tuán)相鄰的亞甲基(-Cfl"rS-CH2-)出現(xiàn)在2.71ppm(s)處。曱酯基團(tuán)(-CH2-COO-C0j)在3.71ppm處以尖銳的單峰出現(xiàn)。硫代酸的合成制備上面的酯(8.lg,0.004mol)在20mL曱醇中的溶液并與30mL0.05NNaOH溶液(0.02mol)混合?；旌衔镉谑覝叵聰嚢?0分鐘，然后用5。/。的HCl酸化。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去曱醇，溶液用二氯曱烷萃取。萃取物用石克酸鎂干燥，過濾，濃縮并加到醚中沉淀。輕輕倒出醚，殘余物在真空下干燥。NMRi普表明3.71ppm處的曱酯峰消失。GPC表明有6。/。的高M(jìn)W肩。主峰的Mn為1870Da，PD為1.15。上面的樣品通過離子交換色語用DEAE瓊脂糖凝月交FF介質(zhì)純化。產(chǎn)物的GPC給出沒有高-MW肩的單個(gè)主峰，Mn為1970Da，PD為1.08。MALDI給出的Mn為2090Da，PD為1.04。實(shí)施例12:M-PEOZ-T-丙酸(M-PEOZ-T-PA)1000的合成,EOZ+-，nvsvOMeKO泡un.N,^'，v、s,v、OH如上所述，用2-乙基-2-噁唑啉(5.05mL,50mmol)和三氟曱磺酸曱酯(0.63mL,5.56mmol)在氯苯(25mL)中制備M-PEOZ+。為獲得終止試劑，在0。C下向叔丁醇鉀(1.25g,11.1mmol)/氯苯(10mL)懸浮液中逐滴加入3-巰基丙酸曱酯(2.41mL,22.2mmo1)?；旌衔镌诶鋺B(tài)攪拌2小時(shí)后，逐滴加入M-PEOZ+Z氯苯溶液?；旌衔镌诶鋺B(tài)攪拌4小時(shí)，然后于室溫?cái)嚢?8小時(shí)。加入水(50mL)并通過加入5%的HC1水溶液使混合物酸化(pH3)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去揮發(fā)物(包括氯苯)。所得水溶液用NaOH(1.33g,33.3mmol)/H20(70mL)溶液處理。攪拌1小時(shí)后，用5%的HC1水溶液使混合物酸化，然后用二氯曱烷萃取。合并的有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，.濃縮并通過加到醚中沉淀。輕輕倒出醚，殘余物在真空下千燥。通過離子交換色譜用DEAE瓊脂糖凝膠FF介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的純化。GPC和GFC呈現(xiàn)出單個(gè)峰，Mn為910Da，PD為1.02。MALDI給出的Mn為1100Da,PD為1.05。實(shí)施例13:M-PEOZ-T-丙酸NHS西旨qy[-PEOZ-T-SPA)的合成于0°C下向來自上面的制備的M-PEOZ-T-C02H(Mn910Da,2.0g，2.20mmol)/二氯甲烷(44mL)的溶液中加入iV-幾基琥珀酰亞胺(0.467g，2.26mmo1)和DCC(0.467g,2.26mmo1)。在冷態(tài)攪拌2小時(shí)后，使混合物升溫至室溫并攪拌整夜。用針頭過濾器過濾混合物并將濾液加到二乙醚中得到白色粉末。產(chǎn)物通過真空過濾收集并在真空下干燥(2.0g,產(chǎn)率89%)。琥珀酰亞胺基的連接得到NMR譜的證實(shí)，該傳示出除普通的主鏈峰外還在2.86ppm(s，2H)處有琥珀酰亞胺基質(zhì)子。'為確定產(chǎn)率，將化合物(Mn計(jì)算值1025Da，0.4g,0.39mmol)在二氯曱烷(4mL)中用苯乙胺(0.15mL,U7mmol)和三乙胺(0.16mL，1.17mmol)處理。攪拌整夜后，混合物被過濾并加到二乙醚中。白色粉末被過濾并用真空干燥。根據(jù)凝膠滲透色鐠，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為99%。實(shí)施例14:經(jīng)由硫醇鹽合成M-PEOZ-硫代-NH7麵Tf*I即、HSKO形u,PhCI53tBoc酯的合成向2-乙基-2-噁唑啉(5.05mL，0.05mol)/氯苯(25mL)溶液中加入三氟曱磺酸甲酯(0.283mL，0.0025mol)。室溫?cái)嚢?0分鐘后將混合物加熱至ll(TC并保持30分鐘，然后冷卻至0°C。為獲得終止試劑，在0。C下向叔丁醇鉀(0.561g,0.005moiy氯苯(SmL)懸浮液中逐滴加入Boc-半胱胺(0.84mL，0.00"mo1)?；旌衔镌诶鋺B(tài)攪拌l小時(shí)以得到澄清溶液后，在0"下用注射器逐滴加入]^1-￡02+/氯苯溶液?；旌衔镌诶鋺B(tài)攪拌4小時(shí)，然后于室溫?cái)嚢?8小時(shí)。將混合物緩慢加到二乙醚中，得到白色沉淀。輕輕倒出醚，將殘余物溶解在水中，然后用二氯曱烷萃取。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過加到醚中沉淀。過濾混合物，殘余的由色粉末在真空下干燥得到4.0g目標(biāo)化合物，產(chǎn)率為87%。NMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDCl3)在U2ppm(s,3H,CffjCH2C0-)、2.31ppm(s)和2.41ppm(s)(總面積2H,CH3C02CO-)、及3.47ppm(s,4H,-NC7^C^N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm和3.03ppm處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(C05-NCH2CH2)。Boc半胱胺端基峰出現(xiàn)在1.44ppm(s，9H,-CH2NHBoc)、2.67ppm(m，2H，-SCff^CEySIHBoc)、2.71ppm(m，2H，-Ci^SCH2CH2NHBoc)和3.32ppm(m,2H，-8012(:好2^11^60(0處。根據(jù)NMR積分，粗混合物含約8°/。的M-PEOZ-OH物類。GPC產(chǎn)生Mn=1790Da、PD=1.07的尖銳峰。胺的合成在0。C及劇烈攪拌下將鹽酸(二氧六環(huán)中的4M溶液，34.0mL)加到含M-PEOZ-T-麗(Boc)(Mn1850Da,3.218g,1.74讓ol)的燒瓶中。使混合物升溫至室溫并攪拌l小時(shí)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮混合物并用水(50mL)稀釋，調(diào)節(jié)pH至13。所得水溶液用二氯曱烷萃取三次。合并的有機(jī)相用Na2S04干燥，過濾，'濃縮，在醚中沉淀以得到白色粉末，過濾該白色粉末并在真空下干燥，得到2.5g產(chǎn)物。通過離子交換色譜用CM瓊脂糖凝膠FF介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。通過柱純化收集兩個(gè)餾分。一個(gè)0.2g的餾分含純聚合物，第二個(gè)2.2§的餾分含胺聚合物和8。/。的從前一步驟帶來的雜質(zhì)(M-PEOZ-OH)。!HNMR(Varian,500MHz,10mg/mLCDC13)在1.14ppm(m,3H,Cfl^CH2CO-)、2.32ppm(m)和2.41(s)(總面積2H,CH3Ci^CO-)、及3.47ppm(m,4H,-!^(:/60721^)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm和3.03ppm處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(Cflj-NCH2CH2)。末端半胱氨基峰見于2.69ppm(m，4H,-SC^CH2NH2,畫C^SCH2CH2NH2)和2.91ppm(m,2H,畫SCH2C^NH2)處。Boc基團(tuán)的移除通過1.44ppm(s,9H，-CH2NH^oc)處峰的消失得到證實(shí)。GPC示出Mn值為1700Da,PDI為1.10。實(shí)施例15:M-PEOZ-T-SCM(M-PEOZ-S-CH2-C02-NHS)的合成酸的合成在氬氣下混合氯苯(100mL)與乙基-2-噁唑啉(39.7g,0.4mol,50eq.)并于0°C攪拌30分鐘。攪拌下向燒瓶中加入三氟曱磺酸曱酯(1.31g,leq.),繼續(xù)在0。C攪拌30分鐘、在25X:攪拌30分鐘、在42。C攪拌1小時(shí)、然后在80。C攪拌3.5小時(shí)。使混合物冷卻至室溫。在單獨(dú)的燒瓶中通過混合氺義丁醇鉀(2.25g,5eq.)和2-巰基乙酸曱酯(2.9g，6eq.)及氯苯(100mL)并于0。C攪拌1小時(shí)制備終止混合物。將聚合混合物加到終止混合物中并于室溫?cái)嚢枵?。混合物用二氯甲?50mL)稀釋，過濾并加到二乙醚(750mL)中。輕輕倒出上清液，收集沉淀，在真空下干燥1小時(shí)。將粉末溶解在100mL0.1MNaOH中并攪拌4小時(shí)。通過加入25mL0.5MHC1使混合物酸化。水溶液用二氯曱烷萃取(150mLx3次)，用MgS04干燥，濃縮至50mL，并在二乙醚(400mL)中沉淀。所得白色粉末在真空下干燥。所得酸通過DEAE離子交換色鐠純化得到純酸(如GFC色鐠所示)。NMR表明1.30和4.19ppm處酯的曱基和亞曱基峰已分別消失。NHS酯的合成于0。C下向含溶解在二氯曱烷(60mL)中的M-PEOZ-T-CM(M-PEOZ-S-CH2-C02H,Mn4970Da,6.0g,1.21mmol)的溶液中加入W-羥基琥珀酰亞胺(0.139g,1.21mmol)和DCC(0.249g,1.21mmo1)。在此溫度攪拌2小時(shí)后，使該澄清的無色混合物升溫至室溫并攪拌整夜。含白色沉淀的混合物用針頭過55濾器過濾。攪拌下將濾液加到二乙醚中，得到白色粉狀沉淀。殘余物用燒結(jié)玻璃漏斗收集并在真空下干燥，得到5.2g所需產(chǎn)物(產(chǎn)率85%)。H^NMR:羥基琥珀酰亞胺的連接得到&NMR譜的證實(shí)，該譜表明除PEOZ的普通的主鏈峰外還在2.87ppm(s，4H)處有琥珀酰亞胺基質(zhì)子。為確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，將該化合物(Mn計(jì)算值5070Da，0.100g,0.0197mmol)在二氯曱烷(2mL)中用苯乙胺(0.012mL，0.0987mmol)和三乙胺(0.014mL,0.0987mmo1)處理。攪拌整夜后，混合物被過濾并加到二乙醚中。過濾白色粉末并用真空干燥，得到定量產(chǎn)率的所需酰胺。根據(jù)GFC，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為95+%。實(shí)施例16:硫代NHS酯的水解速率硫代NHS酯M-PEOZ-T-SCM5K和M-PEOZ-T-SPA5K的反應(yīng)性在pH8的硼酸鹽緩沖溶液中評價(jià)。精確稱量的兩種酯的樣品，置于100mL容量瓶中，并溶解在pH8的硼酸鹽緩沖溶液(0.2M)中。先每1分鐘、后每IO分鐘從各燒瓶中取等分試樣并通過UV-分光光度計(jì)于260nm的最大吸收波長(Xmax)下分析。以吸光度值增加的速率對時(shí)間作圖。從這些計(jì)算確定最大吸光度值的50%時(shí)的速率。M-PEOZ-T-SCM5K和M-PEOZ-T-SPA5K的—/2計(jì)算值分別為<1分鐘和15分鐘。實(shí)施例17:M-PEOZ-OC02-NHS與GCSF的偶聯(lián)按如下所述使單官能衍生物M-PEOZ-OC02-NHS與把分子(本實(shí)施例中為GCSF)偶聯(lián)。溶解在lml0.2M的硼酸鈉緩沖溶液(pH8.5)中的4mgGCSF(0.215拜o1,MW=18.6kDa)與每GCSF氨基(總共5個(gè)賴氨酸加a-胺)3當(dāng)量的M-PEOZ-OC02-NHS在室溫下反應(yīng)60分鐘。在這些反應(yīng)條件下，單官能POZ衍生物與GCSF上的氨基間的反應(yīng)主要發(fā)生在更棵露的親核胺上。GCSF的修飾通過RP-HPLC采用CI8Agilent分析柱分析，該柱平衡于60%的緩沖溶液A(HPLC級水，含0.05%的TFA)中并用1%的緩沖溶液B/min(70%CH3CN和0.05%TFA)的線性梯度以lml/min的流速洗脫30分鐘。洗脫的物質(zhì)通過280nm下的吸光度檢測。GCSF-POZ偶聯(lián)物呈非對稱峰被洗脫，保留時(shí)間為18.8分鐘，其表明了GCSF-POZ偶聯(lián)物在與GCSF分子偶聯(lián)的POZ分子數(shù)方面的不均一性。氨基含量的Habeeb分析表明70%的蛋白質(zhì)氨基不再是游離的。若干偶聯(lián)物的形成通過SDS-PAGE及通過尺寸排除HPLC確認(rèn)。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)用PharmaciaPhastSystem進(jìn)行。微型凝膠(12。/。的聚丙烯酰胺)上施加恒定電壓(200V)，并按Laemmli的方法制備。對于蛋白質(zhì)染色，將凝膠置于Coomassie藍(lán)色溶液中，而對于聚合物染色，使用碘化鋇溶液。聚合物染色基于碘化鋇絡(luò)合物的形成(KurfUst，M.M.，1992，Jm/少"ca/B/oc/zem^^y,2W,244-248)。SDS-PAGE數(shù)據(jù)顯示出若干條帶，表明獲得了化學(xué)上不同的分子GCSF偶聯(lián)物的混合物，這樣的偶聯(lián)物包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)POZ分子。尺寸排除HPLC分析用BiosepSECS2000分析柱進(jìn)行，該柱用O.IM磷酸鈉、0.2M氯化鈉(pH7.2)和20%乙腈的等強(qiáng)度流動(dòng)相以0.5ml/min的流速洗脫。洗脫的物質(zhì)通過280nm下的吸光度檢測。色i普在5.75min處呈現(xiàn)出洗脫峰，其對應(yīng)著比天然蛋白質(zhì)(洗脫峰在9.00min處)高的分子量，表明形成了GCSF-POZ偶聯(lián)物。實(shí)施例18:M-PEOZ-OC02-NHS與核糖核酸酶A的偶聯(lián)按如下所述使單官能POZ衍生物M-PEOZ-OC02-NHS與把分子(本實(shí)施例中為核糖核酸酶A(RNAseA))偶聯(lián)。溶解在1ml0.2M的硼酸鈉緩沖溶液(pH8.5)中的5mgRNAseA(0.36^imol，MW13kDa)與每RNAseA氨基(總共5個(gè)賴氨酸加a-胺)3當(dāng)量的M-PEOZ-OC02-NHS反應(yīng)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。RNAseA修飾的程度通過RP-HPLC采用C4Agilent分析柱分析，該柱平tf于80%的緩沖溶液A(HPLC級水，含0.05%的TFA)中并用1。/。的緩沖溶液B/min(90%CH3CN和0.05%TFA)的線性梯度以lml/min的流速洗脫30分4中。洗脫的物質(zhì)通過280nm下的吸光度檢測。色譜表明有少量(<10%)未被修飾的蛋白質(zhì)。POZ-修飾蛋白質(zhì)的峰很寬，表明了RNAseA-POZ偶聯(lián)物在與RNAseA分子偶聯(lián)的POZ分子數(shù)方面的不均一性。氨基含量的Habeeb分析表明RNAseA上26%的氨基被修飾。57若干偶聯(lián):物的形成通過SDS-PAGE及通過尺寸排除HPLC確認(rèn)。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)用PharmaciaPhastSystem進(jìn)行并按上面的實(shí)施例中所述染色。同GCSF結(jié)果一樣，SDS-PAGE數(shù)據(jù)顯示出若干條帶，表明有若干不同的RNAseA-POZ偶聯(lián)物。尺寸排除HPLC分析用BiosepSECS2000分析柱按上面的實(shí)施例中所述進(jìn)行。色譜較早出現(xiàn)寬峰，其對應(yīng)著比天然蛋白質(zhì)高的分子量，這與RNAseA-POZ偶聯(lián)物的形成相一致。實(shí)施例19:M-PEOZ-馬來酰亞胺和鄰二硫吡咬的制備本實(shí)施例中自M-PEOZ-NH2(見上)制備單官能POZ衍生物M-PEOZ-馬來酰亞胺。向lOOmg(0.55mmol,3叫)4-馬來酰亞胺丁酸中加入無水氯仿中的126mgHOBT(1.09醒ol)和226mgDCC(1.09mmol)。3小時(shí)后加入16mg(0.00254mmol)M-PEOZ-NH2。所得溶液在室溫下保持整夜。反應(yīng)混合物用0.1NHC1洗滌，干燥，并真空蒸發(fā)。加入乙醚，通過過濾收集沉淀并干燥。反應(yīng)產(chǎn)率為65%。以同樣的方式通過在氯仿中于室溫下及三乙胺(3叫.)存在下偶耳關(guān)琥珀酰亞胺丙酸二硫吡啶(SPDP)(3倍過量)與M-PEOZ-NH25小時(shí)制備鄰二硫吡啶(OPSS)試劑。最終產(chǎn)物在醚中沉淀獲得，產(chǎn)率為65%。實(shí)施例20:M-PEOZ-馬來酰亞胺、M-PEOZ-OPSS、PEG-馬來酰亞胺和PEG-OPSS與碌。醇的反應(yīng)的比專交為評價(jià)M-PEOZ-馬來酰亞胺和M-PEOZ-OPSS的反應(yīng)性以及比較M-PEOZ-馬來酰亞胺和M-PEOZ-OPSS衍生物與它們的相應(yīng)的PEG衍生物的反應(yīng)性，將PEOZ和PEG聚合物偶聯(lián)到含半胱氨酸的三肽谷胱甘肽上。與谷胱甘肽的反應(yīng)用本領(lǐng)域中熟知的Ellman，s分析監(jiān)測。在0.1MpH=7的磷酸鹽緩沖溶液(含5mMEDTA)中制備20mMPEOZ或PEG衍生物和2mM硫醇的溶液。取等分試樣(30(J)并通過加入到920pdpH7的緩沖溶液猝滅。加入50微升DTNB,5分鐘后測定420nm下的吸光度來評價(jià)剩余的硫醇。半胱氨酸修飾的程度在表4中給出。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例21:M-PEOZ-對硝基苯基碳酸酯和PEG-對硝基苯基碳酸酯的水解和氨解研究M-PEOZ-對硝基苯基碳酸酯和相應(yīng)的PEG-對硝基苯基碳酸酯的水解速率通過釋放在0.1MpH8的硼酸鹽緩沖溶液中的對硝基苯酚在室溫和412nrn下的UV吸光度或聚合物對胺的反應(yīng)性評價(jià)。本實(shí)施例中向活化的PEOZ或PEG溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比率l:l)的溶液。表5以半衰期記載了水解和氨解速率。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例22:M-PEOZ-0-CH2-C02H的制備在60ml曱苯中共沸蒸餾M-PEOZ-OH(1.5g，0.00024mol,l叫)；除去30ml蒸餾物。使反應(yīng)混合物緩慢冷卻至室溫，然后加入0.5ml(0.5mmol)l.OM的叔丁醇鉀/叔丁#溶液。所得混合物在室溫下攪拌l小時(shí)，然后加入94mg(0.48rnmo1)溴代乙酸^又丁酯。將所得混濁混合物加熱至回流，冷卻并于室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)混合物通過Celite過濾并在真空下除去溶劑。殘余物在乙醚中沉淀。產(chǎn)物于4。C離心，洗滌三次并除去溶劑。NMR中叔丁基峰(1.47ppm)與末端甲基峰的比較表明為定量轉(zhuǎn)^:。將所得羧酸叔丁酯溶解在CH2C1乂三氟乙酸/水(50m1/0.lml/1OOml)的混合物中，溶液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后在真空下除去溶劑以完全除去TFA，然后在乙醚中離心，得到900mg產(chǎn)物(60%)。NMR表明叔丁基峰已消除而在4.08ppm處觀察到新的亞甲基峰。通過陰離子交換色譜從過量的M-PEOZ-OH中純化羧酸。將卯Omg產(chǎn)物裝入預(yù)平衡的柱(QAE50)中，流速為lml/min。用水進(jìn)行等強(qiáng)度洗脫直至M-PEOZ-OH被完全洗脫。將溶劑換為0.01N的NaCl并收集產(chǎn)物。餾分通過12分析鑒定。在真空下濃縮餾分至30ml并用CH2Cl2洗滌六次(40mlx6)。產(chǎn)量為600mg。實(shí)施例23:M-PEOZ-0-CH，-C02-NHS的制備將M-PEOZ-COOH(600mg，O.llmmol)溶解在15mL二氯曱烷中，并加入N-羥基琥珀酰亞胺(104mg，0.9mmol)和DCC(185mg,0.9mmo1)。讓反應(yīng)混合物反應(yīng)24小時(shí)，然后通過加入乙醚沉淀產(chǎn)物，通過過濾收集產(chǎn)物并干燥。根據(jù)用于測定殘余NH2基團(tuán)的TNBS測得的作為底物的甘氨酸-甘氨酸的氨基修飾率確定活化度為85%。實(shí)施例24:M-PEOZ-0-CH2-C02-NHS和PEG-0-CH2-C02-NHS的水解和氨解研咒M-PEOZ-0-CHrC(VNHS和PEG-0-CH2-C07-NHS的水解速率通過測定釋放在O.IMpH8的硼酸鹽緩沖溶液中的N-羥基琥珀酰亞胺在室溫和260nm下的UV吸光度來評價(jià)。為評價(jià)聚合物對胺的反應(yīng)性，向M-PEOZ-0-CHrC(VNHS和PEG-O-￡H2-C02-NHS(按本領(lǐng)域中熟知的那樣制備)溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比率l:l)的溶液，以用于比較。表6以半衰期記載了水解和氨解。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例25:M-PEOZ-0-CH2-C02-NHS與GCSF的偶聯(lián)溶解在1ml0.2M的硼酸鈉緩沖溶液(pH8.5)中的2.5mgGCSF(0.134,01,MW48.6kDa)與每GCSF氨基(總共5個(gè)賴氨酸加a-胺)3當(dāng)量的M-PEOZ-0-CHrC02-NHS在室溫下反應(yīng)60分鐘。在這些條件下，修飾主要發(fā)生在更棵露的親核胺上。GCSF的修飾通過RP-HPLC采用C18Agilent分析柱分析。洗脫劑A為含0.05%TFA的H20，洗脫劑B為含0.05%TFA的乙腈。流速為lml/min,檢測在280nm下進(jìn)行。所用梯度為0分鐘時(shí)B為30%;30分鐘內(nèi)B從30%變到80%,3分鐘內(nèi)B從80%變到30%。色譜表明無游離蛋白質(zhì)存在，且在比游離GCSF晚的保留時(shí)間下出現(xiàn)寬峰，表明存在GCSF-POZ的多種形式。若干偶聯(lián)物的形成通過尺寸排除HPLC確認(rèn)。尺寸排除HPLC分析用AgilentGF-250柱進(jìn)行，該柱用O.IM磷酸鈉、0.2M氯化鈉(pH7.2)和20。/。乙腈的等強(qiáng)度流動(dòng)相以0.3ml/min的流速洗脫。色譜呈現(xiàn)出寬洗脫峰，這對應(yīng)著比天然GCSF具有更高分子量的GCSF-POZ偶聯(lián)物，并與廣泛的偶聯(lián)和質(zhì)量的增加相一致。實(shí)施例26:經(jīng)M-POZ-0-CH2-C02-NHS和PEG-0-CH2-COrNHS修飾的酶的性質(zhì)的比較為評價(jià)因與本公開的POZ衍生物和本領(lǐng)域中熟知的相應(yīng)PEG聚合物的聚合對酶性質(zhì)的影響，將三種不同的酶——核糖核酸酶A、尿酸酶和過氧化氫酶用M-PEOZ-0-CH2-C02-:NHS(6kDa)和PEG-0-CH2-C02-NHS(5.5kDa)修飾。為便于比較，各酶在就聚合物-酶比率、緩沖溶液、pH和反應(yīng)溫度方面而言相似的條件下被修飾。.用上述POZ和PEG聚合物修飾酶的條件為0.2M、pH8.5、硼酸鹽緩沖溶液。修飾所用POZ和PEG聚合物的量根據(jù)各酶中總共可利用的氨基的計(jì)算值來計(jì)算。例如，核糖核酸酶A的分子量為13.7kDa，有l(wèi)l個(gè)可利用的氨基；尿酸酶61的分子量為130kDa,有100個(gè)可利用的氨基；過氧化氫酶的分子量為240kDa，有112個(gè)可利用的氨基。室溫下分別以2/1和1/1的聚合物-蛋白質(zhì)氨基摩爾比向三種酶溶液(2.5mg/ml)中加入M-POZ-0-CH2-C02-NHS或PEG-0-CH2-C02-NHS固體。天然形式的核糖核酸酶、尿酸酶和過氧化氬酶的蛋白質(zhì)濃度分別用9.45x103、13x103和L67xl05的摩爾消光系凄t在280nm下用分光光度法評價(jià)。30分鐘后，通過凝膠過濾色譜SephadexG-75柱用O.IMpH7.4的磷酸鹽緩沖溶液作洗脫劑從未反應(yīng)的聚合物和N-羥基琥珀酰亞胺中純化聚合物-酶偶聯(lián)物。用比色法通過TNBS分析評價(jià)蛋白質(zhì)修飾度并以偶聯(lián)的氨基對蛋白質(zhì)上存在的總的氨基的百分?jǐn)?shù)表示。天然和經(jīng)修飾的酶的酶活性按如下評價(jià)核糖核酸酶活性通過Crook等(BiochemJ.1960Feb;74:234-8)的方法分析；尿酸酶活性通過Mahler的方法測定(AnalBiochem.1970Nov;38(1):65-84);過氧化氳酶按Beers和Sizer報(bào)道的方法分析(J.Biol.Chem.1952Mar;195(1):133-40)。核糖核酸酶(RNAse)、尿酸酶和過氧化氬酶的結(jié)果分別在表7A-C中給出。表7A產(chǎn)物NHz:聚合物摩爾比%修飾%活性RNAse不適用不適用100POZ/RNAse1:12350POZ/RNAse2:13630PEG/RNAse1:16015PEG/RNAse2:18010表7B產(chǎn)物叫:聚合物摩爾比%修飾%活性尿酸酶不適用不適用100<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>發(fā)現(xiàn)當(dāng)用PEG-0-CH2-C02-NHS修飾時(shí)比用M-POZ-0-CH2-C02-NHS修飾時(shí)核糖核酸酶被修飾的程度高并因此有更高的活性損失。在尿酸酶中，使用PEG-0-CH2-C02-NHS和M-POZ-0-CH2-COrNHS時(shí)的》務(wù)飾度和活性損失相似；但在受試的兩種摩爾比下POZ偶聯(lián)物表現(xiàn)出略高的活性。對于過氧化氫酶，使用PEG-0-CH2-C02-NHS和M-POZ-0-CH2-C02-NHS時(shí)的修飾程度相似，且注意到兩種情況下酶活性的損失均較小，且在受試的兩種摩爾比下POZ偶聯(lián)物的活性比PEG偶聯(lián)物更高。實(shí)施例27:TGAse下M-PEOZ-NHi與G-CSF的偶聯(lián)本實(shí)施例中檢查了使用酶TGAse時(shí)POZ-NH2對G-CSF的位點(diǎn)特異性修飾。也用PEG-NH2和相同的試劑濃度進(jìn)行相同的反應(yīng)作為比較。如上所述從產(chǎn)物M-PEOZ-OH開始制備單官能烷基胺M-PEOZ衍生物。TGAse-催化的M-PEOZ-NH2和PEG-NH2與G-CSF的偶聯(lián)在0.1MpH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中于室溫進(jìn)行18小時(shí)，其中使用1.6mgG-CSF、50mg任一胺和2mg/mlTGAse(市場上可獲得)。在這些條件下，G-CSF與M-PEOZ-NH2沒有顯著或明顯的偶聯(lián)發(fā)生(如反相色鐠所示；詳情見上)，而PEG-NH2給出明顯的偶聯(lián)。當(dāng)向M-PEOZ-NH2的反應(yīng)混合物中再加入2mg/mlTGAse酶時(shí)，天然G-CSF蛋白質(zhì)峰將減小并觀察到代表偶聯(lián)物M-PEOZ-G-CSF的新峰。實(shí)施例28:M-PEOZ搭的制備0、rwd^jH°"二醇的制備在細(xì)頸瓶中制備3-氨基-l，2-丙二醇(1.41gm,15mmol)/0.1MpH8.0的硼酸緩沖溶液(3mL)。用濃HCl調(diào)節(jié)溶液pH至pH9。劇烈攪拌下向該溶液中加入如上所述制備的M-PEOZNHS酯(1.00gm,0.197mmo1)。加入1NNaOH使溶液pH保持在9。溶液在室溫下攪拌三小時(shí)。用1NHCl調(diào)節(jié)溶液pH至pH6.8。向溶液中加入氯化鈉(3gm)。向溶液中加入水(lmL)，然后用二氯曱烷萃取三次(3xl0mL)。'棄去水相。有機(jī)層用無水疏酸鎂干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮溶液在二乙醚(100mL)中沉淀。所得粉末在高真空下干燥整夜。產(chǎn)量0.7gm。根據(jù)NMR,取代度為96%;根據(jù)GFC，取代度為95%。在DMSO-d6中的NMR:-C(=0)NHCH2CH(OH)CH2OH:1H,S4.49，t;-C(=0)NHCH2CH(OH)CH2OH:1H,54.70,d;-C(=0)NHCH2CH(OH)CH2OH:1H，S7.87,t(分辨率不良)。氧化成醛將二醇(0.500gm，0.112mmol)溶解在水(8mL)中。通過加入0.INNaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.85，然后加入高碘酸納(27.9mg,0.130mmo1)。溶液于室溫?cái)嚢枰恍r(shí)。向溶液中加入水(2mL)和NaCl(2gm)。用二氯甲烷萃取溶液三次(3xlOmL)。合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥。過濾混合物，然后在減壓下濃縮濾液。殘余物通過加到乙醚(50mL)中而沉淀。過濾后所得粉末在高真空下干燥。產(chǎn)量0.47gm。GPC測得Mn為4840Da。根據(jù)CDC13中的NMR,醛取代度為89%。CDC13中的1H國NMR:-C(=0)NHCH2CHO,1H，S9.635,s;-C(=0)NHCH2CHO,2H,54.175,q(分辨率差)。實(shí)施例29:從M-PEOZ-PNPC合成M-PEOZ馬來酰亞胺2KN02(T,N、、0n^Ja_^0。Et0、"H0向二氯曱烷(5mL)中AH2-氨乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽(0.065g,0.255mmol〕和三乙胺(0.097mL,0.696mmol)的混合物中加入如上所述制備的M-PEOZ對硝基苯基碳酸酯(Mn2150Da，0.500g,0.232rnrno1)。室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，混合物凈皮過濾，然后逐滴加入二乙醚中，得到淡黃色沉淀。輕輕倒出溶劑，固體物在真空下干燥，得到定量產(chǎn)率。除普通的主鏈峰外，iHNMR譜還表明在4.1Sppm(brs,2H)處有末端亞甲基質(zhì)子(-C02-OCO-NH-)且在6.72ppm(s,2H)處有與馬來酰亞胺有關(guān)的質(zhì)子。通過比較引發(fā)曱基和馬來酰亞胺的積分，確定產(chǎn)率為~80%。實(shí)施例30:經(jīng)由異煙酸乙酯合成M-PEOZNHS酯65<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>乙酯的合成在室溫下向2-乙基-2-噁唑啉單體(50.47mL，0.500mol)/氯苯(250mL)溶液中加入三氟曱磺酸曱酯(2.83mL,25.0mmo1)。攪拌IO分鐘后，將反應(yīng)混合物加熱至110。C并保持40分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0。C,然后加入異煙酸乙酯(11.55mL，75.0mmo1)。所得混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)后，在醚(1500mL)中沉淀，得到57g白色粉末。將沉淀溶解在200mLH20中，然后用200mL二氯曱烷萃取三次。合并的有機(jī)屬用MgS04干燥，過濾并在真空下濃縮。將稠油狀殘余物溶解在CH2Ci2(lOOmL)中并在二乙醚(lOOOmL)中沉淀。輕輕倒出溶劑后，殘余物經(jīng)真空干燥得到43.5g白色粉末，產(chǎn)率為86%。NMR(500MHz，10mg/mlCDCl3)在1.12ppm(s,3H,CH3CH2CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH3Cff2CO-)、及3.46ppm(s,4H,->^/^(^6]^)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.9ppm(小)和l(Bppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(CHj-NCH2CH2)。派咬峰出現(xiàn)在1.Mppm(brs，3H)、1.90ppm(brs，2H)、2.15ppm(brs,2H)和2.84ppm(brs,2H)處。末端乙酯峰出現(xiàn)在1.26ppm(t,3H，《/=7.0MHz，-C(=0)OCH2CH5^p4.13ppm(q，2H,^^6.5MHz,-0:=0)06^2(:1^)處。0卩(3表明癒=17700&,0=1.06。]^^01給出Mn=2050Da，PD=1.02。酸的合成將M-PEOZ乙酯(Mn-2050Da,10.0g,4.89mmol)溶解在H20(60mL)中。加入NaOH(0.977g，24.4mmol)/H20(20mL)溶液，混合物^皮攪拌40分鐘。用5%的HC1水溶液酸化混合物，然后用二氯曱烷萃取。合并的有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過加到醚中沉淀。輕輕倒出醚，殘余物在真空下干燥得到9.0g白色粉末，產(chǎn)率為91%。iHNMR表明水解后乙酯基峰已完全消失。NHS酯的合成在O"C下向M-PEOZ-C02H(Mn2020Da，3.0g，1.49mmol)/二氯曱烷(50mL)的溶液中加入A^-羥基琥珀酰亞胺(0.173g，1.50mmol)和DCC(0.310g,1.5mmo1)。在冷態(tài)攪拌2小時(shí)后，使混合物升溫至室溫并攪拌整夜。過濾混合物并將濾液加到二乙醚中，得到白色粉末。通過過濾收集產(chǎn)物并在真空下干燥(2.8g，產(chǎn)率93%)。&NMR譜在2.89ppm(s,2H)處呈現(xiàn)出琥珀酰亞胺基質(zhì)子并有普通的主鏈峰。實(shí)施例31:嘗試制備M-PEOZ-曱磺酸鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>按如上所述制備M-PEOZ-OH2K。將M-PEOZ-OH2K(1.OOgm，0.608mmol)溶解在無水乙腈(20mL)中并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至近干。將殘余漿料再次溶解在乙腈(20mL)中并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)至近干。加入無水二氯甲烷(5mL)。在緩慢的氬氣流下先后加入三乙胺(169.3^L,1.215mmol)和甲磺酰氯(84.6|jL,1.094mmol)。溶液在氬氣氛下于室溫?cái)嚢枵埂Ｍㄟ^^走轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液。通過加到二乙醚中使?jié)饪s溶液沉淀。收集沉淀并在高真空下干燥。產(chǎn)量0.6gm。CDC13中的NMR表明有-CH2CH20Ms(S4.44)的峰，但面積與僅有約50%轉(zhuǎn)化的情況相一致。-OMs的低取代歸因于形成甲磺酸鹽后形成噁唑啉鹽離子的副反應(yīng)。CDC13中的NMR在55.01(2H,t,帶正電荷的五員環(huán)-OCH2CH2N;^p54.44(2H，t，相同的五員環(huán)-0-CH2CH2N;位移與-CH2-OMs同)處呈現(xiàn)出峰。實(shí)施例32:M-PPOZ-OH的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>向剛干燥并蒸餾的2-正丙基-2-噁唑啉(0.500g,4.42mmol)與剛干燥并蒸餾的氯苯(2mL)的混合溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(MeOTf,25.0pL，0.221mmol)。攪拌IO分鐘后，將混合物加熱至110。C并保持20分鐘。將混合物冷卻至0。C并用NaOH(0.044g,1.11mmol)/曱醇(2mL)溶液終止。NMR(500MHz,10mg/mLCDCb)在0.95ppm(s，3H，CfiGCH2CH2CO-)、1.65ppm(s,2H,CH3CfiT2CH2CO-)、2.25ppm(小s)和2.34ppm(大s)(總面積3H,CH3CH2Cff2CO-)、及3.45ppm(s,4H,-NC^C02N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。引發(fā)曱基峰以2.94ppm(小)和3.03ppm(大)處的兩個(gè)單峰出現(xiàn)(C^5-NCH2CH2，總面積3H)。末端亞曱基(-OCflVOH)出現(xiàn)在3.8ppm處。粗混合物的GPC表明Mn=1760Da,PD=1.1。實(shí)施例33:M-PPOZ-硫代丙酸的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>按如上所示用2-丙基-2-噁唑啉(5.66mL,50mmol)和三氟曱磺酸曱酯(0.808mL,7.14mmol)在氯苯(25mL)中加熱至110。C保持25分鐘并然后冷卻至0。C制備M-PEOZ+。為獲得終止試劑，在0。C下向叔丁醇鉀(1.60g,14.3mmol)/氯苯(14mL)懸浮液中逐滴加入!3-巰基丙酸曱酯(3,(WmL，28.6mmol)。混合物在冷態(tài)攪拌2小時(shí)后，用注射器逐滴加入]\4-￡02+/氯苯溶液?；旌衔镌诶鋺B(tài)攪拌4小時(shí)，然后于室溢攪拌18小時(shí)。加入水(30mL)并通過加入5%的HC1水溶液^f吏混合物酸化(pH3)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去揮發(fā)物(包括氯苯)。所得水溶液用H20(60mL)和固體NaOH(1.43g，35.7mmol)稀釋。攪拌l小時(shí)后，用5%的HC1水溶液使混合物酸化，然后用二氯曱烷萃取。合并的有機(jī)相用疏酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過加到醚中沉淀。輕輕倒出醚，殘余物在真空下干燥得到粘稠而澄清的黃色油。GPC呈現(xiàn)出單個(gè)主峰，Mn為867Da，PD為1.01。GFC表明粗產(chǎn)物含兩種不同的物類M-PPOZ-T-C02H(80%)和M-PPOZ-T-OH(20%)。實(shí)施例34:'M-PEOZ-T一見黃酸的合成將視黃酸(0.0102g，0.0425mmol)和羥基苯并三唑(HOBt,0.0115g，0.0849mmol)溶解在乙腈(10mL)中并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)共沸。將殘余物再溶解在二氯甲烷(3mL)中。加入固體DCC(0.0088g,0.0425mmo1)，混合物攪拌2小時(shí)。向混合物中加入M-PEOZ-NH24300Da(0.122g,0.0283mmol)并攪拌40小時(shí)。將混合物緩慢加到二乙醚中，得到淺黃色粉末。過濾產(chǎn)物并干燥，得到0.0823g產(chǎn)物，產(chǎn)率為63%。實(shí)施例35:'用M-PEOZ-SCM修飾Ara-C及偶聯(lián)物活性POZ畫偶聯(lián)將M誦PEOZ誦0-CH2-C02-NHS(M-PEOZ-SCM5000)(180mg,0.034謹(jǐn)ol)溶解在llmL吡咬中并于0。C下加到事先溶解在5mL無水吡啶中的胞嘧啶阿拉伯糖(Ara-C)(5.7mg,0.023mmo1)溶液中。所得溶液于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反相HPLC(C-18柱)表明反應(yīng)完全。蒸發(fā)除去溶劑后將產(chǎn)物溶解在二氯曱烷(5mL)中并逐滴加到150mL醚中。于4°C離心收集沉淀并在真空下干燥。產(chǎn)量150mg,產(chǎn)率80%。NMR呈現(xiàn)出M-PEOZ主鏈的普通峰(見上)及在7.31、7.67、8.16和8.62ppm處呈現(xiàn)出Ara-C的嘧。定質(zhì)子峰。將偶聯(lián)物暴露于pH8緩沖溶液后顯示Ara-C緩慢釋放(24小時(shí)后釋放15%),故該偶耳關(guān)物可祐:一見為前藥。偶聯(lián)物活性69將按標(biāo)準(zhǔn)程序培養(yǎng)的人子宮頸腺癌細(xì)胞(HeLa)接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中。24小時(shí)后更換新鮮的培養(yǎng)基并用濃度漸增的M-PEOZ-Ara-C或游離的Ara-C(20mM，Ara-C中)的水溶液處理細(xì)胞。將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下孵育72小時(shí)。進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)檢測確定細(xì)胞活力。該檢測發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)的Ara-C對Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒性，但比游離的Ara-C的細(xì)胞毒性低約30倍，這與偶聯(lián)物的緩慢釋放過程相一致。與以類似方式制備的PEG-Ara-C的比較表明，PEG-和POZ-偶聯(lián)物具有相似的性質(zhì)。實(shí)施例36:H-PEOZ-S-CH7CH2-C02H的合成在環(huán)^溫度和氬氣下混合氯苯(25mL)與2-乙基-2-噁唑啉(9.92g,O.lmol，200eq.)并冷卻至0。C。攪拌下加入三氟曱磺酸(0.075g，leq.),反應(yīng)混合物被攪拌30分鐘。然后將混合物加熱至80。C并攪拌7小時(shí)。通過使氺又丁醇鉀(168mg,3eq.)與3-巰基丙酸曱酯(0.360g,6eq.)在0。C下反應(yīng)6小時(shí)單獨(dú)制備終止混合物。將終止混合物在0。C下加到聚合反應(yīng)中，然后于室溫?cái)嚢枵?。然后將溶液與50mL0.25M的氫氧化鈉混合并攪拌一小時(shí)。分離水層，用氯化鈉飽和，并用二氯曱烷萃取(250mLx3)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯曱烷，聚合物在真空下干燥。所得酸通過DEAE色譜純化，得到1.5克白色粉末。質(zhì)子NMR在U2ppm(m,3H，CH3CH2CO-)、2.31ppm(m)和2.41ppm(s)(面積2H，CH3CH2CO-)、及3.47ppm(m，4H，-NCH2CH2N-)處呈現(xiàn)出普通的主鏈峰。丙酸酯亞曱基峰出現(xiàn)在2.74、2.81和2.85ppm處。GFC呈現(xiàn)出單個(gè)峰。GPC給出Mn為15，200Da，PD為1.09。前面的描述說明和描述了本公開的化合物和應(yīng)用的某些實(shí)施方案。此外，本公開僅示出和描述了所述化合物和應(yīng)用的示例性實(shí)施方案，如上面所提到的，應(yīng)理解本公開的公開能用于各種其他組合、變型和環(huán)境中并能與上面的公開和/或相關(guān)領(lǐng)域技能或知識相適應(yīng)地在本文中所明確的構(gòu)思范圍內(nèi)變化和政變。上文中描述的實(shí)施方案還意在說明已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式以及使本領(lǐng)域技術(shù)人員能以這樣或那樣的實(shí)施方案及本發(fā)明的特定應(yīng)用或用途所需的各種變型利用本發(fā)明。因此，本說明書非意在限制本發(fā)明于本文中所公開的形式。本文中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中，就好像完全是本公開中給出的一樣。權(quán)利要求1、一種末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物，所述POZ化合物包含POZ聚合物，所述POZ聚合物在其末端上有單個(gè)活性官能團(tuán)，所述官能團(tuán)能與靶分子上的基團(tuán)反應(yīng)而產(chǎn)生靶分子-POZ偶聯(lián)物，其中所述靶分子和所述POZ化合物間的所有連接均為水解穩(wěn)定的連接。2、如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述POZ聚合物包含結(jié)構(gòu)R廣[N(COR7)CH2CH2]n,其中Ri為氫、未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，夂舌智逸^AAT—《*AiJj;杏A去瓦？乂^AA《fe^AA、l"會(huì)Jt、漆A《吝;Jt旁復(fù)以及n為3-1000的整數(shù)。3、如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，R7含l-12個(gè)碳原子。4、如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，R7為甲基、乙基或正丙基。5、如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。6、如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述靶分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。7、一種聚噁唑啉(POZ)化合物，所述POZ化合物包含POZ聚合物，所述POZ聚合物在其末端上有單個(gè)活性官能團(tuán)，所述官能團(tuán)能與靶分子上的基團(tuán)反應(yīng)而產(chǎn)生耙分子-POZ偶聯(lián)物，其中所述耙分子與所述POZ化合物間的所有連接均為水解穩(wěn)定的連接，且所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2。8、如權(quán)利要求7所述的化合物，其中，所述POZ聚合物包含結(jié)構(gòu)R廣[N(COR7)CH2CH2]n,其中R4為氫、未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，各重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，以及n為3-1000的整數(shù)。9、如權(quán)利要求8所述的化合物，其中，R7含l-12個(gè)碳原子。10、如權(quán)利要求8所述的化合物，其中，R7為曱基、乙基或正丙基。11、如權(quán)利要求7所述的化合物，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。12、如權(quán)利要求7所述的化合物，其中，所述扭分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。13、一種基本結(jié)構(gòu)為RrPOZ-Pp-Qq-X的末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物，其中，POZ為[N(COR7)CH2CH2]nX為能與靶分子形成水解穩(wěn)定的連接以形成靶分子-POZ偶聯(lián)物的活性官能團(tuán)；P為連接基團(tuán)，包括但不限于-O-、-S-、NH、-NR-、未取代的雜環(huán)基，Q為連接基團(tuán)，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-Rs、-(1115)1-或-(013114)111匿；POZ的各重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；芳烷基、雜環(huán)基、芳基、鏈烯，Ri、R3-R4、Ru和Ri4-R,5各自獨(dú)立地選自氫、未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；R_8為-C6H10-CH2-;n為3-1000的整數(shù)；m為1-10的整凄史；p和q為獨(dú)立地選自0或1的整數(shù)；14、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)被保護(hù)。15、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，R7含l-12個(gè)碳原子。16、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，R7為曱基、乙基或正丙基。17、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)選自由醛、活性碳酸鹽(-OCO-Z)、馬來酰亞胺、磺酸酯(OS02-R23)、酰肼、環(huán)氧化物、碘乙酰胺、炔、疊氮化物、異氰酸鹽、氰酸鹽、異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰囟、活性酯(-CO-Z)和羧酸組成的集合，其中任何前述官能團(tuán)都可以是取代的或未取代的，Z為活化基團(tuán)，以及R23為未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。18、如權(quán)利要求17所述的化合物，其中，所述磺酸酯為三氟乙基磺酸酯或甲磺酸酯。19、如權(quán)利要求17所述的化合物，其中，Z為N-琥珀酰亞胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亞胺氧基、對硝基苯氧基、1-咪唑基或1-苯并三唑氧基。20、如權(quán)利要求17所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)的雜環(huán)為取代的或未取代的哌溱基或取代的哌啶基。21、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，所述POZ聚合物的多^R性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。22、如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，所述靶分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。23、一種基本結(jié)構(gòu)為RrPOZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X的末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物，其中，POZ為[N(COR7)CH2CH2〗nX為能與靶分子形成水解穩(wěn)定的連接以形成靶分子-POZ偶聯(lián)物的活性官能團(tuán)；P為連接基團(tuán)，包括但不限于-O-、-S-、NH、-NR-、未取代的雜環(huán)基，Q為連接基團(tuán)，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-Rs、-(1115)1-或-(€113&)1畫；U為連接，選自由-(R^)。-、-(CR5R6)。-、-順-&21-麗(:0-1122-組成的集合；W為連接基團(tuán)，選自由-NH-CO-O-、-NH-CO、-NH-CO-NH-、-NH-CS-NH畫、-O-、-S-、-NH-和SO-CO-NH組成的集合；POZ的各重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；R!、R3-R6、R、Rw-R!6和1121-1122各自獨(dú)立地選自氫、未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；R8為-C6H10-CH2-;n為3-1000的整數(shù)；m和o獨(dú)立;也選自1-10的整數(shù)；p、q、w和u為獨(dú)立地選自0或1的整數(shù)。24、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)被保護(hù)。25、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，R7含l-12個(gè)碳原子。26、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，R7為曱基、乙基或正丙基。27、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)選自由醛、活性碳酸鹽(-O-CO-Z)、馬來酰亞胺、磺酸酯(OS02-R23)、酰肼、環(huán)氧化物、碘乙酰胺、炔、疊氮化物、異氰酸鹽、氰酸鹽、異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卣、活性酯(-CO-Z)和羧酸組成的集合，其中任何前述官能團(tuán)都可以是取代的或未取代的，Z為活化基團(tuán)，1123為未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。28、如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述磺酸酯為三氟乙基磺酸酯或曱磺酸酯。29、如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，Z為N-琥珀酰亞胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亞胺氧基、對硝基苯氧基、1-咪唑基或1-苯并三唑氧基。30、如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)的雜環(huán)為取代的或未取代的p底溱基或取代的哌咬基。31、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。32、如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，所述耙分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。33、一種基本結(jié)構(gòu)為RrPOZ-C-Qq-X的末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物，其中，POZ為,0117恥X為能與靶分子形成水解穩(wěn)定的連接的活性官能團(tuán)；Q為連接基團(tuán)，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)m-CONH-(CH2)m-、-NH-(CH2)m-NHCO-(CH2)m-、-CO-(CH2)m-、-CO-C6H4-、或-CO-Rs、-(1115)1-或-(013114)1畫；C為連接基團(tuán)，選自由-O-、-NR19-、-S-、-NH-或所述POZ部分與所述哌啶或哌"秦環(huán)的N基團(tuán)間形成的含-N-連接；POZ的各重復(fù)單元的R7獨(dú)立地選自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；R"R3-R4、Ru、R44-R15和R19各自獨(dú)立地選自氫、未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；為-C6H10-CH2-;n為3-1000的整數(shù)；m為1-10的整數(shù)；q為0或1的整it;34、如權(quán)利要求33所述的化合物,其中，所述活性官能團(tuán)被保護(hù)。35、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，R7含l-12個(gè)碳原子。36、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，R7為甲基、乙基或正丙基。37、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，所述活性官能團(tuán)選自由醛、活性碳酸鹽(-O-CO-Z)、馬來酰亞胺、磺酸li旨(OSCVR23)、酰肼、環(huán)氧化物、碘乙酰胺、炔、疊氮化物、異氰酸鹽、氰酸鹽、異硫氦酸鹽、硫氰酸鹽、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卣、活性酯(-CO-Z)和羧酸組成的集合，其中任何前述官能團(tuán)都可以是取代的或未取代的，Z為活化基團(tuán)，1123為未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。38、如權(quán)利要求37所述的化合物，其中，所述磺酸酯為三氟乙基磺酸酯或曱磺酸酯。39、如權(quán)利要求37所述的化合物，其中，Z為N-琥珀酰亞胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亞胺氧基、對硝基苯氧基、1-咪唑基或1-苯并三唑氧基。40、如權(quán)利要求37所述的化合物，其中，所述X基團(tuán)的雜環(huán)為取代的或未取代的艱，秦基或取代的派咬基。41、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。42、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，所述化合物為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>43、如權(quán)利要求33所述的化合物，其中，所述耙分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。44、一種通式為A-B-TM的靶分子-POZ偶聯(lián)物，其中A為在其末端上有單個(gè)活性官能團(tuán)的POZ化合物減去所述POZ化合物上的活性官能團(tuán)與靶分子上的結(jié)合對象的反應(yīng)過程中消除的任何離去基團(tuán)；TM為靶分子，所述耙分子含所述結(jié)合對象；以及B為所述活性官能團(tuán)與所述結(jié)合對象間形成的水解穩(wěn)定的連接。45、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述活性官能團(tuán)為三氟乙基磺酸所述結(jié)合對象為SH,以及B為硫醚連接。46、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述活性官能團(tuán)為馬來酰亞胺，西:所述結(jié)合對象為SH,以及B為硫醚連接。47、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述活性官能團(tuán)為活性碳酸鹽，所述結(jié)合對象為NH2，以及B為氨酯連接。48、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述活性官能團(tuán)為活性酯，所述結(jié)合對象為NH2，以及B為酰胺連接。49、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述活性官能團(tuán)為醛，所述結(jié)合對象為NH2，以及B為胺連"f姿。50、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述POZ化合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。.<51、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述POZ化合物為權(quán)利要求l.、權(quán)利要求13、權(quán)利要求23或權(quán)利要求33所述的POZ化合物。52、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述耙分子-POZ偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期在生理?xiàng)l件下增大。53、如權(quán)利要求44所述的偶聯(lián)物，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。54、一種合成末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物的方法，所述方法包括步驟(a)引發(fā)POZ聚合以形成在末端上具有帶正電荷的陽離子的POZ聚合物；以及(b)用親核試劑終止所述POZ聚合物55、如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述親核試劑為^f危醇鹽。56、如權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述硫醇鹽包含結(jié)構(gòu)R25S-Dd-X,其中X為活性官能團(tuán)或能轉(zhuǎn)化為活性官能團(tuán)的基團(tuán)，所述活性官能團(tuán)能與靶分子形成水解穩(wěn)定的連接以形成靶分子-POZ偶聯(lián)物；R25為金屬；D為連接基團(tuán)，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、雜環(huán)基或芳基、-(CH2)b-CONH-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-NHCO-(CH2)b-、-CO-(CH2)b-、-CO-C6H4-、或-CO-R26、或-(01271128)^R27和R28各自獨(dú)立地選自氫或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合；R26為-C6Hi。-CH2-；d為0或l;以及b為l-10的整凄t。57、如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述活性官能團(tuán)選自由醛、活性碳酸鹽(-O-CO-Z)、馬來酰亞胺、磺酸酯(OS02-R23)、酰肼、環(huán)氧化物、硤乙酰胺、炔、疊氮化物、異氰酸鹽、氰酸鹽、異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卣、活性酯(-CO-Z)和羧酸組成的集合，其中任何前述官能團(tuán)都可以是取代的或未取代的，Z為活化基團(tuán)，R23為未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。58、如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述磺酸酯為三氟乙基磺酸酯或甲磺酸酯。59、如權(quán)利要求56所述的方法，其中，Z為N-琥珀酰亞胺氧基、氯、溴、磺基-N-琥珀酰亞胺氧基、對硝基苯氧基、1-咪唑基或1-苯并三唑氧基。60、如權(quán)利要求56所述的方法，其中，R25為Li、Na或K。61、如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述活性官能團(tuán)凈皮保護(hù)。62、如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述POZ聚合物的多分散性值低于或等于1.2、低于或等于l.l、或低于或等于1.05。63、一種具有如下結(jié)構(gòu)的化合物(a》CHH即OCH2CH3》CH2C恥-OCO跳CH2CHr職(b》CH3-[N(COCH2CH3)CH2CHJtt-S-CH2CHrC02H(e)CHHN《COCH2CH3)CH2CH2〗『S-CHrC02H(d》CH3-p(COCH2CH3)CH2CH2]nCH2CH2-NH2(e)CHrN(COCH2CH3》CH2CHd『OCONH,ai2-CHO(f)CH3'[N(COCH2CH2CH3)CH2CH2]n-SCH2CH2-CO^H(g),即00^013)0120€20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中，n為3-1000的整數(shù)。全文摘要本公開提供了具有一系列活性官能團(tuán)的末端活化的單官能POZ衍生物，所述活性官能團(tuán)可使所述單官能POZ衍生物與多種靶分子在廣泛的反應(yīng)條件下偶聯(lián)以產(chǎn)生水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物。此外，本公開提供了合成所公開的末端活化的單官能POZ衍生物及用所公開的末端活化的單官能POZ衍生物產(chǎn)生的水解穩(wěn)定的靶分子-POZ偶聯(lián)物的新方法。文檔編號A01N47/00GK101686687SQ200880013983公開日2010年3月31日申請日期2008年2月28日優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日發(fā)明者J.·米爾頓·哈里斯,尹君尚,弗朗西斯科·瑪麗亞·委羅內(nèi)塞,方志浩,邁克爾·大衛(wèi)·本特利申請人:塞瑞納治療公司