專利名稱：：Bacillusvelezensisah2菌株的純培養(yǎng)物以及用于植物致病真菌的生物防治的產(chǎn)品的制作方法BACILLUSVELEZENSISAH2菌株的純培養(yǎng)物以及用于植物致病真菌的生物防治的產(chǎn)品發(fā)明目的本發(fā)明的目的是用于植物致病真菌生物防治的產(chǎn)品，其由新的Bacillusvelezensis(RuizGarciaetal.，2005)AH2菌株的新分離物的活細胞所形成，具有高抗真菌活性，特別是抗不同的植物致病真菌，同時具有通過不同機制刺激植物生長的良好能力。該產(chǎn)品通過經(jīng)發(fā)酵肉湯得以配制，發(fā)酵肉湯通過振蕩深層培養(yǎng)獲得，其被直接用于該配制品中。該配制品在環(huán)境溫度下可維持至少6個月的高活性。本發(fā)明的另一目的是提供用于制備該配制品的BacillusvelezensisAH2菌株。
背景技術(shù)：
：為了減少農(nóng)業(yè)中大范圍使用的化學(xué)產(chǎn)品的不利影響，作為替代，發(fā)展并擴大綜合生產(chǎn)和有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程的需求和重要性早已為人所知。在這樣的背景之下，利用來自微生物的生物制品對害蟲和疾病進行生物防治以及對具有商業(yè)價值的作物進行施肥是最有前途的替代之一。更進一步地，由于可能通過可再生資源進行生產(chǎn)，這些生物制品在可持續(xù)農(nóng)業(yè)模式中扮演了重要角色(Altieri，1997)。該路線的主要優(yōu)點在于由于基于天然機制，其為環(huán)境友好型、無污染的生態(tài)學(xué)替代，其大大減少病原體獲得抗性的風(fēng)險。同時，由于其作用模式是選擇性的，其通常很少可能傷害其他有益生物體，并且在許多情況下，它們有益于生態(tài)系統(tǒng)并刺激植物生長，由此使得農(nóng)業(yè)生產(chǎn)更可持續(xù)發(fā)展，而同時對人類健康的影響最小或是沒有影響。事實上，所有害蟲和疾病在某種程度上都會受到敵對生物體的影響。在許多情況下，這些生物體代表了自然界中調(diào)節(jié)病原生物體群體的最重要因素。在引起植物疾病的生物體中最重要的一類是植物致病真菌，包括例如葡萄孢屬(Botrytis)、腐霉屬(Pythium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮孢屬(Fusarium)、疫霉屬(Phytophthora)、串珠根霉屬(Thielaviopsis)以及葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)，它們能夠在土壤中生存多年。在尋找具有商業(yè)價值的生物防治物質(zhì)時，必須考慮一系列因素，對它們同時進行研究才可以可獲得成功的結(jié)果。其中例如可以提及的是可單獨使用也可在混合接種物中使用的生物體、特定的生物活性、對抗病原體的作用機制、使用的生產(chǎn)系統(tǒng)以及配方的類型及其穩(wěn)定性(Warrior，2000)。已經(jīng)有幾種機制描述并解釋了這些病原體生物防治的現(xiàn)象，例如寄生、交叉保護、抗生、競爭和抗性誘導(dǎo)(Shoda，2000，Walshetal.,2001)由于植物和其他生物體之間在本文所建立的聯(lián)系，研究的最多的生態(tài)位之一是根際(Warrior，2000)。從1980年代就已經(jīng)開始對根際微生物作為化學(xué)殺蟲劑的可能替代物來控制大量疾病進行了研究。由于它們在土壤中的大量分布、移植到植物根系中的能力和產(chǎn)生大量有益化合物及大量病原體拮抗劑的能力，這些生物體非常適用于害蟲和疾病的生物防治(Angaiah等，1998；Hill等，1994；Maurhofer等，1991；Rodriguez,和Pfender.1997；Ross等，2000和Thomashow等，1997)。在根際的微生物群體中，已被作為生物防治由所述微生物導(dǎo)致的害蟲和微生物所致疾病的物質(zhì)進行廣泛研究的是由真菌所形成的群。它已經(jīng)被成功用于病原體真菌的防治，所述真菌包括葡萄孢屬、鐮孢屬、腐霉屬、疫霉屬、絲核菌屬、核盤菌屬(Sclerotinia)、青霉屬(Penicillium)和大殼球孢屬(Macrophomina)等(WhippsandLumsden，2001，McQuilken等，2001，JonesandWhipps，2002等)。由于它的各種代謝作用，該微生物群能夠產(chǎn)生大量各種可用于生物防治的物質(zhì)。基于這些原因，基于真菌的菌株和產(chǎn)物的數(shù)量不斷增大且更加多樣化(Cook等，1996，Whipps,1997,Fravel等，1998，EPAUSA2006.美國專利6，306，386和美國專利6，890，530等)。疾病的生物防治機制是復(fù)雜的，并且已知其可能是幾種機制的加合或協(xié)同的結(jié)果。在這當中競爭是針對營養(yǎng)和空間、產(chǎn)生防止孢子萌發(fā)(抑真菌作用)或者引起細胞死亡(抗生作用)和通過酸化土壤、防止病原體的增殖來對根際進行修飾的能力。生物防治也可能是病原體和生物防治物質(zhì)(寄生現(xiàn)象)之間直接相互作用的結(jié)果，例如通過如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶之類的水解酶，或者后者與毒性代謝物的聯(lián)合作用(Benitez等，2004)。促進植物生長的根際細菌(rizobacterias)(PGPR)在害蟲和疾病的生物防治中的用途也已經(jīng)被廣泛研究。該類物質(zhì)的主要特性除了它們的保護作用外還具有較強的移植到植物根系中的能力和較強的刺激植物生長的能力，這使得作物的健康得到了全面地改善，并由此植物對病原體的攻擊也具有更強的抗性。這類物質(zhì)已經(jīng)用于由如絲核菌屬、鐮孢屬、腐霉屬、串珠根霉屬、青霉屬、鏈格孢屬及葡萄孢屬的植物致病真菌所引起的疾病(Emmert和Handelsman，1999，Iigon等，2000,Cavaglieri等，2004以及Roberts等，2005，美國專利7，118，739等)。由于假單胞菌屬(Pseudomonas)是根際中最活躍且占優(yōu)勢的物質(zhì)之一，在過去幾年中其已經(jīng)成為許多研究的目標(Geel和Schippers，1983，deFreitas和Germida1991，delaCruz等，1992，Ligon等，2000，美國專利7，087，424)。該屬成員產(chǎn)生與植物疾病的減少和抑制緊密相關(guān)的不同抗生素。在該現(xiàn)象中其重要作用的另一因素是鐵載體的產(chǎn)生，其通過鐵供應(yīng)途徑進一步促進植物生長。該能力在假單胞菌屬成員中高度擴張。然而，該菌屬無法在其生長期內(nèi)產(chǎn)生抗性結(jié)構(gòu)，這在一定程度上限制了用該種菌屬菌株獲得的生物制品的穩(wěn)定性和有效性。由于芽孢桿菌屬(Bacillus)在這方面具有高度潛力，對它也已經(jīng)進行了廣泛研究。作為主要特點，它實際遍布于所有類型的土壤中，這賦予其高耐熱性、在液體介質(zhì)中快速生長以及形成使其長時間生存的抗性孢子。所有這些賦予該屬菌株具有作為生物防治物質(zhì)的高潛力。美國環(huán)境保護局(EPA)已經(jīng)登記了超過10個該屬不同種的菌株作為生物殺蟲劑并且特別是作為生物殺真菌劑(EPA2006)。該屬菌株對植物致病真菌生物防治相關(guān)的主要機制也包括產(chǎn)生抗生素、鐵載體、表面活性劑以及如幾丁質(zhì)酶的水解酶(Utkhede，1984，Acea等，1988，Stanghellini和Miller1996，Shoda2000,Banat等，2000，zhang等，2001，Ruiz-Garcia等，2005，美國專利7，087，424及EP1647188)。也已經(jīng)對其它細菌菌屬作為生物防治物質(zhì)進行了廣泛研究，所述細菌包括腸桿菌屬(Enterobacter)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)及鏈霉菌屬(Streptomyces)(McClure等，1998,Brewster等，1997,Sabaratnam禾口Traquair,2002,Cavaglieri等，2004等)。生物制品產(chǎn)品的物理形式也是必須考慮的非常重要的因素。所要尋求的是微生物在非活性狀態(tài)下維持存活狀態(tài)或維持代謝活性(Ferntodez，1995)。后者是農(nóng)業(yè)生物科技中最重要的問題之一，因為微生物細胞不僅要長時間保持存活而且它們還必須能在環(huán)境中生存和實現(xiàn)所要實現(xiàn)的功能。當提及產(chǎn)孢子微生物時，由于這些生物體能夠長時間存活并且一旦重新建立合適條件便能夠生長和繁殖，因此它們總體上在配制方面具有較大的彈性。細胞固定化技術(shù)提供了相對于游離細胞的一系列優(yōu)點，使得它們對實際應(yīng)用而言非常具有吸引力(Fernandez,1995,Vassileva等，1998a和1998b等)并且對環(huán)境生物技術(shù)而言是非常特殊的。固定化細胞的應(yīng)用能在不制造污染問題的情況下加強微生物的作用，由此產(chǎn)生非常有活性且新穎的產(chǎn)品(Bellota等，1994，Nlifiez，1998，F(xiàn)onseca，1998，西班牙專利ES2234417)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目標在于提供用于生物防治植物致病真菌的產(chǎn)品，其由新型Bacillusvelezensis(Ruiz-Garciaetal.，2005)AH2菌株的新分離物的活細胞形成。所述菌株分離自Murcia地區(qū)的土壤中。該分離物的主要特點在于它具有高抗真菌活性，能對抗導(dǎo)致經(jīng)濟作物疾病的不同物質(zhì)，如葡萄孢屬、腐霉屬、絲核菌屬、鏈格孢屬、鐮孢屬、疫霉屬、串珠根霉屬及葡萄座腔菌屬等。此外，它具有通過不同機制刺激植物生長的能力。所述微生物已經(jīng)保藏于西班牙普通微生物保藏中心(CECT)，保藏編號為CECT-7221。該菌株已經(jīng)由作者鑒定并且進一步請求CECT進行鑒定。CECT所作的物種鑒定通過直接PCR擴增16SrRNA基因進行，測定其部分序列(從兩個方向閱讀)并對序列進行分析，最終得到的結(jié)果是該菌為Bacillusvelezensis.用于植物致病真菌的生物防治以及刺激植物生長的產(chǎn)品由液體配制品組成，其含有培養(yǎng)物的活孢子為主要活性成分。微生物BacillusvelezensisAH2菌株CECT-7221及其突變體都是本發(fā)明的目標。它通過把分離物組合到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid)中，除去植物細胞后根據(jù)其對不同植物致病真菌的拮抗能力進行選擇，同時進一步考慮刺激植物生長能力的過程來得到(Fernandez2004)。在土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(Oxoid)中體外生物測定中確定抑制真菌生長的能力。通過這些生物檢測，基于抑制不同植物致病真菌生長的高能力而從所有被測試的分離物中選擇AH2菌株，所述真菌如葡萄孢屬、腐霉屬、絲核菌屬、鏈格孢屬、鐮孢屬、疫霉屬、串珠根霉屬和葡萄座腔菌屬。刺激植物生長的能力通過實驗室生物檢測進行證實，檢測方法參見Bashanetal.,1986,Fenandez1995和Bashan1998所述。然后通過溫室生物檢測(Villaverdeetal.2004)驗證其刺激植物生長的能力。此外，已經(jīng)證實它能溶解磷酸鹽/酯、產(chǎn)生吲哚-3-乙酸和其它促進植物生長的物質(zhì)以及鐵載體。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的存在也通過以1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長情況得以確定。所有這些活性都確證其刺激植物生長的能力。Villaverdeetal.,2004。同樣地，制備用于治療由植物致病真菌所致疾病的產(chǎn)品的方法也是本發(fā)明的目標，該方法由如下步驟構(gòu)成a)在合適的培養(yǎng)基中通過深層發(fā)酵使BacillusvelezensisAH2菌株生長并產(chǎn)生孢子。在該步驟中細胞計數(shù)值達到每毫升IO9個菌落形成單位(CFU.ML—1)的水平。b)通過往含細胞的發(fā)酵肉湯中添加其它成分來制備配制品。該產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定并在不超過30°C的溫度下保持而不顯著喪失細胞存活至少6個月。已經(jīng)證實該配制品的抗真菌和刺激植物生長的活性在超過6個月的時間里保持了其初始特性。其在溫室檢測應(yīng)用中在治療由不同植物致病真菌所致疾病以及刺激植物生長當中表現(xiàn)出有效性。其也在田間檢測中顯示出對植物致病真菌的治療特別是對灰色葡萄孢(Botrytiscinerea)的效力。本發(fā)明優(yōu)選實施方式BacillusvelezensisAH2菌株的增殖取一安瓿瓶保存的BacillusvelezensisAH2菌株分離物，接種在PDA培養(yǎng)板中并在30°C下溫育72小時對其進行激活。從該板中制備用于發(fā)酵罐的接種物，用接種環(huán)取一部分培養(yǎng)物，接種于裝在IOOOmLErlenmeyer燒瓶的IOOmL土豆葡萄糖(PD)肉湯培養(yǎng)基中并在30°C下振蕩溫育16小時。此后燒瓶中的內(nèi)容物被接種到含PD培養(yǎng)基的3LBraunBiotechBIOSTATB發(fā)酵罐中，終體積為2L。在600rpm的振蕩速度及l(fā)v.v.m(2L.mirT1)的通氣量、30°C溫度下發(fā)酵24小時。pH允許自由變動，最終值彡5.5。終濃度為2X109個細胞.mL—1，并且實現(xiàn)約80%的孢子化。指數(shù)生長期(μ)的特定生長速率為OjOtT1。在第一個14小時的培養(yǎng)中形成不同的生長階段，并且隨后的孢子化過程達24小時。發(fā)酵一結(jié)束，便取出2L的發(fā)酵肉湯，并分別加入0.5%、0.和0.2%的丙酸、山梨酸和抗壞血酸。周期性地確定該產(chǎn)品在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細胞存活率，結(jié)果確定在溫度不超過30V的情況下保存六個月后其存活率超過80%。所有的抗真菌和植物生長刺激能力的檢測都采用按照本發(fā)明的制造流程所制備的產(chǎn)品并獲得十分滿意的結(jié)果。體外拮抗檢測這些檢測在培養(yǎng)皿中進行。病原體在PDA板中于25°C下培養(yǎng)48-72小時。然后取直徑約為Icm的一部分，該部分被置于具有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中心。所述板在最后通過接種環(huán)接種BacillusvelezensisAH2菌株。然后在28°C下溫育48_72小時直至觀察到抑制現(xiàn)象。在用葡萄座腔菌進行檢測的情況下，也進一步在PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心并取上清加入到同一塊板的Icm2的孔中以確定無細胞發(fā)酵肉湯的抗真菌能力。圖1顯示對一些試驗病原體的體外拮抗作用測定。根據(jù)所能觀察到的，在每個所檢測的植物致病真菌中都存在強真菌生長抑制活性。此外，在用葡萄座腔菌進行檢測的情況下，利用培養(yǎng)物上清所進行的檢測顯示細菌具有胞外抗真菌活性，該活性在許多其它芽孢桿菌屬的菌株中都存在。植物生長刺激檢測為了鑒定刺激植物生長的能力，在試驗溫室條件下在植物容器中對黃瓜進行檢測。來自ProbelteS.A的Biopr0nPMC3產(chǎn)品由于已知具有刺激不同作物的植物生長的能力而被用作陽性對照。圖2顯示了該檢測的結(jié)果。由圖2中觀察到的結(jié)果可知，綠色部分及根部在總鮮重上有明顯的增加。雖然這些值比較低，它們與采用ΒορΓηPMC3時所獲得的值相比沒有統(tǒng)計學(xué)上95%置信的差異，但是如圖中所觀察到的，它們與對照的值是有差異的。在其它如西紅柿、萵苣等作物上進行這些檢測獲得了類似結(jié)果，這可認定從ProbelteS.A研究實驗室中分離的BacillusvelezensisAH2菌株的植物生長刺激能力。生產(chǎn)條件下的功效檢測檢測參考AFSMazarron西紅柿2006產(chǎn)品商用名AFS作物Amadeo西紅棉(Lycopersiconesc.Μ)條件生產(chǎn)溫室，局部灌水種植模式ImXO.6m種植密度約16600植物/ha土壤類型砂壤有效成分BacillusvelezensisAH2菌株，108CFU/mL產(chǎn)品的一般用途殺真菌劑配制品的類型可溶性液體應(yīng)用模式葉面噴施檢測的目標病原體灰色葡萄孢參考產(chǎn)品Karbel(注冊地R.0.P.M.F(植物保護產(chǎn)品和材料的官方注冊)，注冊號23506/14(ProbelteS.A.的25%carbendazime+25%Diethofencarb.lg/L)檢測事項序號名稱劑量活性成分1對照2AFS15(mL/L.)Bacillusvelezensis108CFU/mL3TRL5(mL/L)Trichodermaharzianum+M^^M(T.viride)108CFU/mL4AFS5(L/ha)Bacillusvelezensis108CFU/mL5KARBEL1(g/L)25%carbendazime+25%Diethofencarb重復(fù)4次進行完全隨機分組設(shè)計檢測。每次處理的基本區(qū)域大小是15m2和60m2的總面積。在檢測過程中利用葉面噴施法施用兩次，T1和T2,肉湯體積為1200L/ha。第一次施用在種植后2.5個月，第二次施用在第一次施用后17天。為了對檢測進行評價，計數(shù)了基本區(qū)域中每株植物的西紅柿總數(shù)，對帶有葡萄孢屬的西紅柿作了標記并根據(jù)病原體的攻擊強度給出數(shù)值1-4，基于此對受侵害情況作了計算。在檢測過程中進行了3項評估，初始評估Vtl和處理終結(jié)時作2次評估，V1為實施第二次處理后的7天，以及過15天后為V2。檢測結(jié)果V0評估，沒有觀察到疾病癥狀<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>DuncarTs多范圍測試<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二次評估V2(第2次處理后的15天)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>ABBOTT功效<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>DuncarTs多范圍測試<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>如所觀測到的，在兩次評估中15mL/LAFS的處理引起有效保護并好于作為對照的商用化學(xué)產(chǎn)品。在對照下，侵害一直維持而所檢測產(chǎn)品的有效性非常高。進行的統(tǒng)計分析表明所檢測的生物學(xué)產(chǎn)品和對照化學(xué)產(chǎn)品之間沒有顯著差異。結(jié)論在Mazarron(Murcia)進行的檢測中，在為防治灰色葡萄孢而進行的葉面噴灑和在將來觀察其行為中，AFS相對于未受任何處理的對照而言具有非常良好的活性?！ぴ赩1評估中，用15mL/L劑量的獲得水平為90%的功效。·在V2評估中功效高，超過70%，特別是在用AFS的情況下高于80%。·需要強調(diào)的是在用對照進行處理的情況下作物上病原體發(fā)生水平得以維持。·當實施DimcarTs多范圍測試時，基于所測定的參數(shù)分析兩次評估中的差異，可以發(fā)現(xiàn)在所研究的劑量之間不存在差異，其置信值為99%，而相對于未處理的對照而言則有差異?！ぷ魑镌谧罡邉┝肯聸]有觀察到毒性癥狀。·因此可以得出結(jié)論15mL/L劑量的AFS是防治西紅柿中灰色葡萄孢的合適配制品。權(quán)利要求BacillusvelezensisAH2菌株的純培養(yǎng)物及其突變體，其特征在于由于其能產(chǎn)生拮抗劑物質(zhì)的能力，其具有高抗真菌活性，特別是針對植物致病真菌的抗真菌活性；以及其具有良好的刺激植物生長的能力；該菌株能夠溶解磷酸鹽，產(chǎn)生吲哚-3-乙酸和鐵載體，以及能夠在作為唯一氮源的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)中生長，所述菌株已保藏于西班牙普通微生物保藏中心(CECT)，保藏號為CECT-7221。2.用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于含有BacillusvelezensisAH2菌株(CECT-7221)的活細胞。3.權(quán)利要求2所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于所述活細胞是孢子形式的。4.權(quán)利要求2或3所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于該微生物細胞通過深層發(fā)酵法獲得，其中所達到的孢子濃度高于109CFU/mL。5.權(quán)利要求2或3所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于含有濃度高于109CFU/mL的總孢子濃度。6.權(quán)利要求2-5任一項所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于除含有所述細菌細胞外，還含有具有有機物質(zhì)的培養(yǎng)物上清以及具有抗真菌活性的物質(zhì)等。7.權(quán)利要求2所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于在環(huán)境溫度下在不少于6個月的時間內(nèi)具有穩(wěn)定性。8.權(quán)利要求6所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于通過使用微生物生長抑制物質(zhì)來確保所述穩(wěn)定性。9.權(quán)利要求6-8任一項所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于所述微生物生長抑制物質(zhì)選自一種或幾種用作防腐劑的有機酸。10.權(quán)利要求2-9任一項所述的用于生物防治植物致病真菌并刺激植物生長的產(chǎn)品，其特征在于當用葉面噴灑法使用該產(chǎn)品時其具有高活性。全文摘要本發(fā)明涉及BacillusvelezensisAH2菌株的純培養(yǎng)物以及用于生物防治植物致病真菌的產(chǎn)品。本發(fā)明涉及用于生物防治植物致病真菌的新型殺真菌劑產(chǎn)品，其含有一種新的BacillusvelezensisAH2菌株分離物，該分離物保藏于西班牙普通微生物保藏中心(CECT)，保藏號為CECT-7221，其對這些類型的病原體具有高拮抗劑活性，同時其可以利用不同的機制刺激植物生長。本發(fā)明也涉及一種液體配制品，其在環(huán)境溫度下具有良好穩(wěn)定性并可有效治療由植物致病真菌所引起的疾病以及刺激植物生長。文檔編號A01N25/00GK101808525SQ200880009012公開日2010年8月18日申請日期2008年2月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月19日發(fā)明者A·I·費爾南德斯馬丁內(nèi)斯,I·布蘭卡比科,J·A·卡薩諾瓦羅加,J·A·尼古拉斯馬丁內(nèi)斯,J·馬洛洛佩斯-羅曼,M·J·比利亞韋德費爾南德斯申請人:普羅貝爾特公司