專利名稱：：抗蟲棉花植物及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，植物材料及種子，其特征在于包含一個特定的轉(zhuǎn)化事件，特別是在棉花基因組的特定部位存在編碼可賦予昆蟲抗性的蛋白的基因。本發(fā)明的棉花植物組合了昆蟲抗性表型、農(nóng)學(xué)性狀、遺傳穩(wěn)定性、以及對不同遺傳背景的適應(yīng)性(等同于非轉(zhuǎn)化棉花系在無昆蟲狀況下)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在生物樣品中鑒定特別包含了轉(zhuǎn)化事件EF-GH5的植物材料的存在的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：植物中轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)取決于基因本身的結(jié)構(gòu)，以及其在植物基因組中的位置。同時，在基因組的不同位置轉(zhuǎn)基因(外源DNA中)的存在將以不同的方式影響植物的整體表型。通過遺傳操作，在農(nóng)學(xué)上或工業(yè)上成功地將商業(yè)上感興趣的性狀引入到植物中是一個長期的過程，這取決于不同的因素。轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第一步，選擇步驟包括廣泛的遺傳表征，育種，田間試驗(yàn)評價，最終實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品系的選擇。棉纖維是全世界最重要的紡織原料。每年全球收獲大約80，000，000英畝棉花。就面積產(chǎn)量而言，棉花是美國第五大作物，2000年其種植超過了15,000,000英畝?？棵藁樯淖罹咂茐男缘睦ハx物種有/^//cover/w(玉米果穗螟蜂或棉鈴蟲)、^Te/icover/mtfr附/gem(美洲棉鈴蟲)、^^//W/r/sv/resce"s(煙青蟲)及/Te//covcr/7fl戸wc,/gmi。鑒于對新型食品和新型祠料的關(guān)注，GMO和非GMO產(chǎn)品的分開，9以及對專利材料的鑒別，優(yōu)良事件的明確鑒定正變得愈加重要。理想的是，該鑒定方法既快又簡單，還不需要大量的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。此外，該方法應(yīng)提供不需專家解釋就能使優(yōu)良事件明確確定的結(jié)果，但是如果必要的話，在專家伃細(xì)審查下，結(jié)果被證明有效。本文描述了在生物樣品中鑒定優(yōu)良事件EF-GH5而用到的特定工具。在開發(fā)抗蟲棉(G^5^/"附/^'raW"柳)過程中，從轉(zhuǎn)基因棉花植物群體中將EE-GH5鑒定作為優(yōu)良事件，它包含編碼來自蘇云金芽孢桿菌(丑""7/附幼W7'fl^e附&)的殺蟲晶體蛋白的基因。轉(zhuǎn)基因棉花植物包含編碼Bt殺蟲晶體蛋白(如WO03/093484所述)的嵌合基因，其處于植物可表達(dá)啟動子的控制之下。包含抗蟲基因的棉花植物已經(jīng)在本領(lǐng)域中公開。但是，并沒有任何現(xiàn)有技術(shù)公開內(nèi)容教導(dǎo)或提示了本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織，其包含穩(wěn)定整合在其基因組中的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含一個包含crylAb基因編碼序列的抗蟲基因(如本文實(shí)施例1.1所述)，其為抗蟲的，在無昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基因植物及其材料具有與非轉(zhuǎn)基因的等基因系基本上等同的農(nóng)學(xué)性能。在有昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基因植物將具有比非轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)越的農(nóng)學(xué)表型。根據(jù)本發(fā)明，棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織包含優(yōu)良事件EE-GH5。更確切地說，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、其種子、細(xì)胞或組織，其基因組DNA的特征在于，當(dāng)用本文所述的PCR鑒定方法分析，使用兩個分別針對EE-GH5的5，或3'側(cè)翼區(qū)和外源DNA的引物時，得到特異于EE-GH5的片段。所述引物可以分別針對SEQIDNo:1的5，側(cè)翼區(qū)和外源DNA內(nèi)，例如可以分別包含SEQIDNo:7和SEQIDNo:8的核苷酸序列或由其組成，得到100-700bp的DNA片段，優(yōu)選大約129bp。該引物也可以分別4十對SEQIDNo:2內(nèi)的3，側(cè)翼區(qū)和外源DNA,例如可以分別包含SEQIDNo:3和SEQIDNo:6的核苷酸序列或由其組成，得到300-700bp的DNA片段，優(yōu)選是大約369bp。包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的參考種子已經(jīng)保藏在ATCC，保藏號為PTA-8171。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是，以ATCC保藏號PTA-8171保藏的包含優(yōu)良事件EE-GH5的種子，它可以長成對昆蟲(特別是對好^/"1^7乎或/^//<^&印.)有抗性的棉花植物。ATCC保藏號為PTA-8171的種子是一個種子庫，其中包含的至少大約95%的轉(zhuǎn)基因籽粒對于所述轉(zhuǎn)基因是純合的，包含本發(fā)明的優(yōu)良事件，這些種子可以長成抗蟲植物，因而這些植物也可以是草銨膦耐受植物?？刹シN種子，且生長的植物可以用本文所述的草銨膦處理，從而得到含有本發(fā)明的優(yōu)良事件的百分之百耐受草銨膦的植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的植物而來的細(xì)胞，組織及子代和后代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的棉花植物的繁殖和/或育種可以得到的植物。本發(fā)明也涉及包含優(yōu)良事件EE-GH5的棉花植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定包含優(yōu)良事件EE-GH5的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的方法，該方法是基于對轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞或組織中的特征DNA序列或由該DNA序列編碼的氨基酸的存在進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，這樣的特征DNA序列是15bp的序列，優(yōu)選是20bp，最優(yōu)選是30bp或更多，這些序列包含該事件的插入位點(diǎn)，即部分外源DNA和部分與之相鄰的棉花基因組(5，或3，側(cè)翼區(qū))，這使得優(yōu)良事件可以被特別鑒定。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在生物樣品中鑒定優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法基于可以特異識別EE-GH5的5，和/或3，側(cè)翼序列的引物或探針。更確切地說，本發(fā)明涉及包括擴(kuò)增生物樣品中存在的核酸序列的方法。該方法使用至少兩個引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，一個識別EE-GH5的5，或3，側(cè)翼區(qū)，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列，優(yōu)選得到一個100-500bp的DNA片段。該引物可以分別識別EE-GH5的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQIDNo.l的1-98位的序列，或SEQIDNo.16的1-563位的序列)或EE-GH5的3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQIDNo.2的41-452位的互補(bǔ)序列),以及外源DNA內(nèi)的序列(SEQIDNo.l的99-334位的互補(bǔ)序列，或SEQIDNo.2的l-40位的序列)。識別5'側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQIDNo.7或SEQIDNo.17的核苷^列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文所述的SEQIDNo.8，SEQIDNo.18或SEQIDNo.19的核苷醋列。識別3，側(cè)翼區(qū)的引物可以包含本文所述的SEQIDNo.6的核苷酸序列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文所述的SEQIDNo.3的核苷酸序列。本發(fā)明更特別地涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法包括利用分別具有SEQIDNo.3和6的核苷酸序列的兩個引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增生物樣品中的核,列，得到大約369bp的DNA片段。目前的優(yōu)良事件包含一個外源DNA序列，與最初用于轉(zhuǎn)化程序的DNA相比，該序列發(fā)生了輕微的重排。這一重排對于優(yōu)良事件EE-GH5是獨(dú)特的。因此，本發(fā)明還涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法包括通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到一個大約262bp的DNA片段，所用的引物位于EE-GH5中外源DNA的獨(dú)特重排區(qū)的兩側(cè)，例如包含或具有SEQIDNo.10或SEQIDNo.ll的核苷,列的引物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文所述的EE-GH5的特異側(cè)翼序列，其可以用來開發(fā)特定的鑒定方法來鑒定生物樣品中的EE-GH5。此類特定的側(cè)翼序列在鑒定試驗(yàn)中也可以用作參考對照材料。更特別的是，本發(fā)明涉及可以用來開發(fā)如本文進(jìn)一步所述的特異引物和探針的EE-GH5的5，和/或3，側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明也涉及跨越EE-GH5的外源DNA內(nèi)的特定重排的核酸分子，例如，包含SEQIDNo.12的52-88位核苷酸序列的核酸分子，或包含SEQIDNo.12的序列的核酸分子。也適合作為參考材料的是優(yōu)選為大約369bp的核酸分子，其包含可以被具有SEQIDNo.3和6的核苷酸序列的引物擴(kuò)增的序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及，基于這些特異引物和探針的使用，從而對生物樣品中EE-GH5的存在進(jìn)行鑒定的方法。引物可以由17至大約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo.l的l-98位核苦酸的核苷酸序列、SEQIDNo.16的1-563位核苷酸的核苷酸序列、或者SEQIDNo.2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，與由17至大約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成的引物相組合，所述引物選自SEQIDNo.l的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，及SEQIDNo.2的1-40位核香酸的核苷酸序列。引物也可以包含定位在3，末端的核苷酸序列，進(jìn)一步包含無關(guān)序列，或來源于所述核苷酸序列但包含錯配的序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個可以特異識別EE-GH5的5，或3，側(cè)翼區(qū)或者可以特異識別EE-GH5中外源DNA序列內(nèi)的特異重排的引物或探針。除了可以特異識別EE-GH5的5，或3，側(cè)翼區(qū)的引物夕卜，本發(fā)明的試劑盒可以包含第二個特異識別EE-GH5的外源DNA內(nèi)的序列的引物，以便用在PCR鑒定方案中。本發(fā)明的試劑盒可以包含至少兩個特異引物，一個識別EE-GH5的5，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。識別5，側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQIDNo.3的核苷*列，識別轉(zhuǎn)基因的引物可以包含SEQIDNo.6的核苷酸序列或本文所述的任何其它的引物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。所述的試劑盒包含具有SEQIDNo.3和6的核苷酸序列的PCR引物，用于本文所述的EE-GH5PCR鑒定方案中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。所述的試劑盒包含具有SEQIDNo.10和11的核苷酸序列的PCR引物。本發(fā)明也涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。該試劑盒包含特異探針，其具有相應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與EE-GH5的特定區(qū)域具有80-100%序列同一性的序列。優(yōu)選地，該^:針的序列相應(yīng)于包含部分EE-GH5的5，或3'側(cè)翼區(qū)部分的特定區(qū)域，或者相應(yīng)于對應(yīng)于EE-GH5特異的外源DNA的重排的區(qū)域。最優(yōu)選地，該特異探針具有(或互補(bǔ)于)與SEQIDNo.l的78-119位核苷,列、SEQIDNo.2的20-61位核苷酸序列或SEQIDNo.12的52-88位核苷酸序列有80-100%的序列同一性的序13列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，公開的DNA序列包含了事件的插入位點(diǎn)，以及足夠長的棉花基因組DNA和外源DNA(轉(zhuǎn)基因)的多核苷酸，以至于可以用作引物或探針來檢測EE-GH5。此類序列，在插入位點(diǎn)的每一側(cè)，可以分別包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及EE-GH5的外源DNA(轉(zhuǎn)基因)的相似數(shù)量的核苷酸。最優(yōu)選地，此類DNA序列包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及外源DNA的相似數(shù)量的核苷酸(與SEQIDNo.l或2的插入位點(diǎn)相鄰)。本發(fā)明所包括的方法和試劑盒可以用在不同的目的，例如，但不僅限于下列鑒定植物，植物材料或產(chǎn)品(例如但不僅限于包含或源于植物材料的新鮮或加工的食品或伺料)中是否存在EE-GH5;另外地或備選地，本發(fā)明的方法和試劑盒可用來鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，目的在于將轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因材料分離；另外地或備選地，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用來確定包含EE-GH5的植物材料的品質(zhì)(即純材料的百分比)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及EE-GH5的5，和/或3，側(cè)翼區(qū)，還涉及從EE-GH5的5，和/或3'側(cè)翼序列開發(fā)的特異引物和探針。本發(fā)明也涉及EE-GH5特定的重排區(qū)域，還涉及根據(jù)此區(qū)域設(shè)計(jì)的特異引物或探針。本發(fā)明也涉及從包含優(yōu)良事件EE-GH5的植物中得到的基因組DNA。在進(jìn)行本文所述的鑒定試驗(yàn)時，該基因組DNA可以用作參考對照材料。附圖簡述下面的實(shí)施例，不是為了將本發(fā)明限制于所述的特定實(shí)施方案，而是可以結(jié)合著附圖(并入本文作為參考)來理解。這些圖中圖l通過圖示了引用的核苷^列與引物之間的關(guān)系。黑色條形外源DNA;帶條紋的黑色條形EE-GH5特異的外源DNA中的重排；淺色條形植物來源的DNA;帶條紋的淺色條形預(yù)插入靶位點(diǎn)缺失；箭頭寡核苷酸引物，條形下的數(shù)字代表核苷酸位置；(c)代表的是所指的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。圖2顯示為EE-GH5開發(fā)的PCR鑒定方案的結(jié)果。凝膠的上樣順序泳道l:分子量標(biāo)記(IOObp序列梯)；泳道2-3:來自包含轉(zhuǎn)基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA樣品；泳道4-10:來自不包含優(yōu)良事件EE-GH5但包含類似抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因棉花植物的DNA樣品；泳道11:無模板DNA對照；泳道12:分子量標(biāo)記。圖3顯示為EE-GH5開發(fā)的接合性評分PCR方案得到的結(jié)果。凝膠的上樣順序泳道l:分子量標(biāo)記(IOObp序列梯)；泳道2-3:來自包含雜合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA樣品；泳道4:失??；泳道5:來自野生型棉花植物的對照DNA樣品；泳道6-7:來自包含純合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA樣品；泳道8:無模板DNA對照；泳道9:分子量標(biāo)記。發(fā)明詳述在植物基因組中摻入重組DNA分子典型地是由細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。摻入的特定位點(diǎn)通常是由于"隨機(jī)"整合決定的。通過用重組DNA或"轉(zhuǎn)化DNA"轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織而引入到植物基因組中并源于該轉(zhuǎn)化DNA的DNA在下文中稱為"外源DNA"，它包含一個或多個"轉(zhuǎn)基因"。本發(fā)明文中的"植物DNA"指的是源于被轉(zhuǎn)化植物的DNA。植物DNA通常見于相應(yīng)野生型植物的相同的基因座。外源DNA可通過在植物基因組中重組DNA分子的摻入位點(diǎn)處的位置和結(jié)構(gòu)來表征。植物基因組中重組DNA插入的位點(diǎn)也稱為"插入位點(diǎn)"或"靼位點(diǎn)"。重組DNA插入到被稱為"預(yù)插入植物DNA"的植物基因組的區(qū)域與植物DNA的缺失相關(guān)，稱之為"靶位點(diǎn)缺失"。本文使用的"側(cè)翼區(qū)"或"側(cè)翼序列"指的是不同于引入的DNA的至少20bp的DNA序列，優(yōu)選是至少50bp，多可至5000bp;優(yōu)選地，源于植物基因組的DNA，它要么位于外源DNA的緊上游區(qū)并與之相鄰，要么位于外源DNA的緊下游區(qū)并與之相鄰。導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化程序會產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，這些側(cè)翼區(qū)對每個轉(zhuǎn)化體而言是特征性的且是獨(dú)特的。當(dāng)通過傳統(tǒng)雜交將重組DNA引入到植物中時，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)，或其側(cè)翼區(qū)一般不再改變。本文使用的"插入?yún)^(qū)"所指的區(qū)域?qū)?yīng)于至少40bp的區(qū)域，優(yōu)選是至少100bp,多可至10000bp,該區(qū)域包含在包含植物基因組中外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列內(nèi)?？紤]到由于種內(nèi)突變而引起的樣l小差異，插入?yún)^(qū)當(dāng)雜交到同種植物中時將會保持與轉(zhuǎn)化植物中包含外源DNA的上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列有至少85%的序列同一性，優(yōu)選是90%，更優(yōu)選是95%,最優(yōu)選是100%序列同一性。事件的定義是(人工)基因座，由于基因工程方法，其攜帶了包含至少一個拷貝的目的基因的轉(zhuǎn)基因。事件的典型的等位狀態(tài)是外源DNA的存在或不存在。事件在表型上的特征是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在基因水平上，事件是植物的基因組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制圖譜(比如可以通過Southern印跡法確定)，轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)，以及轉(zhuǎn)基因的分子標(biāo)記的位置和/或分子結(jié)構(gòu)。通常，用包含至少一個目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物可以得到一個轉(zhuǎn)化體群體，其包含大量獨(dú)立的事件，其中每個都是獨(dú)特的。本文使用的優(yōu)良事件，是選自一組事件的事件。該事件的獲得是基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性以及與包含優(yōu)良事件的植物的最優(yōu)農(nóng)學(xué)性狀的相容性，用相同的轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化或用轉(zhuǎn)化得到的植物進(jìn)行回交。因此，優(yōu)良事件選擇標(biāo)準(zhǔn)為一個或多個，優(yōu)選地兩個或多個，優(yōu)選地所有下列標(biāo)準(zhǔn)a)外源DNA的存在不損害植物的其它期望的特征，例如那些與農(nóng)學(xué)性能或商業(yè)價值相關(guān)的特征；b)事件的特征在于穩(wěn)定遺傳的明確的分子結(jié)構(gòu)，并可為其開發(fā)出合適的鑒定對照的工具；c)在事件的雜合的(或半合子的)和純合的條件下，并在環(huán)境條件范圍內(nèi)的商業(yè)可接受的水平上(其中攜帶該事件的植物可能用在正常的農(nóng)業(yè)環(huán)境中)，目的基因顯示出正確的，適當(dāng)?shù)暮头€(wěn)定的時空表型表達(dá)。外源DNA優(yōu)選與植物基因組中的一個位置相關(guān)，這可允許其輕易地漸滲入到期望的商業(yè)性遺傳背景中。作為優(yōu)良事件的事件狀態(tài)，通過將優(yōu)良事件漸滲入到不同的相關(guān)遺傳環(huán)境中并觀察其與上述標(biāo)準(zhǔn)(例如a，b,c)中的一個，兩個或所有的符合來進(jìn)4于確認(rèn)。因此，"優(yōu)良事件"指的是一個包含外源DNA的基因座，其符合上述標(biāo)準(zhǔn)。植物，植物材料或其子代(例如種子)在其基因組中含有一個或多個優(yōu)良事件。開發(fā)出來用于鑒定優(yōu)良事件，或包含優(yōu)良事件的植物，植物材料，或由包含優(yōu)良事件的植物材料生產(chǎn)的產(chǎn)品的工具，是基于優(yōu)良事件的特定基因組特征，例如包含外源DNA的基因組區(qū)、分子標(biāo)記或外源DNA的側(cè)翼區(qū)序列特定的限制性圖譜。一旦外源DNA的一個或兩個側(cè)翼區(qū)已經(jīng)測序，借助分子生物學(xué)技術(shù)，可以設(shè)計(jì)出特異識別樣品的核酸(DNA或RNA)中的這個(些)序列的引物和探針。例如，可開發(fā)PCR方法鑒定生物樣品(例如植物，植物材料，或包含植物材料的產(chǎn)品)中的優(yōu)良事件。這種PCR方法是基于至少兩個特異"引物"，一個識別優(yōu)良事件的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地，引物具有一個15-35個核苷酸的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下，分別可以"特異識別"優(yōu)良事件的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列和該優(yōu)良事件的外源DNA,從而可以從包含該優(yōu)良事件的核酸樣品中擴(kuò)增出特異片段("整合片段"或鑒別擴(kuò)增子)。這意味著，在優(yōu)化PCR條件下，只可以擴(kuò)增出靶向整合片段，而不會擴(kuò)增出植物基因組內(nèi)的其它序列或外源DNA。適于本發(fā)明的PCR引物可以是下面的畫具有17iit至大約100nt長度的寡核苷酸，在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自5'側(cè)翼序列(SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列，或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列)(識別5，側(cè)翼序列的引物)；或-具有17nt至大約200nt長度的寡核苷酸，在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自3，側(cè)翼區(qū)(SEQIDNo2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別3，側(cè)翼序列的引物)；-具有17nt至大約200nt長度的寡核苷酸，在其3'末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸的核苷酸序列，選自插入DNA序列(SEQIDNo1的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別外源DNA的引物)；-具有17nt至大約40nt長度的寡核苷酸，包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸的核苷酸序列，選自插入DNA序列(SEQIDNo2的1-40位核苷酸的核苷酸序列)。引物當(dāng)然可以比提到的17個連續(xù)核苷酸更長，例如，可以是20，21，30，35，50，75，100，150，200nt的長度或更長。引物可以完全由選自提到的側(cè)翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列所組成。但是，引物的核苷酸序列在5，末端(即位于3，端的17個連續(xù)核苷酸之外)是不太關(guān)鍵的。所以，引物的5，序列可以由選自側(cè)翼序列或外源DNA的核苷酸序列所組成，但是還可以適當(dāng)?shù)匕恍?例如1，2，5，10個)錯配。引物的5，序列甚至可以完全由與側(cè)翼序列或外源DNA無關(guān)的核苷酸序列所組成，例如，代表限制性酶識別位點(diǎn)的核苷酸序列。優(yōu)選地，這種具有錯配的不相關(guān)序列或側(cè)翼DNA序列應(yīng)該優(yōu)選不長于IOO個核苷酸，更優(yōu)選地，不長于50或甚至25個核苷酸。此外，如果所述的3'末端的17個連續(xù)核苷酸不只是源自外源DNA或SEQIDNol或2中的植物衍生序列，則合適的引物在其3，末端可以包含No1的98-99位核苷酸和SEQIDNo2的40-41位核苷酸)的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。對于熟練的技術(shù)人員來說，立刻就可以明白的是，適當(dāng)選擇的PCR引物對不應(yīng)該包含互相互補(bǔ)的序列。出于本發(fā)明的目的，"SEQIDNo:X代表的核苷酸序列的互補(bǔ)序列"是18這樣的核苷酸序列，其是根據(jù)Chargaffs規(guī)則將核苷酸用互補(bǔ)核苷酸替換(A^T;G^C)而從所代表的核苷酸序列得到的核苷酸序列，并沿著5，-3，的方向閱讀，即所代表的核苷酸序列的反方向。合適的引物的例子有SEQIDNo7或SEQIDNo17的寡核苷紗列(識別5'側(cè)翼序列的引物)，SEQIDNo8，SEQIDNo18或SEQIDNo19的寡核苷^列(識別外源DNA的引物，與識別5，側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQIDNo3的寡核苷酸序列(識別外源DNA的引物，與識別3，側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQIDNo4，SEQIDNo5，SEQIDNo6的寡核苦斷列(識別3'側(cè)翼序列的引物)，以及SEQIDNo10和11的寡核苷酸序列(識別EE-GH5中的特定外源DNA重排的引物)。合適的寡核苷酸引物的其他例子在其3，末端包括下列序列或由這些序列組成a.識別5，側(cè)翼序列的引物-SEQIDNo1的58-77位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的85-104位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的150-166位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的150-171位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的154-171位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的87-104位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo16的189-206位核苷酸的核苷酸序列b.識別外源DNA序列的引物，與識別5，側(cè)翼序列的引物一起使用-SEQIDNo1的149-170位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的169-186位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的193-212位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的161-178位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的194-211位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的193-211位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的163-185位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的193-210位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo1的193-209位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列c.識別3'側(cè)翼序列的引物-SEQIDNo2的149-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的154-173位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的140-159位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的141-160位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的147-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的"8-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的149-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的153-172位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的154-174位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的160-177位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的232-251位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的140-160位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的141-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的147-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列隱SEQIDNo2的149-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的148-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的147-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的148-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的153-1"位核苷酸的核苷^列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的154-175位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的156-175位核香酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的232-250位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列國SEQIDNo2的140-157位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的140-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的141-162位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的148-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的149-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的147-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的148-169位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列誦SEQIDNo2的156-174位核苷酸的核苷一列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的153-174位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列誦SEQIDNo2的232-249位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的234-251位核苷酸的核苷^列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的141-163位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的148-164位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的147-169位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的153-175位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQIDNo2的156-177位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的181-198位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的181-202位核普酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的234-250位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列-SEQIDNo2的140-162位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列曙SEQIDNo2的181-203位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列d.識別外源DNA序列的引物，與識別3，側(cè)翼序列的引物一起使用-SEQIDNo2的30-49位核苷酸的核苷酸序列誦SEQIDNo2的30-48位核苷酸的核苷*列國SEQIDNo2的32-48位核苷酸的核苷紗列-SEQIDNo2的32-49位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo2的31-49位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo2的31-48位核苷酸的核苷酸序列-SEQIDNo2的30-46位核苷酸的核苷酸序列本文所用的"SEQIDNo.Z的X-Y位核苷酸的核苷酸序列"表示的是包括兩個核苷酸端點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列。優(yōu)選地，擴(kuò)增的片段具有50-500個核苷酸的長度，優(yōu)選是100-350個核苷酸的長度。特異引物可以具有分別與優(yōu)良事件的5，或3，側(cè)翼區(qū)及其外源DNA內(nèi)的序列有80-100%的同一性的序列，條件是在優(yōu)化的PCR條件下利用這些引物，錯配仍可以使優(yōu)良事件得到特異鑒定。但是，允許錯配的范圍可以容易地通過實(shí)驗(yàn)確定并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。下表列舉了運(yùn)用選擇的PCR引物對所得到的預(yù)期的DNA擴(kuò)增子(或整合片段)的大小。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>整合片段的檢測可以通過各種方式進(jìn)行，例如凝膠分析后的大小估計(jì)。整合片段也可以直接測序。其它檢測擴(kuò)增DNA片段的序列特異性方法也是本領(lǐng)域公知的。因?yàn)橐锏男蛄屑捌湓诨蚪M中的相對位置對于優(yōu)良事件而言是獨(dú)特的，所以只在包含優(yōu)良事件(的核酸)的生物樣品中才能發(fā)生整合片段的擴(kuò)增。優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)4亍PCR以鑒定未知樣品中EE-GH5的存在時，在一組引物中應(yīng)包含對照引物，用對照引物可以擴(kuò)增含有該事件的植物品種的"持家基因"內(nèi)的序列。持家基因是一些在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)并參與所有細(xì)胞共同的基本代謝活動的基因。優(yōu)選地，從持家基因擴(kuò)增得到的片段是比擴(kuò)增整合片段更大的片段。根據(jù)所分析的樣品，還可以包括其它對照。本領(lǐng)域中描述了標(biāo)準(zhǔn)PCR方案，例如"PCR應(yīng)用手冊"(RocheMolecularBiochemicals，第2版，1999)和其它參考書。PCR的優(yōu)化條件，包括特異引物的序列，在每個優(yōu)良事件的"PCR鑒定方案"中進(jìn)行了規(guī)定。但是，可以理解的是，PCR鑒定方案的許多參數(shù)可能需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行調(diào)整，并進(jìn)行些許修改以得到相似的結(jié)果。例如，采用不同制備DNA的方法可能需要調(diào)節(jié)下列參數(shù)，例如引物的用量，聚合酶，以及使用的退火條件。類似地，其他引物的選擇可能支配PCR鑒定方案的其它優(yōu)化條件。但是，這些調(diào)整對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，此夕卜，在現(xiàn)有的PCR應(yīng)用手冊(例如上面引用的之一)中對此也進(jìn)行了詳述。備選地，特異引物可以用來擴(kuò)增用作鑒定生物樣品中EE-GH5的"特異探針"的整合片段。在允許探針與核酸中其對應(yīng)的片段雜交的條件下，將生物樣品的核酸與探針接觸，導(dǎo)致形成核^/探針雜合體。雜合體的形成可以進(jìn)行檢測(例如標(biāo)記核酸或探針)，其中雜合體的形成表明存在EE-GH5。基于與特異探針進(jìn)行雜交(在固相載體上或在溶液中)的此類鑒定方法在本領(lǐng)域已有描述。優(yōu)選地，特異探針是在優(yōu)化條件下能與位于優(yōu)良事件的5'或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的區(qū)域和(優(yōu)選地)也包含與之相鄰的部分外源DNA的區(qū)域(下文中稱之為"特異區(qū)域")特異雜交的序列。優(yōu)選地，特異探針包含50-500bp、優(yōu)選100-350bp的序列，其與特定區(qū)域的核苷酸序列有至少80%,優(yōu)選為80-85%,更優(yōu)選為85-90%,特別優(yōu)選為卯-95%，最優(yōu)選為95-100%同一性(或互補(bǔ)性)。優(yōu)選地，特異探針將包含與優(yōu)良事件的特異區(qū)域相同(或互補(bǔ))的大約15-100個連續(xù)核苷酸的序列。適合于作為檢測優(yōu)良事件EE-GH5的PCR引物的寡核苷酸也可以用來開發(fā)基于PCR的方案來確定優(yōu)良事件的接合性狀態(tài)。為此，兩個識別野生型(wt)基因座的引物是這樣設(shè)計(jì)的它們互相指向并在其間有插入位點(diǎn)。這些引物可以是分別特異識別包含在SEQIDNo1或2內(nèi)的5，和3，側(cè)翼序列的引物。這些引物也可以是特異識別5，或3，側(cè)翼序列的引物(例如具有SEQIDNo7或SEQIDNo4-6的核苷^列的引物)，以及識別在預(yù)插入植物DNA內(nèi)插入EE-GH5時缺失的區(qū)域的引物。這組引物，連同互補(bǔ)于轉(zhuǎn)化DNA序列的第三個引物(例如具有SEQIDNo3的核苷酸序列的引物)一起允許診斷性PCR方法擴(kuò)增EE-GH5特異的基因座和wt基因座。如果植物的轉(zhuǎn)基因基因座或相應(yīng)的wt基因座是純合的，則診斷PCR將產(chǎn)生針對轉(zhuǎn)基因基因座或wt基因座典型的、優(yōu)選典型長度的單一PCR產(chǎn)物。如果植物對于轉(zhuǎn)基因基因座是半合子的，則將出現(xiàn)兩個基因座特異的PCR產(chǎn)物，這反映了轉(zhuǎn)基因基因座和wt基因座均得到了擴(kuò)增。此外，利用本文提供的優(yōu)良事件特異的序列信息，也可以開發(fā)不同于基于PCR的擴(kuò)增方法的特異于優(yōu)良事件EE-GH5的檢測方法。這些備選的檢測方法包括基于特殊核酸結(jié)構(gòu)的侵襲性切割的線性信號擴(kuò)增檢測法，也叫做InvaderTM技術(shù)(例如記載于美國專利5,985,557"InvasiveCleavageofNucleicAcids",和6,001,567"DetectionofNucleicAcidsequencesbyInvaderDirectedCleavage",這里將二者并入作為參考)。為此，革巴序列可以與包含SEQIDNol的99-116位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的標(biāo)記的第一寡核普酸或者包含SEQIDNo2的23-40位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交，或可以與包含SEQIDNo1的81-98位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第二寡核苷酸或者包含SEQIDNo2的41-58位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行進(jìn)一步雜交，其中，第一和第二寡核苷酸至少重疊一個核苷酸。通過雜交獲得的雙鏈體或三鏈體結(jié)構(gòu)可以用酶(Cleavase⑧)進(jìn)行選擇性探針切割，以留下完整的靶序列。切割的標(biāo)記探針隨后被檢測，并可能通過中間步驟產(chǎn)生進(jìn)一步的信號增強(qiáng)。本文使用的"試劑盒"指的是用于完成本發(fā)明的方法的一組試劑，更特別地，是用于進(jìn)行生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的鑒定或者對包含EE-GH5的植物材料的接合性狀態(tài)進(jìn)行確定的一組試劑。更特別地，本發(fā)明的試劑盒的一個優(yōu)選實(shí)施方案包括上述的用于鑒定優(yōu)良事件的至少一個或兩個特異引物，或者用于確定接合性狀態(tài)的三個特異引物。備選地，該試劑盒進(jìn)一步包括在PCR鑒定方案中提到的任何其他試劑。備選地，根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，該試劑盒可以包括上面提到的特異探針，它可以特異地與生物樣品的核酸雜交以鑒定EE-GH5的存在。備選地，該試劑盒進(jìn)一步可以包括用特異探針對生物樣品中的EE-GH5進(jìn)行鑒定所用到的任何其他試劑(例如但不僅限于雜交緩沖液，標(biāo)記物)。為了進(jìn)行質(zhì)量控制(例如種子批次的純度)、檢測植物材料或包含或源自植物材料的材料(例如但不僅限于食物產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品)中是否存在優(yōu)良事件，可使用本發(fā)明的試劑盒，并可對其成分進(jìn)行特別地調(diào)節(jié)。本文使用的有關(guān)核苷酸序列(DNA或RNA)的"序列同一性"指是用具有相同核苷酸的位置數(shù)除以兩個序列中較短的那個序列的核苷酸數(shù)目。兩個核普酸序列的比對根據(jù)Wilbur-Lipmann算法(WilburandLipmann，1983，Proc.Nat.Acad.Sci.USA80:726)進(jìn)行，該算法使用20個核苷酸的窗口大小，4個核苷酸的字長，空位罰分為4。對序列數(shù)據(jù)(包括上述的序列比對)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分析和解釋可以采用，例如GeneticsComputerGroup的序歹'J分析軟件包(GCG，UniversityofWisconsinBiotechnologycenter)方便地進(jìn)行。分析的序列被認(rèn)為"基本上相似"是基于這些序列具有至少大約75%的序列同一性，特別是至少大約80%，更特別是至少大約85%，非常特別是大約卯％，特別是大約95%，更特別是大約100%同一性。當(dāng)將RNA序列表述為與DNA序列基本上相似或具有一定的序列同一性時，DNA序列的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)，這一點(diǎn)是清楚的。本文使用的術(shù)語"引物"包含在模板依賴的方法(如PCR)中能夠引發(fā)新生核酸合成的任何核酸。典型地，引物是含有10-30個核苷酸的寡核苷酸，但也可以用更長的序列。盡管優(yōu)選使用單鏈形式的引物，但引物也可以是雙鏈的形式。探針可以用作引物，但其是被設(shè)計(jì)用來結(jié)合靶DNA或RNA,并且不必用在擴(kuò)增過程中。當(dāng)提及特異引物時本文使用的術(shù)語"識別"，是指這樣一個事實(shí)特異引物在該方法中給出的條件下(例如PCR鑒定方案的條件)與優(yōu)良事件中的核酸序列特異地雜交，其中，特異性是由陽性和陰性對照的存在來確定的。當(dāng)提及特異探針時，本文使用的術(shù)語"雜交，，是指這樣一個事實(shí)在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊性條件下，探針結(jié)合到優(yōu)良事件的核酸序列中的特異區(qū)域。本文25所述的標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊性條件是指本文所述的雜交條件，或常規(guī)的雜交條件(見Sambrooketal"1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NY)。例如，所述雜交可以包括以下步驟1)固定植物基因組DNA片段于濾紙上，2)在42。C下于50%甲酰胺，5XSSPE，2XDenhardt，s試劑和0.1%SDS中預(yù)雜交濾紙l畫2h，或在68°C下于6XSSC，2XDenhardt，s試劑和0.1%SDS中預(yù)雜交濾紙l-!2h，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)孵育16-2411,5)在室溫下于IXSSC，0.1%SDS中洗滌濾紙20min，6)在68。C下于0.2XSSC，0.1。/oSDS中洗滌濾紙三次，每次20min，7)4吏用一個增感屏在-70。C下將濾紙暴露于X-射線膠片24-48h。本文使用的"生物樣品"是植物，植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品。術(shù)語"植物"包含在任意成熟階段的陸地棉(G^Mj;/;/"附/^/^/似附)植物組織，也包含采自或源于此類植物的任何細(xì)胞，組織或器官，包括但不限于種子，葉，莖，花，根，單細(xì)胞，配子，細(xì)胞培養(yǎng)物，組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。本文使用的"植物材料"是指從植物得到的材料。包含植物材料的產(chǎn)品涉及食物，飼料，或用植物材料制造的或者可以被植物材料污染的其他產(chǎn)品?？梢岳斫獾氖?，在本發(fā)明上下文中，測試這些生物樣品中特異于EE-GH5的核酸的存在，表明樣品中存在核酸。因此，這里涉及到的鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的方法，涉及鑒定生物樣品中包含所述優(yōu)良事件的核酸。本文使用的"包含"可以解釋為明確所表述的特征，整數(shù)，步驟，試劑或成分的存在，但不排除一個或多個特征，整數(shù)，步驟，成分或其組的存在或加入。因而，舉例說，包含某核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)可以包含比實(shí)際引用的更多的核苷酸或氨基酸，即包含于更大的核酸或蛋白質(zhì)。包含功能上或結(jié)構(gòu)上確定的DNA序列的嵌合基因可以包含額外的DNA序列等。本發(fā)明還涉及將棉花中的優(yōu)良事件EE-GH5發(fā)育成包含該事件的植物，從這些植物得到的子代，植物細(xì)胞，或源自該事件的植物材料。包含優(yōu)良事件EE-GH5的植物可以按照實(shí)施例1所述得到。包含EE-GH5的棉花植物或植物材料可以按照實(shí)施例2中關(guān)于EE-GH5所述的PCR鑒定方案來確定。簡言之，存在于生物樣品中的棉花基因組DNA通過PCR擴(kuò)增，使用的引物分別是特異識別EE-GH5的5，或3'側(cè)翼序列中序列的引物(例如具有序列SEQIDNo:6的引物)，以及識別外源DNA中序列的引物(例如具有序列SEQIDNo:3的引物)。擴(kuò)增部分內(nèi)源棉花序列的DNA引物可以用作PCR擴(kuò)增的陽性對照。如果進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，材料產(chǎn)生了預(yù)期大小的片段，則該材料包含來自含有優(yōu)良事件EE-GH5的棉花植物的植物材料。含有EE-GH5的植物的特征在于其昆蟲抗性，及其草銨膦耐受性。含有EE-GH5的植物的特征還在于其農(nóng)學(xué)性狀(與美國商業(yè)上可獲得的品種在無昆蟲壓力下的農(nóng)學(xué)性狀相當(dāng))。已經(jīng)觀察到，本文所述的在棉花植物基因組的插入?yún)^(qū)域中外源DNA的存在可以賦予包含該事件的植物尤其感興趣的表型和分子特征。下面的實(shí)施例描述了優(yōu)良事件EE-GH5的鑒定以及在生物樣品中對優(yōu)良事件EE-GH5進(jìn)行特異鑒定的工具的開發(fā)。除非在實(shí)施例中另有說明，所有重組技術(shù)都是依照記載于"SambrookJandRussellDW(eds.)(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork"和"AusubelFA，BrentR，KingstonRE，MooreDD,SeidmanJG，SmithJAandStmhlK(eds.)(2006)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons,NewYork"的標(biāo)準(zhǔn)程序完成的。標(biāo)準(zhǔn)材料和參考文獻(xiàn)記載于"CroyRDD(ed.)(1993)PlantMolecularBiologyLabFax，BIOSScientificPublishersLtd.,OxfordandBlackwellScientificPublications,Oxford，，和"BrownTA，(1998)MolecularBiologyLabFax，2ndEdition,AcademicPress,SanDiego"。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法見"McPhersonMJandM0llerSG(2000)PCR(TheBasics),BIOSScientificPublishersLtd.,Oxford"和"PCRApplicationsManual,3rdEdition(2006)，RocheDiagnosticsGmbH,Mannheimorwww.roche-applied-science.com，，。在詳述和實(shí)施例中，參考下列序列包含EE-GH5的5'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列包含EE-GH5的3'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列引物GHI057引物MAE115引物HVH022引物GHI065引物HVH024引物DPA312引物GHI066引物GHI047引物GHI048利用引物GHI047和GHI048從包含EE-GH5的棉花DNA中擴(kuò)增到的片段的核苷酸序列用于擴(kuò)增對照片段的引物l用于擴(kuò)增對照片段的引物2EE-GH5插入之前植物基因組靶序列的核苷^歹'J包含EE-GH5的5，側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列(長)引物HVH036引物SHA028引物MAE067SEQIDNo.1:SEQIDNo.2:SEQIDNo.3:SEQIDNo.4:SEQIDNo.5:SEQIDNo.6:SEQIDNo.7:SEQIDNo.8:SEOIDNo.9:SEQIDNo.10SEQIDNo.11SEQIDNo.12SEQIDNoSEQIDNoSEQIDNo131415SEQIDNoSEQIDNoSEQIDNoSEQIDNo16171819實(shí)施例..優(yōu)良事件EE-GH5的鑒定用包含處于地下三葉草矮化病毒S7啟動子控制下的經(jīng)修飾crylab基因的編碼序列的載體轉(zhuǎn)化棉花得到的抗蟲棉花。優(yōu)良事件EE-GH5是通過基于抗蟲基因的良好表達(dá)和穩(wěn)定性的廣泛的選擇程序而篩選出來的，它與最佳的農(nóng)學(xué)性狀(例如植物高度、節(jié)高、棉鈴保持力、直立能力、活力、纖維長度、纖維強(qiáng)度和棉絨產(chǎn)量)之間的相容性也經(jīng)過了評價。將篩選的事件引入到了不同的商業(yè)遺傳背景，并對不同地區(qū)的田間試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了比較。通過不同的處理方式，用害蟲攻擊植物。植物表現(xiàn)出良好的昆蟲控制力。另外，所述事件具有正常的葉，花和棉鈴形態(tài)，優(yōu)秀的繁殖力，而且在多種遺傳背景中沒有表現(xiàn)出疾病或異常的昆蟲易感性。在漸滲入到多種遺傳背景的過程中，沒有發(fā)現(xiàn)異常問題或異常狀況。2.優(yōu)良事件EE-GH5的側(cè)翼區(qū)域的鑒定利用Liu等介紹的熱不對稱交錯(TAIL-)PCR方法(1995，PlantJ.8(3):457-463)對位于優(yōu)良事件EE-GH5中的外源DNA兩側(cè)的區(qū)域序列進(jìn)行了測定。該方法在連續(xù)的反應(yīng)中使用三種嵌套引物和一種較短的任意簡并引物，從而特異和非特異產(chǎn)物的相對擴(kuò)增效率可以進(jìn)行熱控制。特異引物被選擇出來用于在外源DNA的邊界發(fā)生退火反應(yīng)并基于其退火條件。少量(5pl)未純化的二級和三級PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。對三級PCR產(chǎn)物進(jìn)4于純化并測序。2.1右(5，)側(cè)翼區(qū)域鑒定為包含5，側(cè)翼區(qū)的片段進(jìn)行了測序(SEQIDNo.1)。核苷酸1-98的序列對應(yīng)于植物DNA,而核苷酸99-334的序列對應(yīng)于外源DNA。對一個包含5，側(cè)翼區(qū)的更長的片段也進(jìn)行了測序(SEQIDNo.16)。核苷酸1-563之間的序列對應(yīng)于植物DNA，而564-799之間的序列對應(yīng)于外源DNA。2.2左(3，)側(cè)翼區(qū)對通過TAIL-PCR方法得到的鑒定為包含3，側(cè)翼區(qū)的片段進(jìn)行了測序(SEQIDNo.2)。核苷酸l-40之間的序列對應(yīng)于外源DNA,而核苷酸41-452之間的序列對應(yīng)于植物DNA。2.3包含外源DNA中EE-GH5特異性重排的區(qū)域?qū)Π庠碊NA內(nèi)EE-GH5特定重排的區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行了鑒定(SEQIDNo.12)。當(dāng)與用于得到轉(zhuǎn)化體的外源DNA進(jìn)行比較時，可以鑒定52-88位之間的區(qū)域?yàn)楸恢嘏?，其中從所述轉(zhuǎn)化體選擇優(yōu)良事件EE-GH5。3.EE-GH5的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定方案的開發(fā)3.1.引物設(shè)計(jì)特異引物，其識別優(yōu)良事件內(nèi)的序列。更特別地，開發(fā)了兩種引物，其識別外源DNA內(nèi)EE-GH5特定重排兩側(cè)的序列。所述引物跨越大約262bp的序列。下列引物^JC現(xiàn)在EE-GH5DNA的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生特別清晰和可再現(xiàn)的結(jié)果GHI047:5'畫TgC.CTC.TTg.AAC.TgT.AgC-3，(SEQIDNo.:10)GHI048:5，ACT.TgC.AgT.TgC.TgA.TgA.Tg-3，(SEQIDNo.:11)備選地，設(shè)計(jì)的引物可以識別EE-GH5的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列。然后在外源DNA的序列內(nèi)選擇第二個引物，以便引物跨越大約369個核苷酸的序列。下列引物被證實(shí)在EE-GH5DNA的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生特別清晰和可再現(xiàn)的結(jié)果GHI065:5，-ggg.CCg.gAT.AAA.ATT.AgC.CT-3，(SEQIDNo.:6)(乾序列才直物DNA)GHI057:5，-ATA.gCg.CgC.AAA.CTA.ggA畫3"(SEQIDNo.:3)(耙序列插入DNA)乾向內(nèi)源序列的引物優(yōu)選被包括在PCR混合物中。這些引物作為未知樣品和DNA陽性對照中的內(nèi)部對照。用內(nèi)源引物對得到陽性結(jié)果，表明在用于生成PCR產(chǎn)物的基因組DNA制備物中含有足夠的具有適當(dāng)質(zhì)量的DNA。選擇內(nèi)源引物以識別棉花中的持家基因。GHI001:5，-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3"(SEQIDNo.:13)GHI002:5，-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg曙3,(SEQIDNo.:14)3.2擴(kuò)增的片段PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段為對于引物對GHI001-GHI002:445bp(內(nèi)源對照)對于引物對GHI047-GHI048:262bp(EE-GH5優(yōu)良事件)對于引物對GHI057-GHI065:369bp(EE-GH5優(yōu)良事件)3.3模板DNA根據(jù)Edwards等(NucleicAcidResearch,19，p1349，1991)，由葉打孔法制備模板DNA。當(dāng)使用由其他方法制備的DNA時，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行使用不同量的模板的測試。通常50ng的基因組模板DNA可以得到最好的結(jié)果。3.4指定的陽性和陰性對照為了避免假陽性或陰性，應(yīng)當(dāng)將下列陽性和陰性對照包括在PCR程序中-主混合物對照(DNA陰性對照)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，其中不加入任何DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無PCR產(chǎn)物時，這表明PCR反應(yīng)混合物沒有被輩巴DNA污染。-DNA陽性對照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。該陽性對照的成功擴(kuò)增表明PCR反應(yīng)是在允許耙序列擴(kuò)增的條件下進(jìn)行的。-野生型DNA對照。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，提供的模板DNA是由非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增但有內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增時，這表明在基因組DNA樣品中，沒有可檢測到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。3.5PCR條件在下列條件下得到最佳的結(jié)果-用于25^1反應(yīng)物的PCR混合物含有2.5|il模板DNA2.5pi10x擴(kuò)增緩沖液(由Taq聚合酶的生產(chǎn)商提供)0.5|il10mMdNTPs0.4piGHI001(10pmoles/|il)310.4piGHI002(10pmoles/|J)0.7piGHI047(10pmoles/ial)或GHI057(PCR程序2)0.7(ilGHI048(lOpmoles/jLil)或GHI065(PCR程序2)0.1piTaqDNA聚合酶(5單位/|111)加水至25|il-用得到最佳結(jié)杲而遵循的熱循環(huán)程序是95。C下4min.接著95。C下lmin.57。C下1min72。C下2min5個循環(huán)接著-.92。C下30sec57。C下30sec72。C下1min25個循環(huán)接著720C下10min3.6瓊脂糖凝膠分析為了能最好地觀察PCR結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將10-20nl的PCR樣品點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)上，并使用適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)記(例如100bp序列梯PHARMACIA)。3.7結(jié)果的驗(yàn)證經(jīng)過單一的PCR程序和單一的PCR混合物從轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品得到的數(shù)據(jù)不應(yīng)該4皮接受，除非1)DNA陽性對照表現(xiàn)出預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源片段)；2)DNA陰性對照的PCR擴(kuò)增是陰性的(無片段)；3)野生型DNA對照表現(xiàn)出預(yù)期的結(jié)果(內(nèi)源片段擴(kuò)增)。當(dāng)按照上述EE-GH5的PCR鑒定方案時，泳道顯示可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物，表明用于制備基因組模板DNA的對應(yīng)植物遺傳了EE-GH5優(yōu)良事件。泳道沒有顯示可見量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物而顯示可見量的內(nèi)源PCR產(chǎn)物，表明用于制備基因組模板DNA的對應(yīng)植物不包含優(yōu)良事件。泳道顯示均不存在可見量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的，表明基因組DNA的質(zhì)量和/或數(shù)量不允許產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。這些植物不能被評分。基因組DNA的制備應(yīng)當(dāng)重復(fù)，并利用適當(dāng)對照進(jìn)行新的PCR程序。3.8使用鑒別PCR方案鑒定EE-GH5在試圖篩選未知物前，必須進(jìn)行利用所有適當(dāng)對照的測試程序。開發(fā)方案可能需要為實(shí)驗(yàn)室間不同的組分(模板DNA制備物，TaqDNA聚合酶，引物質(zhì)量，dNTPs,熱循環(huán)儀等)進(jìn)行優(yōu)化。內(nèi)源序列的擴(kuò)增在方案中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)人員必須確定PCR和熱循環(huán)的條件。運(yùn)用這些條件，可以對已知轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因序列進(jìn)行等摩爾量的擴(kuò)增。只要靶內(nèi)源片段未被擴(kuò)增，或靶序列未能擴(kuò)增到相同的溴化乙錠染色強(qiáng)度(如根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判斷)，則PCR條件就需要優(yōu)化。根據(jù)上述方案，測試了來源于許多棉花植物的葉材料，其中一些含有EE-GH5。來源于優(yōu)良事件EE-GH5和棉花野生型的樣品分別用作陽性和陰性對照。圖2顯示的是對許多棉花植物樣品按照EE-GH5的優(yōu)良事件PCR鑒定方案l得到的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)泳道2和3的樣品含有305bp的條帶，證實(shí)其包含優(yōu)良事件；而泳道4至10的樣品不包含EE-GH5。泳道4和10包含其它棉花優(yōu)良事件(包括包含不同抗蟲嵌合基因的植物)。泳道11代表陰性對照樣(水)品，泳道l和12代表分子量標(biāo)記(100bp序列梯)。4.使用特異整合片段作為檢測含有EE-GH5的材料的探針利用特異引物GHI047(SEQIDNo.IO)和GHI048(SEQIDNo.ll)通過PCR擴(kuò)增，或通過化學(xué)合成，得到EE-GH5的特異整合片段，并對其進(jìn)行標(biāo)記。該整合片段用作檢測生物樣品中EE-GH5的特異探針。按照標(biāo)準(zhǔn)程序從樣品中提取核酸。然后在經(jīng)優(yōu)化以允許形成雜交體的雜交條件下，將核酸與特異探針接觸。然后檢測雜交體的形成，以表明在樣品中存在EE-GH5核酸。任選地，在與特異探針接觸之前，先利用特異引物擴(kuò)增樣品中的核酸。備選地，在與特異探針(而非整合片段)接觸之前，標(biāo)記核酸。任選地，在接觸樣品之前，將特異探針附著于固體載體(例如但不僅限于濾紙，測試條或珠子)。5.基于PCR的用于確定EE-GH5棉花植物材料的接合性狀態(tài)的方案5.1引物在插入優(yōu)良事件前識別野生型基因座的核苷酸序列的兩個引物是這樣設(shè)計(jì)的它們互相指向并在其間有插入位點(diǎn)。這組引物，與互補(bǔ)于外源DNA序列并針對側(cè)翼DNA的第三個引物一起，進(jìn)行EE-GH5基因座和wt基因座的PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)下列引物在對EE-GH5DNA進(jìn)行接合性評分PCR反應(yīng)中得到特別清晰和可再現(xiàn)的結(jié)果GHI0665，-AgA.TAA.AAT.CgT.CAg.TgC.Tg-3，(SEQIDNo.:9)(靶序列5'側(cè)翼序列上游的植物DNA)GHI0575，-ATA.gCg.CgC.AAA.CTA.ggA3，(SEQIDNo.:3)(耙序列插入DNA)GHI0655，-ggg.CCg.gAT,AAA.ATT.AgC.CT國3，(SEQIDNo.:6)(靶序列3'側(cè)翼序列的植物DNA)5.2擴(kuò)增片段PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段是對于引物對GHI065-GHI066:517bp(wt基因座)對于引物對GHI057-GHI065:369bp(EE-GH5基因座)5.3模板DNA根據(jù)Edwards"a/.(NucleicAcidResearch,19，pl349,1991),模板DNA由葉打孔法制備。當(dāng)使用由其他方法制備的DNA時，應(yīng)當(dāng)使用不同量的才莫板進(jìn)行測試程序。通常50ng的基因組才莫板DNA可以產(chǎn)生最好的結(jié)果。5.4指定的陽性和陰性對照為了避免假陽性或陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將下列陽性和陰性對照包括在PCR程序中-主混合物對照(DNA陰性對照)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，其中不加入任何DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無PCR產(chǎn)物時，這表明PCR混合物沒有被靶DNA污染。-DNA陽性對照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。該陽性對照的成功擴(kuò)增表明PCR是在允許靶序列擴(kuò)增的條件下進(jìn)行的。-野生型DNA對照。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，提供的模板DNA是由非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增但有內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增時，這表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。5.5PCR條件最佳的結(jié)果是在下列條件下得到的-用于25|nl反應(yīng)物的PCR混合物含有xnl模板DNA(150ng)2.Spll0x擴(kuò)增緩沖液(由生產(chǎn)商隨Taq聚合酶一起提供)0.5|ul10mMdNTPs1.5piGHI053(10pmoles/|Lil)1.0nlGHI054(10pmoles/)il)0.5|LilGHI041(10pmoles/|al)0.1piTaqDNA聚合酶(5單位/|111)加水至25|il-為達(dá)到最佳結(jié)果遵循的熱循環(huán)程序是95。C下4min.接著95。C下lmin.57。C下1min72。C下2min5個循環(huán)接著92。C下30sec57。C下30sec72。C下1min25個循環(huán)接著72。C下10min5.6瓊脂糖凝膠分析為了能最好地觀察PCR結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將10-20pi的PCR樣品點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)上，并使用適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)記(例如100bp序列梯PHARMACIA)。5.7結(jié)果的驗(yàn)證經(jīng)單一的PCR程序和單一的PCR主混合物從轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品中得到的數(shù)據(jù)不應(yīng)該被接受，除非-陽性對照表現(xiàn)出預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因耙序列擴(kuò)增)-野生型陽性DNA對照表現(xiàn)出預(yù)期的結(jié)果(野生型耙序列擴(kuò)增)-陰性對照的PCR擴(kuò)增是陰性的(無片段)。存在可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物而不存在可見量的野生型PCR產(chǎn)物的泳道表明對應(yīng)的用于制備基因組DNA模板的植物對于轉(zhuǎn)基因基因盒是純合的。存在可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和野生型PCR產(chǎn)物的泳道表明對應(yīng)的用于制備基因組模板DNA的植物對于轉(zhuǎn)基因基因盒是半合子的。存在可見量的野生型PCR產(chǎn)物而不存在可見量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的泳道表明對應(yīng)的用于制備基因組模板DNA的植物沒有遺傳待檢測的轉(zhuǎn)基因序列，并且對于野生型基因座是純合的。均不存在可見量的轉(zhuǎn)基因和野生型PCR產(chǎn)物的泳道表明基因組DNA的質(zhì)量和/或數(shù)量不允許生成PCR產(chǎn)物。這些植物不能被評分。基因組DNA的制備應(yīng)當(dāng)重復(fù)，必須利用適當(dāng)對照進(jìn)行新的PCR程序。5.8使用接合性評分方案對包含EE-GH5的植物中的接合性狀態(tài)進(jìn)行鑒定圖3顯示的是對許多棉花植物樣品進(jìn)行EE-GH5的接合性評分PCR所得到的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)泳道2-3和6-7的樣品包含優(yōu)良事件EE-GH5特征性的PCR片段(369bp)，而泳道2，3和5的樣品包含wt基因座存在的特征性片段。所以，泳道6和7包含純合形式的EE-GH5，泳道2和3包含半合子形式的EE-GH5，泳道5包含純合形式的wt基因座(即對于EE-GH5不成對)。泳道8代表陰性對照(水)樣品，泳道1和9代表分子量標(biāo)記(100bp序列梯)。6.EE-GH5向優(yōu)選栽培種中的漸滲通過反復(fù)回交，優(yōu)良事件EE-GH5被引入到商業(yè)的棉花栽培種，例如4旦不僅限于FM5013,FM5015,FM5017,FM989,FM832,FM966和FM958,FM989,FM958,FM832,FM991,FM819,FM800,FM960,FM966，F(xiàn)M981,FM5035,FM5044,FM5045,FM5013,FM5015,FM5017或FM5024。觀察的結(jié)果是，優(yōu)良事件基因漸滲到這些栽培種沒有明顯影響它們的任何期望的表型或農(nóng)學(xué)特征(沒有連鎖拖曳)，而轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(通過草銨膦耐受確定)達(dá)到了商業(yè)上可接受的水平。這證實(shí)了事件EE-GH5作為優(yōu)良事件的狀態(tài)。優(yōu)良品系可以有利地與市場上可得到的其他優(yōu)良事件聯(lián)合，特別是為了抗蟲管理目的的其他優(yōu)良事件抗蟲基因，例如但不僅限于事件3006-210-23(USDAaphispetition03-036誦02p);事件281-24-236(USDAaphispetition03畫036-01p);事件MON158985(USDAaphispetition00-342-Olp);事件MON531(USDAaphispetition94誦308曙01p)，或事件COT102(=Syngentavip3A，USDAaphispetition03-155-01p)。優(yōu)良事件EE-GH5也可以聯(lián)合耐受除草劑的優(yōu)良事件，例如，事件MON1445(USDAaphispetition95畫045-01p),或事件MON88913(USDAaphispetittion04-086-01p)。除非另外進(jìn)行了明確的說明，用在下文權(quán)利要求中的術(shù)語"植物"意在包含處于任意成熟階段的植物組織，以及取自或源自任何這類植物的任何細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。包含優(yōu)良事件EE-GH5的參考種子于2007年1月22日以名稱EE-GH5保藏在ATCC(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209)，ATCC保藏號PTA-8171。EE-GH5的備用名稱是T304-40。除非另外進(jìn)行了明確的說明，用在下文權(quán)利要求中的術(shù)語"植物"意在包含處于任意成熟階段的植物組織，以及取自或源自任何這類植物的任何細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。本發(fā)明的上述說明旨在進(jìn)行說明而非限制。所描述的實(shí)施方案的各種改變或修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的。在不偏離本發(fā)明主旨或范圍的前提下，可以做出這些改變或修改。權(quán)利要求1.轉(zhuǎn)基因棉花植物、或其細(xì)胞、部分、種子或子代，每個均在其基因組中包含優(yōu)良事件EE-GH5，包含所述事件的參考種子以保藏號PTA-8171保藏在ATCC。2.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因棉花植物、種子、細(xì)胞、部分或子代，其基因組DNA，當(dāng)用EE-GH5的優(yōu)良事件鑒定方案與分別包含SEQIDNo10和SEQIDNo11的核苷酸序列的兩種引物分析時，產(chǎn)生大約262bp的DNA片段，或者，當(dāng)用EE-GH5的優(yōu)良事件鑒定方案與分別包含SEQIDNo3和SEQIDNo6的核苷酸序列的兩種引物分析時，產(chǎn)生大約369bp的DNA片段。3.以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的包含優(yōu)良事件EE-GH5的種子，或其衍生物。4.從權(quán)利要求3的種子得到的棉花植物或其部分、或其種子。5.棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織，每個均在其基因組中包含優(yōu)良事件EE-GH5，所述棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織由以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的棉花植物繁殖和/或育種得到。6.包含優(yōu)良事件EE-GH5的棉花種子，包含所述事件的參考種子已經(jīng)以保藏號PTA-8171保藏在ATCC。7.從權(quán)利要求6的種子生產(chǎn)的包含優(yōu)良事件EE-GH5的轉(zhuǎn)基因棉花植物、細(xì)胞或組織。8.產(chǎn)生包含優(yōu)良事件EE-GH5的棉花植物或種子的方法，包括將權(quán)利要求1-7的任何一項(xiàng)的植物與另一棉花植物雜交，并種植從所述雜交得到的種子。9.包含優(yōu)良事件EE-GH5的棉花基因組DNA。10.由根據(jù)權(quán)利要求1-7的任何一項(xiàng)的棉花植物、植物細(xì)胞或種子產(chǎn)生的基因纟且DNA。11.鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法包括用特異識別EE-GH5的5，或3'側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測EE-GH5特異性區(qū)域。12.權(quán)利要求ll的方法，所述方法包括利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用至少兩種引物從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100到150bp的DNA片段，所述引物中一種識別EE-GH5的5'側(cè)翼區(qū)或EE-GH5的3'側(cè)翼區(qū)，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列；所述的3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷一列，所述引物中另一種引物識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQIDNo1的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的l-40位核苷酸的核苷酸序列。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的識別5'側(cè)翼區(qū)的引物由17-200個連續(xù)核苷酸的核普酸序列組成，所述5，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者所述識別EE-GH5的3'側(cè)翼區(qū)的引物由17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所述3，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷,列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物由17-200個連續(xù)的核苷酸組成，所述外源DNA選自SEQIDNo1的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的l-40位核普酸的核苷酸序列。14.權(quán)利要求2的方法，其中所述識別5，側(cè)翼區(qū)的引物在其3'末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述5，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者所述識別EE-GH5的3，側(cè)翼區(qū)的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述3，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷^列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物在其3'末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，所述外源DNA選自SEQIDNo1的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的1-40位核苷酸的核苷酸序列。15.權(quán)利要求4的方法，其中所述的引物分別包含SEQIDNo3和6的序列。16.權(quán)利要求5的方法，該方法包括利用EE-GH5鑒定方案擴(kuò)增大約369bp的片段。17.用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒，所述試劑盒包含一種識別EE-GH5的5'側(cè)翼區(qū)的引物，或者一種識別EE-GH5的3，側(cè)翼區(qū)的引物，以及一種識別外源DNA內(nèi)的序列的引物，所迷的5'側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1的l-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列；所述的3'側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列；所述的外源DNA具有SEQIDNo1的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的1-40位核苷酸的核苷^列。18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述的識別5'側(cè)翼區(qū)的引物由17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所述5，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo1的1-98位核普酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者所述的識別EE-GH5的3，側(cè)翼區(qū)的引物由17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所述3，側(cè)翼區(qū)選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷^列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物由17-200個連續(xù)的核苷酸組成，所述外源DNA選自SEQIDNo1的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的l-40位核苷酸的核苷酸序列。19.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述的識別5'側(cè)翼區(qū)的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者所述的識別EE-GH5的3'側(cè)翼區(qū)的引物在其3'末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷^列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，選自SEQIDNol的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQIDNo2的1-40位核苷酸的核苷酸序列。20.權(quán)利要求17的試劑盒，其包含由SEQIDNo3的序列組成的引物和由SEQIDNo6的序列組成的引物。21.適合用于EE-GH5特異檢測的引物，其序列在優(yōu)化的檢測條件下特異識別EE-GH5的5，或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，所述的5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苦酸的核普酸序列；所述的3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。22.權(quán)利要求21的引物，其中所述的引物由17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，選自SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。23.權(quán)利要求21的引物，其中所述的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自SEQIDNo1的1-98位核苷酸的核苷^列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，或者在其3'末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。24.引物，其在其3，末端包含SEQIDNo3的序列。25.引物，其在其3，末端包含SEQIDNo6的序列。26.權(quán)利要求11的方法，該方法包括將生物樣品的核酸與EE-GH5的特異探針雜交。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述特異探針的序列與包含EE-GH5的5，或3，側(cè)翼序列和與之相鄰的外源DNA序列的部分的序列有至少80%序列同一性。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述特異探針的序列與SEQIDNo1的78-119位核苷酸序列或SEQIDNo2的20-61位核普酸序列或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。29.用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒，所述試劑盒包含能夠特異雜交EE-GH5的特定區(qū)域的特異探針。30.權(quán)利要求29的試劑盒，其中所述特異探針的序列與包含EE-GH5的5，側(cè)翼序列或3，側(cè)翼序列和與之相鄰的外源DNA序列的部分的序列有至少80%序列同一性。31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述特異探針的序列與SEQIDNol的78-119位核苷酸序列或SEQIDNo2的20-61位核苷酸序列或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。32.用于鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的特異探針。33.權(quán)利要求32的探針，其與包含EE-GH5的5，側(cè)翼序列或3，側(cè)翼序列和與之相鄰的外源DNA序列的部分的序列或其互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。34.權(quán)利要求33的探針，其與SEQIDNo1的78-119位核苷酸或SEQIDNo2的20-61位核苷酸或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。35.用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH5的特異探針，其序列與SEQIDNo1的78-119位核苷酸序列或SEQIDNo2的20-61位核苷^列或所述序列的互補(bǔ)序列基本上相似。36.確認(rèn)種子純度的方法，所述方法包括用特異識別EE-GH5的5，或3'側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測種子樣品中EE-GH5特異性區(qū)域。37.篩選種子中EE-GH5的存在的方法，所述方法包括用特異識別EE-GH5的5，或3'側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測種子批次的樣品中EE-GH5特異性區(qū)域。38.確定包含優(yōu)良事件EE-GH5的植物，植物材料或種子的接合性狀態(tài)的方法，所述方法包括利用至少三種引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100-500bp的DNA片段，所述引物的兩種特異識別預(yù)插入的4直物DNA，例如EE-GH5的5，側(cè)翼區(qū)或EE-GH5的3，側(cè)翼區(qū)，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1的l-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo16的1-563位核苷酸的核苷酸序列，所述3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或所述的預(yù)插入DNA具有SEQIDNo15的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，所述引物的笫三種識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQIDNo1的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或SEQIDNo2的l-40位核苷酸的核苷酸序列。39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述的第一種引物包含SEQIDNo6的核苷酸序列，所述的第二種引物包含SEQIDNo9的序列，所述的第三種引物包含SEQIDNo3的序列。40.通過與基本上互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記核酸探針雜交來檢測生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH5的存在的方法，其中探針與靶核酸的比值通過靶核酸序列的回收而增大，所述方法包括a)將所述的靶核酸序列與包含SEQIDNo1的99-116位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第一核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQIDNo2的23-40位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述的第一核酸寡核苷酸雜交；b)將所述的靶核酸序列與包含SEQIDNo1的81-98位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第二核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQIDNo2的其中所述的第一和第二寡核苷酸至少重疊一個核苷酸，并且其中所述第一或第二寡核苷酸#>標(biāo)記為所述經(jīng)標(biāo)記的核酸探針；c)用酶僅僅切割探針:靶核酸序列雙鏈體內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的探針，所述酶引起選擇性探針切割，導(dǎo)致雙鏈體解離，留下完整的耙序列；d)通過重復(fù)步驟(a)到(c)回收靶核酸序列；e)檢測被切割的經(jīng)標(biāo)記探針，從而確定所述耙核酸序列的存在。41.分離的核酸分子，其包含與SEQIDNo1的88-109位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo2的30-50位核苷酸的核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列。42.權(quán)利要求41的分離的核酸分子，其包含與SEQIDNo1的78-119位核苷酸的核苷酸序列或SEQIDNo2的20-60位核苷酸的核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列。43.分離的核酸片段，其包含SEQIDNol2的核苷^^列。44.權(quán)利要求11的方法，其包括利用基本上分別由SEQIDNo10和11的核苷酸序列組成的引物擴(kuò)增大約262bp的DNA片段。45.試劑盒，其包含基本上分別由SEQIDNo10和11的核苷酸序列組成的兩種寡核苷酸引物。全文摘要本發(fā)明提供特定的轉(zhuǎn)基因棉花植物、植物材料和種子，其特征在于這些產(chǎn)品在棉花基因組的特定位置包含特定轉(zhuǎn)化事件。本發(fā)明也提供允許快速和明確鑒定生物樣品中的所述事件的工具。文檔編號A01H5/00GK101679996SQ200880010892公開日2010年3月24日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日發(fā)明者D·佩林克,H·范赫克,L·特落林德爾,S·莫昂,V·哈貝克斯申請人:拜爾生物科學(xué)公司