專(zhuān)利名稱(chēng)：：合歡莢果提取物及其制備方法與抗菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及合歡莢果提取物及其制備方法與抗菌劑。
背景技術(shù)：
：天然藥物來(lái)自植物、動(dòng)物、礦物，并以植物來(lái)源為主。在現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)展，特別是化合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定取得突破性進(jìn)展下，由于組合化學(xué)合成時(shí)代不適合高通量合成需要而研究一度下降的天然產(chǎn)物研究[匿KNFE，CARTERGT.Theevolvingroleofnaturalproductsindrugdiscovery[J].NatureReviewsDrugDiscovery,2005，4:206-220.]以及只追求數(shù)量而忽略質(zhì)量的有機(jī)合成時(shí)代的過(guò)去[(XARDYJ，WALSHC.Lessonsfromnaturalmolecules[J].Nature,2004，432:829-837]，再加上病原菌抗藥性的嚴(yán)重威脅，植物源殺菌劑具有不污染環(huán)境，對(duì)人畜安全，害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，使得天然產(chǎn)物又成為作為發(fā)現(xiàn)新藥物的重要來(lái)源和從植物中尋找新型的具有殺菌活性的天然化合物的研究又重新獲得普遍的關(guān)注[PATERSONI，ANDERSONEA.Therenaissanceofnaturalproductsasdrugcandidates[J].Science,2005,310:451-453;KoeknFE，CarterGT.Theevolvingroleofnaturalproductsindrugdiscovery[J],NatureReviewsDrugDiscovery,2005，4:206-220;張慧，《余大高，潘汝謙，徐漢虹一些植物提取物的抗菌活性篩選[J]植物病理學(xué)報(bào)，2008,38(4):441-444]。植物的次生代謝產(chǎn)物(secondarymetabo-lismsubstance)中的很多種成分，如生物堿、蒽醌、黃酮、皂苷、揮發(fā)油、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等是重要的藥物來(lái)源。在基礎(chǔ)科學(xué)研究中由于天然產(chǎn)物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性以及作用機(jī)理的多樣性、在應(yīng)用研究中，例如在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域由于食品的安全性及農(nóng)業(yè)無(wú)公害、綠色、有機(jī)生產(chǎn)以及農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易跨越"綠色技術(shù)壁壘"的迫切需要，使得從天然植物或其他天然物中發(fā)現(xiàn)、并研究來(lái)自天然產(chǎn)物的抗菌、抗病蟲(chóng)害藥及其提取的最佳方法，又成為當(dāng)今研究和開(kāi)發(fā)的趨勢(shì)。我國(guó)植物資源豐富，在植物中尋找抗菌、抗氧化和其他活性成分一直是資源植物化學(xué)及天然產(chǎn)物化學(xué)研究的主流[方穎，溫明章.我國(guó)資源植物化學(xué)與天然產(chǎn)物化學(xué)基礎(chǔ)研究的現(xiàn)狀與發(fā)展[J].生命科學(xué)，2005，17(3):282-285.]。合歡屬J/Z^z/"系豆科含羞草亞科植物，約100多種，廣泛分布于世界各地。我國(guó)有17種，大部分產(chǎn)于江蘇、江西、福建、浙江和西南部各省，是美化環(huán)境，凈化空氣和藥用價(jià)值的優(yōu)良樹(shù)種。其中最常見(jiàn)的有合歡J/^z/力M/^^/"Durazz.?！吨袊?guó)藥物大辭典》中指出"小葉兩列，日暮相疊如睡，及朝，又漸分離，故有合歡"。合歡皮和花為較常用的中藥，有治心神不安、憂(yōu)郁失眠作用；外用治療骨折、癰胸疬；其葉具有吸收空氣中硫氧化物的作用。對(duì)合歡皮的化學(xué)研究表明，合歡皮中含有三萜、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質(zhì)及多糖等多種化學(xué)成分[宋立人.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典.北京人民衛(wèi)生出版社，2001.876;陳四平，張如意.合歡皮中三萜皂苷元的研究.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1997，32(2):144-146;JuneiKinjo,KaoruAraki,KatsuraFukui,etal.SixnewtriterpenoidalglycosidesinducingtwonewsapogenolsfromAlbizziaecortex(V).ChemPharmBull,1992，4012:3269-3273;MakatoKaneta，HiroshiHikichi，SeiichiEndo,etal.IdentificationofflavonesinsixteenleguminosaeSpecies.AgricBiolChem，1980，44(6):1407-1410;鄒坤，趙玉璽等合歡皮的脂溶性成分[J]，北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)1999.7]，合歡花的化學(xué)成分及合歡莢果的揮發(fā)性成分亦做了研究[李作平等合歡花化學(xué)成分的研究[J]中國(guó)醫(yī)藥雜志[J]2000，25(2):103-104;呂金順，朱巧軍，王亞平等合歡莢果揮發(fā)油的化學(xué)成分研究[J]蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版)2003,39(1):59~61]。合歡皮及花雖然是重要的中藥，但用其皮或花后，會(huì)損壞樹(shù)木，破壞環(huán)境。合歡莢果一般在秋天結(jié)果后作為廢料任其自然消失，未充分利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種合歡莢果提取物及其制備方法與抗菌劑，對(duì)合歡莢果進(jìn)行提取，從中尋找藥物活性成分，并對(duì)其進(jìn)行未發(fā)現(xiàn)的藥理活性研究，達(dá)到充分利用廣泛存在的這一植物資源，以期開(kāi)發(fā)出更高效的植物源殺菌劑。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是合歡莢果提取物是以合歡莢果為原料，原料在提取溶液中浸提后通過(guò)分離溶劑萃取，萃取相蒸餾得提取物。本發(fā)明的合歡莢果提取物是按照下述方法制備的工業(yè)酒精和堿溶液混合組成提取溶劑，己粉碎的合歡莢果與提取溶液混合，加熱回流，得到的提取液用酸調(diào)節(jié)PH值至4-6，蒸餾至提取液的二分之一體積后，依次用分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分別進(jìn)行萃??；四種萃取相經(jīng)蒸餾得四種提取物。上述方法中，所述的合歡莢果為成熟的合歡J/6/zz/ayw/An'肌'wDurazz.的帶莢果實(shí)。上述方法中，所述的合歡莢果粉碎至5-18目；優(yōu)選8-10目。上述方法中，所述的堿為NaOH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-10%;優(yōu)選3-6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。上述方法中，所述的提取溶劑由1~6體積的工業(yè)酒精與13體積的堿組成；優(yōu)選工業(yè)酒精與堿的體積比為2:1。上述方法中，所述的合歡莢果與提取溶劑按合歡莢果重量lg與5-10ml提取溶劑進(jìn)行浸提；優(yōu)選合歡莢果重量lg與8mL提取溶劑進(jìn)行浸提。上述方法中，所述的熱回流溫度60-90°C，回流3次，每次回流時(shí)間為60-180min;優(yōu)選回流時(shí)間90min。上述方法中，所述的熱過(guò)濾分離得到的提取液調(diào)節(jié)PH值至4-6所用酸為鹽酸或硫酸。上述方法中，所述的分離溶劑為石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇，依次在分液漏斗中進(jìn)行。上述方法中，萃取相是在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸餾得到提取物。本發(fā)明的抗菌劑，是以合歡莢果提取物為有效活性成份；其中乙醚提取物對(duì)大腸桿菌(&c/^n'c/H'a.co//)、金黃色葡萄球菌OS鄉(xiāng)/iy/ococc肌awre—、沙門(mén)氏菌sp)、巨大芽孢桿菌(^ac/〃ws.m^gaten'wm)、枯草桿菌(5sci72w51.5^6z^'7i5)、銅鄉(xiāng)錄假單抱菌0^/附0^//"々/^/)的抑制較強(qiáng)，尤其是對(duì)巨大芽孢桿菌和枯草桿菌。本發(fā)明的有益效果是1、合歡莢果石油醚乙醚、乙酸乙酯或正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、巨大芽孢桿菌、枯草桿菌、銅綠假單孢菌具有不同的抑制作用，其中乙醚提取物對(duì)上述菌的抑菌較強(qiáng)；2、利用合歡莢果提取物制備的抗菌劑具有綠色環(huán)保、低毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，充分利用我國(guó)現(xiàn)在未開(kāi)發(fā)利用、但又分布非常廣泛的合歡莢果資源；3、與其他利用植物的根、莖、花來(lái)提取活性物比較，本發(fā)明具有不破毀植物資源，充分利用植物廢棄物的特征，符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求；4、為開(kāi)發(fā)新的抗菌劑提供了切實(shí)可行的關(guān)鍵技術(shù)，為擴(kuò)大我國(guó)植物性抗菌劑提供新的技術(shù)支持。圖1為提取時(shí)間對(duì)提取率的影響圖2為粉碎顆粒大小對(duì)提取率的影響圖3為堿與工業(yè)酒精體積比對(duì)提取率的影響圖4為合歡莢果質(zhì)量與提取溶劑體積比對(duì)提取率的影響具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本發(fā)明只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。該實(shí)施例中所用的合歡莢果為i^一月成熟的合歡J/6/zz^>//6〃'肌>7Durazz.的帶莢果實(shí)。實(shí)施例l:提取溶劑的選擇取50g粉碎至8目的合歡莢果，用體積百分比濃度為95%的工業(yè)酒精150mL，50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的NaOH溶液和工業(yè)酒精100mL組成的提取溶劑，或150mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的NaOH溶液，或150mL的水，或150mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的鹽酸溶液分別浸泡，在8(TC下熱回流3小時(shí)，趁熱過(guò)濾，重復(fù)三次，合并三次提取液。將提取得到的提取液調(diào)節(jié)PH值至4-6后旋轉(zhuǎn)蒸餾，蒸餾至原提取液的二分之一體積；在工業(yè)酒精提取液中直接加入80目的硅膠10g，攪拌均勻后繼續(xù)蒸餾至得到松散狀物，松散狀物依次用分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯在索氏提取器中分離提取，最后在燒杯中用正丁醇超聲分離提取；其余各提取液依次用分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇在分液漏斗中進(jìn)行萃取；以上各分離溶劑的萃取相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸餾得到不同提取溶劑的提取物，其提取率=(各提取物的質(zhì)量/所用合歡莢果的質(zhì)量)X100%，具體數(shù)值見(jiàn)表l。表1.用不同溶劑提取合歡莢果所得的提取率/%_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表1可見(jiàn)，堿工業(yè)酒精混合溶液做提取溶劑時(shí)，其各分離提取物和總的提取率較高。實(shí)施例2:提取時(shí)間的選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaOH溶液50mL與100mL的工業(yè)酒精混合組成提取溶劑，取20g粉碎至8目的合歡莢果5份，在提取溶劑中分別浸》包，在80。C下分別熱回流20min、60min、90min、20min、150min，趁熱過(guò)濾，重復(fù)三次，合并三次提取液。將以上堿工業(yè)酒精提取得到的提取液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4-6后減壓蒸餾，蒸餾至原提取液的二分之一體積，依次用分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇在分液漏斗中進(jìn)行萃?。桓鞣蛛x溶劑的萃取相經(jīng)蒸餾得到不同提取溶劑的提取物，按照以上計(jì)算提取率的公式計(jì)算提取率，具體數(shù)值見(jiàn)圖l。從圖1可見(jiàn)，最佳提取時(shí)間為90min。實(shí)施例3:合歡莢果粉碎顆粒大小的選擇具體操作與上述實(shí)施例2相同，固定提取時(shí)間為90min，合歡莢果顆粒大小為5目、8目、10目、18目分別進(jìn)行提取，按照以上計(jì)算提取率的公式計(jì)算提取率。結(jié)果顯示，目數(shù)越大，顆粒越小，提取率越高，但顆粒太小，后續(xù)分離越加困難。因此，最佳顆粒選8-10目。結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例4:堿工業(yè)酒精體積比的選擇具體操作與上述實(shí)施例3相同，合歡莢果粉碎顆粒大小為10目，用6y。質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH溶液與工業(yè)酒精按照l(shuí):1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6體積比組成提取溶劑分別浸提，按照以上計(jì)算提取率的公式計(jì)算提取率。結(jié)果顯示，堿與工業(yè)酒精的體積比l:1-1:3之間較好，最佳為l:2。結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)施例5:合歡莢果的質(zhì)量與提取溶劑體積比的選擇具體操作與上述實(shí)施例4相同，固定提取時(shí)間為90min,合歡莢果粉碎顆粒大小為10目，6%的NaOH溶液與工業(yè)酒精以1:2的體積比組成提取溶液，合歡莢果的用量與提取溶劑的體積比按lg:5mL、lg:6mL、lg:8mL、lg:9mL分別進(jìn)行提取，按照以上計(jì)算提取率的公式計(jì)算提取率。結(jié)果顯示，最佳合歡莢果質(zhì)量與提取溶劑體積比為lg:8ml。結(jié)果見(jiàn)圖4，應(yīng)用實(shí)施例合歡莢果提取物的抗菌活性選實(shí)施例1中"提取溶劑的選擇"所得到的合歡莢果各提取物進(jìn)行抗菌活性試驗(yàn)，其試驗(yàn)是對(duì)幾種常見(jiàn)病菌按照下述方法測(cè)定抑菌活性的準(zhǔn)確稱(chēng)取各提取物用體積比濃度70%乙醇溶液溶解成質(zhì)量體積濃度為100mg/ml溶液；同樣方法配置對(duì)照品青霉素溶液。菌懸液制備用無(wú)菌水洗滌培養(yǎng)24h的供試菌株，制成含菌濃度在106-107cfii菌懸液。菌平板制備取0.1ml上述菌懸液，在無(wú)菌條件下均勻地涂布在普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，于37'C培養(yǎng)24h。最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定取100mg/mL各提取物和青霉素溶液l.OmL采用2倍稀釋法得各梯度濃度溶液。在各培養(yǎng)皿內(nèi)分別加人1mL各梯度濃度的溶液，然后每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入19rnL已溶化的固體培養(yǎng)基，充分混勻，使其成為2500|ig/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5jig/mL、106.25(Xg/mL、53.125(ig/mL、26.56pg/mL、13.28ng/mL、6.64pg/mL、3.32pg/mL梯度濃度的溶液，待冷卻凝固后，采用影印法，用毛細(xì)管一端將測(cè)試菌株分別影印于含不同藥物濃度的每個(gè)培養(yǎng)皿上，于37。C恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀(guān)察結(jié)果，菌不生長(zhǎng)的最低濃度即為合歡莢果提取物最小抑菌濃度(MIC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2.不同提取溶劑所得的各提取物和對(duì)照物青霉素對(duì)所選菌的最低抑菌濃度(MIC)值萃取物種類(lèi)最低抑菌濃度MIC(ng/ml)24h綠膿桿菌沙門(mén)氏菌大腸桿菌S妙WS.s/co//金葡菌巨大芽孢桿菌枯草桿菌酒精乙醚堿乙醚混合提取劑乙醚水乙醚酸乙醚250012501250250025001250312.5625312.512502500312.5106.25312.512502500酒精正丁醇?jí)A正丁醇混合提取劑正丁醇水正丁醇酸正丁醇2500酒精石油醚堿石油醚混合提取劑石油醚水石油醚酸石油醚106.25酒精乙酸乙酯堿乙酸乙酯125012混合提取劑乙酸乙酯-1250——水乙酸乙酯---——酸乙酸乙酯_--_I_:_^_^_對(duì)照青霉素_^_^_:_^_^_2500注"-"表示最低抑菌濃度大于250C^g/mL;E.coliC&cten'c/w'aco/!'-)大腸桿菌，S.aureus(StopA少/ococcjiy.m^ewj-)金黃色葡萄球菌'S.sp.(i9a/7ncwe//o.Sp.-)、沙門(mén)氏菌，B.megaterium(Sac"/肌/wegaZen'ww-)巨大芽孢桿齒，S.typhi(&/wowe//<z銅綠假單孢菌=綠膿桿菌，B.subtilis(Sac/腸.raM嗣枯草桿菌結(jié)果表明，在同一提取溶劑下，所得到的不同提取物中乙醚提取物抗菌活性最強(qiáng)，尤其是對(duì)巨大芽孢桿菌、枯草桿菌兩種菌具有很好的抑制作用。結(jié)果還表明，多種提取溶劑提取物中，用堿工業(yè)酒精組成的提取溶劑所得的乙醚提取物提取率高于其他提取溶劑中的乙醚提取物。權(quán)利要求1、合歡莢果提取物，其特征在于合歡莢果提取物是以合歡莢果為原料，原料在提取溶劑中浸提后通過(guò)分離溶劑萃取，萃取相蒸餾得提取物。2、合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于工業(yè)酒精和堿溶液混合組成提取溶劑，已粉碎的合歡莢果與提取溶劑混合，加熱回流，得到的提取液用酸調(diào)節(jié)PH值至4-6，蒸餾至提取液的二分之一體積，依次用分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分別進(jìn)行萃?。惠腿∠嘟?jīng)蒸餾得到四種提取物；所述的合歡莢果為成熟的合歡J/Wzz/a^/^/肌'wDurazz.的帶莢果實(shí)；所述的合歡莢果粉碎至5-18目；所述的堿為NaOH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-10%;所述的提取溶劑由1~6體積的工業(yè)酒精與1~3體積的堿組成；所述的合歡莢果重量lg與5-10mL提取溶劑進(jìn)行浸提；所述的熱回流溫度60-8(TC，回流3次，每次回流時(shí)間為60-180min;所述的熱過(guò)濾分離得到的提取液調(diào)節(jié)pH值至4-6，所用酸為鹽酸或硫酸。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于合歡莢果粉碎至8-10目。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-6%。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于工業(yè)酒精與堿的體積比為2:1。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于合歡莢果質(zhì)量lg與8ml提取溶劑進(jìn)行浸提。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的合歡莢果提取物的制備方法，其特征在于每次熱回流時(shí)間90min。8、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的四種提取物分別是由分離溶劑石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取所得的提取物。9、抗菌劑，其特征在于該抗菌劑以合歡莢果提取物為有效活性成份。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗菌劑，其特征在于該抗菌劑以乙醚提取物為有效活性成份，抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、巨大芽孢桿菌、枯草桿菌、銅綠假單孢菌，尤其是抑制巨大芽孢桿菌或枯草桿菌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種合歡莢果提取物及其制備方法與抗菌劑，合歡莢果提取物是以合歡莢果為原料，原料在提取溶劑中浸提后通過(guò)分離溶劑萃取，萃取相蒸餾得提取物。由本發(fā)明得到的提取物配制的抗菌劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、巨大芽孢桿菌、枯草桿菌、銅綠假單孢菌具有不同的抑制作用，其中乙醚提取物對(duì)上述菌的抑菌最強(qiáng)，特別是對(duì)巨大芽孢桿菌、枯草桿菌的抑制效果高于青霉素。本發(fā)明充分利用我國(guó)現(xiàn)未開(kāi)發(fā)利用的合歡莢果資源，為開(kāi)發(fā)新的抗菌劑提供了切實(shí)可行的關(guān)鍵技術(shù)，為擴(kuò)大我國(guó)植物性抗菌劑提供新的技術(shù)支持。文檔編號(hào)A01N65/20GK101461386SQ20081024275公開(kāi)日2009年6月24日申請(qǐng)日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者呂金順,王新風(fēng)申請(qǐng)人:淮陰師范學(xué)院