專利名稱：一種紫紅色大白菜的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及十字花科蔬菜育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種紫紅色大 白菜的選育方法。
背景技術(shù)：
大白菜(5raw/cfl ra/><a L. ssp. / eh'wem7'i")原產(chǎn)于中國,是十字花 科蕓薹屬一年生、二年生的草本植物，包括結(jié)球及不結(jié)球兩大類群， 是蕓薹屬中最重要的蔬菜作物之一，至今仍是我國分布最廣、栽培面 積最大、食用人群最多的大宗蔬菜。
隨著人們生活水平的不斷提高，大白菜品質(zhì)育種曰益受到眾多育 種者的重視。近年來，國內(nèi)外相繼育成的桔紅心大白菜、黃心大白菜 倍受消費者的青睞。不同球色育種已經(jīng)成為新、奇、特大白菜新品種 選育的新方向，是品質(zhì)育種的研究內(nèi)容之一。
目前蕓薹屬蔬菜中有紫甘藍、紫菜薹、紫色芥菜等，卻未見紫色 大白菜資源。如果能將紫色轉(zhuǎn)入普通大白菜，獲得紫色大白菜新品種， 不僅可以豐富大白菜品種，而且對于大白菜品質(zhì)育種，生產(chǎn)高品質(zhì)、 高營養(yǎng)價值的新材料具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫紅色大白菜的選育方法。 本發(fā)明選擇天然紫紅色遺傳特性穩(wěn)定的芥菜材料為母本，綜合性 狀優(yōu)良的大白菜為父本，通過遠緣雜交、胚挽救和連續(xù)回交再自交， 得到紫紅色大白菜材料，該方法可以獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白
其中，所述紫紅色芥菜材料為PM058;所述大白菜是大白菜DH通過紫紅色芥菜PM058為母本與大白菜DH系遠緣雜交獲得紫紅 色F1植株，再以大白菜DH系為父本回交，結(jié)合田間鑒定選擇紫紅色 植株用大白菜DH系連續(xù)回交，獲得紫紅色的大白菜回交植株，再通 過自交獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜材料，具體包括-.
1) 選擇獲得遺傳穩(wěn)定的紫紅色芥菜材料PM058;
2) 選擇獲得綜合性狀優(yōu)良的大白菜DH系；
3) 用PM058為母本，性狀優(yōu)良的大白菜DH系為父本遠緣雜交， 通過胚挽救技術(shù)獲得F1植株；
4) 用紫紅色F1植株作母本，與上述大白菜DH系父本回交獲得 BCl禾中+ ;
5) 用BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株作母本，與上述 大白菜DH系父本繼續(xù)回交，反復(fù)通過田間選擇和連續(xù)回交獲得開花 正常、結(jié)籽正常的紫紅色BCn植株；
6) 將紫紅色BCn植株進行自交獲得種子BCnSl; 本發(fā)明的方法還包括
7) 將BCnSl經(jīng)田間鑒定并結(jié)合選擇，獲得遺傳穩(wěn)定、植株顏色 表現(xiàn)為與芥菜母本相同的紫紅色的大白菜植株。
8) 將步驟7)獲得的紫紅色的大白菜植株繼續(xù)自交擴繁獲得大量 紫紅色的大白菜種子。
其中，PM058是選擇湖南黔陽的紫色芥菜地方品種紅葉青菜(引 自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花丼研究所國家品種資源中期保存庫，引種 號II3A0138),通過優(yōu)選株連續(xù)單株自交，獲得的遺傳穩(wěn)定的紫紅
大白菜DH系是將巿場釆購的常用大白菜種子通過游離小孢子技 術(shù)培養(yǎng)，獲得的性狀穩(wěn)定的純合系。
所述游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是近年新興的培養(yǎng)技術(shù)，可參考文獻Sato et al .， 1989 ， Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis). Plant Cell Reports, 8:486-488; Hang R L , Takahata y. , 2001, Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops" Theor. Appl. Genet., 103: 254 258，具體步驟包括
i) 選取長度為2 3mm，小孢子主要處于單核靠邊期的大白菜花 蕾，用75。/o酒精浸泡30s， 7%次氯酸鈉溶液洗漆15 min， 無菌蒸餾水 沖洗3遍；
ii) 用B5提取培養(yǎng)基提取小孢子，30)im無菌微孔紗布過濾后離心 3次，每次1000r ■ mirf1， 5 min,游離的小孢子用NLN-13 (蔗糖濃度 13%)培養(yǎng)基培養(yǎng)，血球記數(shù)板調(diào)整小孢子濃度為l 2x l05mL-'， 33 °C熱激誘導(dǎo)2 4 h后，轉(zhuǎn)入2 5 °C暗培養(yǎng)直至不定胚形成；
iii) 當胚胎發(fā)育為子葉期時，轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，直至 獲得自然加倍的DH正常植株；
iv) 將組培獲得的小孢子DH植株出苗馴化，通過自交授粉獲得 種子，于田間鑒定，選擇綜合性狀優(yōu)良的DH系備用。
由于用游離小孢子技術(shù)培養(yǎng)大白菜植株的自然加倍率很高，利用 該技術(shù)可容易得到大白菜純合DH系。
所述B5提取培養(yǎng)基根據(jù)文獻Gamborg， O丄.，et al., 1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50， 151-158.中所述的B5培養(yǎng)基，添加蔗糖130.0g丄"，然后調(diào)整溶液 pH值為5.8-6.0制得。高壓滅菌(12rC， 15min)后，冷卻備用。
所述NLN - 13培養(yǎng)基根據(jù)文獻J.B.M. Custers. 2003.Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.)〃M.Maluszynski et al.(eds.),Doubled Haploid Production in Crop Plants. Published by Kluwer Academic Publishers, Printed in the Netherlands: 185-193.中所述 成份，然后調(diào)整溶液pH值為6.0， 0.22lim針式過濾器過濾滅菌制得，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 為獲得開花正常、結(jié)籽正常的的紫紅色植株，步驟5)需要反復(fù) 通過田間選擇和與大白菜DH系為父本連續(xù)回交，反復(fù)次數(shù) 一般為3-6次。
所述胚挽救技術(shù)為為母本和父本進行人工蕾期授粉，將父本新 鮮花粉涂抹于母本(已去雄蕊)花蕾柱頭，早、晚各一次，連續(xù)三天。
取授粉后7-12天，子房已隆起的角果，在超凈工作臺上用75% 酒精浸泡30s， 7。/。次氯酸鈉溶液洗滌15min，無菌蒸餾水沖洗3遍。
用B5固體培養(yǎng)基進行子房培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25'C培養(yǎng)室，光照強 度1000 - 15001x，每天光照14h。
將培養(yǎng)IO- 15天的子房在超凈工作臺上用消毒的解剖針或鑷子 剝離綠色種胚，繼續(xù)放于B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同子房培養(yǎng), 直至獲得具根、莖、葉的正常F1組培苗植株。
所述B5固體培養(yǎng)基為在原B5固體培養(yǎng)基(Gamborg， O丄.，et al.,
1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.
Exp. Cell Res. 50, 151-158.)中加入以下物質(zhì)，使其濃度為6-節(jié)氨基嘌 呤(6-BA) 1.5mg.L人a-萘乙酸(NAA ) 0,05 mg丄-',蔗糖30.0g丄-'， 瓊脂7.0g.L—1,然后調(diào)整溶液pH值為5.8-6.0，分裝于100ml三角瓶中。 高壓滅菌(12rC， 15min)后，放于試驗臺冷卻凝固備用。
根據(jù)所選擇的大白菜回交父本的遺傳型狀，通過上述選育方法， 可得到不同抱合類型舒心、直簡、疊抱、合抱等，以及不同生育期 的紫紅色大白菜材料，大大豐富了大白菜的品種，為大白菜的品質(zhì)育 種，生產(chǎn)高品質(zhì)、高營養(yǎng)價值的新材料提供了方向。


圖l為紫紅色大白菜的選育系譜圖。
圖2為父本為中白78C1的舒心紫紅色大白菜。圖3為父本為桔紅心C24的疊抱紫紅色大白菜。
圖4為父本為夏陽50C1的早熟紫紅色大白菜。 圖5為父本為中白78C16的晚熟紫紅色大白菜。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例l
選擇湖南黔陽的紫色芥菜地方品種紅葉青菜(引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院蔬菜花卉研究所國家品種資源中期保存庫，引種號II3A0138), 通過優(yōu)選株連續(xù)單株自交，自交3-5代，選擇后代無性狀分離的，莖 葉都為紫紅色的芥菜自交種子，從而獲得遺傳穩(wěn)定的純合自交系 PM058。
配制B5提取培養(yǎng)基根據(jù)文獻Gamborg, O丄.，et al., 1968， Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50， 151-158.中所述的B5培養(yǎng)基，先配制大量元素(濃縮20倍)、微量 元素(濃縮200倍)、鐵鹽(濃縮200倍)及除蔗糖之外的有機物質(zhì)(濃 縮200倍)濃縮貯備液，然后取1L容量瓶，取大量元素濃縮貯備液50ml、 微量元素、鐵鹽及上述有機物質(zhì)濃縮貯備液各5ml，添加蔗糖使其濃 度為130.0g丄人蒸餾水定容，然后，調(diào)整溶液pH值為5.8-6.0制得。 高壓滅菌(121。C， 15min)后，冷卻備用。
配制NLN-13培養(yǎng)基完全參照文獻J.B.M. Custers. 2003.Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.)〃M.Maluszynski et al.(eds.),Doubled Haploid Production in Crop Plants. Published by Kluwer Academic Publishers, Printed in the Netherlands: 185-193.中所述 NLN-13培養(yǎng)基的配制方法，然后調(diào)整溶液pH值為6.0， 0.22pm針式 過濾器過濾滅菌制得，4"C保存?zhèn)溆谩?br> 選擇大白菜品種"中白78"(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究 所北京中蔬園藝良種研究開發(fā)中心)，通過游離小孢子技術(shù)培養(yǎng)純合DH系，步驟如下
i) 選取長度為2 3mm，小孢子主要處于單核靠邊期的大白菜花 蕾,用75%酒精浸泡30 s， 7%次氯酸鈉溶液洗滌15 min, 無菌蒸餾水 沖洗3遍；
ii) 用B5提取培養(yǎng)基提取小孢子，3(Vm無菌微孔紗布過濾后離心 3次，每次IOOO r min"， 5 min, 游離的小孢子用NLN-13 (應(yīng)糖濃度 13%)培養(yǎng)基培養(yǎng)，血球記數(shù)板調(diào)整小孢子濃度為l 2x 10S.mL—1， 33 °C熱激誘導(dǎo)24 h后轉(zhuǎn)入25°C暗培養(yǎng)，直至不定胚形成；
iii) 當胚胎發(fā)育為子葉期時轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，獲得自 然加倍的DH正常植株；
iv) 將組培獲得的小孢子DH植株出苗馴化，通過自交授粉獲得 種子于田間鑒定，選擇舒心性狀的"中白78C1"和晚熟"中白78C16"， 其他性狀優(yōu)良的DH系備用。
釆用上述游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，選擇大白菜品種"北京桔紅二號" (購自北京巿農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心)和"夏陽50天"(巿購)，分 別培養(yǎng)，選擇疊抱性狀的"桔紅心C24"和早熟大白菜"夏陽50C1"， 其他性狀優(yōu)良的DH系備用。
配置B5固體培養(yǎng)基根據(jù)文獻Gamborg, O丄.，et al., 1968, Nutrient
requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res.
50, 151-158.中所述的B5培養(yǎng)基，先配制大量元素(濃縮20倍)、微量 元素(濃縮200倍)、鐵鹽(濃縮200倍)及除蔗糖之外的有機物質(zhì)(濃 縮200倍)濃縮貯備液，然后取1L容量瓶，取大量元素濃縮貯備液50ml、 微量元素、鐵鹽及上述有機物質(zhì)濃縮貯備液各5m1,此外加入以下物
質(zhì)，使其濃度為6-芐氨基嘌呤(6-BA) Umgl/1, a-萘乙酸(NAA) 0.05 mg.L-1，蔗糖30.0g.L—1，瓊脂7.0g'L"，蒸餾水定容，然后，調(diào)整 溶液pH值為5.8-6.0，分裝于100ml三角瓶中。高壓滅菌(121°C， 15min)
實施例2后，冷卻凝固備用。
將紫紅色芥菜PM058為母本，大白菜DH系中白78C1為父本遠緣 雜交，為母本和父本進行人工蕾期授粉，將父本新鮮花粉涂抹于母本 (已去雄蕊)花蕾柱頭，早、晚各一次，連續(xù)三天。
取授粉后10天，子房已隆起的角果，在超凈工作臺上用75%酒精 浸泡30 s， 7 %次氯酸鈉溶液洗滌15 min， 無菌蒸餾水沖洗3遍。
用B5固體培養(yǎng)基進行子房培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25i:培養(yǎng)室，光照強 度1000- 15001x，每天光照14h。
將培養(yǎng)15天的子房在超凈工作臺上用消毒的解剖針或鑷子剝離 綠色種胚，繼續(xù)放于B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同子房培養(yǎng)，以獲 得具根、莖、葉的正常F1組培苗植株。
以獲得的紫紅色F1植株作母本，大白菜DH系中白78Cl為父本回 交獲得(中白78C1) BC1種子；
將得到的(中白78C1)BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株 作母本，以大白菜DH系中白78C1為父本繼續(xù)回交獲得(中白78C1) BC2種子；
將得到的(中白78C1)BC2種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株 作母本，以大白菜DH系中白78C1為父本繼續(xù)回交，通過田間選擇和 連續(xù)回交獲得開花正常，結(jié)籽正常的紫紅色(中白78C1 ) BC5植株；
將得到的開花結(jié)籽正常的紫紅色(中白78C1 )BC5植株進行自交 獲得種子(中白78C1) BC5S1;
將得到的(中白78C1 ) BC5S1自交種子進行田間鑒定，選擇得到 遺傳特性穩(wěn)定、植株顏色表現(xiàn)為與芥菜母本PM058相同，而其他性狀 與大白菜DH系中白78C1接近的紫紅色大白菜植株(見圖2 )。
將鑒定得到的(中白78C1) BC5S1紫紅色大白菜植株自交擴繁， 獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜(中白78C1) BC5S1的大量種子。
實施例3以紫紅色芥菜PM058為母本，大白菜DH系桔紅心C24為父本遠緣 雜交，通過胚挽救技術(shù)獲得F1植株；
以獲得的紫紅色F1植株作母本，大白菜DH系桔紅心C24為父本回 交獲得(桔紅心C24) BC1種子；
將得到的(桔紅心C24) BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植 株作母本，以大白菜DH系桔紅心C24為父本繼續(xù)回交獲得(桔紅心 C24) BC2種子；
將得到的(桔紅心C24) BC2種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植 株作母本，以大白菜DH系桔紅心C24為父本繼續(xù)回交，通過田間選擇 和連續(xù)回交獲得開花正常，結(jié)籽正常的紫紅色(桔紅心C24) BC6植
將得到的開花結(jié)籽正常的紫紅色(桔紅心C24) BC5植株進行自 交獲得種子(桔紅心C24) BC6S1;
將得到的(桔紅心C24) BC6S1自交種子進行田間鑒定，選擇得 到遺傳特性穩(wěn)定、植株顏色表現(xiàn)為與芥菜母本PM058相同，而其他性 狀與大白菜DH系桔紅心C24接近的紫紅色大白菜植株(見圖3 )。
將鑒定得到的(桔紅心C24 ) BC6S1紫紅色大白菜植株自交擴繁， 獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜(桔紅心C24)BC6S1的大量種子。
實施例4
以紫紅色芥菜PM058為母本，大白菜DH系夏陽50C1為父本遠緣 雜交，通過胚挽救技術(shù)獲得F1植株；
以獲得的紫紅色F1植株作母本，大白菜DH系夏陽50C1為父本回 交獲得(夏陽50C1 ) BC1種子；
將得到的(夏陽50C1)BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株 作母本，以大白菜DH系夏陽50C1為父本繼續(xù)回交獲得(夏陽50C1) BC2種子；
將得到的(夏陽50C1)BC2種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株作母本，以大白菜DH系夏陽50C1為父本繼續(xù)回交，通過田間選擇和 連續(xù)回交獲得開花正常，結(jié)籽正常的紫紅色(夏陽50C1) BC5植株；
將得到的開花結(jié)籽正常的紫紅色(夏陽50C1 ) BC5植株進行自交 獲得種子(夏陽50C1 ) BC5S1;
將得到的(夏陽50C1)BC5S1自交種子進行田間鑒定，選擇得到 遺傳特性穩(wěn)定、植株顏色表現(xiàn)為與芥菜母本PM058相同，而其他性狀 與大白菜DH系夏陽50C1接近的紫紅色大白菜植株(見圖4)。
將鑒定得到的(夏陽50C1) BC5S1紫紅色大白菜植株自交擴繁， 獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜(夏陽50C1) BC5S1的大量種子。
實施例5
將紫紅色芥菜PM058為母本，大白菜DH系中白78C16為父本遠緣 雜交，為母本和父本進行人工蕾期授粉，將父本新鮮花粉涂抹于母本 (已去雄蕊)花蕾柱頭，早、晚各一次，連續(xù)三天。
取授粉后10天，取子房已隆起的角果，在超凈工作臺上用75%酒 精浸泡30s， 7y。次氯酸鈉溶液洗滌15min，無菌蒸餾水沖洗3遍。
用B5固體培養(yǎng)基進行子房培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25。C培養(yǎng)室，光照強 度IOOO- 15001x,每天光照14h。
將培養(yǎng)15天的子房在超凈工作臺上用消毒的解剖針或鑷子剝離 綠色種胚，繼續(xù)放于B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同子房培養(yǎng)，以獲 得具根、莖、葉的正常F1組培苗植株。
以獲得的紫紅色F1植株作母本，大白菜DH系中白78C16為父本回 交獲得(中白78C16) BC1種子；
將得到的(中白78C16) BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植 株作母本，以大白菜DH系中白78C16為父本繼續(xù)回交獲得(中白 78C16) BC2種子；
將得到的(中白78C16) BC2種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植 株作母本，以大白菜DH系中白78C16為父本繼續(xù)回交，通過田間選擇和連續(xù)回交獲得開花正常，結(jié)籽正常的紫紅色(中白78C16) BC5植
株；
將得到的開花結(jié)籽正常的紫紅色(中白78C16) BC5植株進行自 交獲得種子(中白78C16) BC5S1;
將得到的(中白78C16) BC5S1自交種子進行田間鑒定，選擇得 到遺傳特性穩(wěn)定、植株顏色表現(xiàn)為與芥菜母本PM058相同，而其他性 狀與大白菜DH系中白78C16接近的紫紅色大白菜植株(見圖5)。
將鑒定得到的(中白78C16)BC5S1紫紅色大白菜植株自交擴繁， 獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜(中白78C16)BC5S1的大量種子。
權(quán)利要求
1、一種紫紅色大白菜的選育方法，其特征是將紫紅色芥菜為母本，大白菜為父本遠緣雜交獲得紫紅色F1植株，再以大白菜父本回交，結(jié)合田間鑒定選擇紫紅色植株用大白菜父本連續(xù)回交，獲得紫紅色的大白菜回交植株，再通過自交獲得遺傳特性穩(wěn)定的紫紅色大白菜材料。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫紅色芥菜為 PM058。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述大白菜是大白 菜DH系。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，包括1) 選擇獲得遺傳穩(wěn)定的紫紅色芥菜材料PM058;2) 選擇獲得綜合性狀優(yōu)良的大白菜DH系；3) 用PM058為母本，性狀優(yōu)良的大白菜DH系為父本遠緣雜交， 通過胚挽救技術(shù)獲得F1植株；4) 用紫紅色F1植株作母本，與上述大白菜DH系父本回交獲得 BC1種子；5) 用BC1種子進行田間鑒定，選擇紫紅色植株作母本，與上述 大白菜DH系父本繼續(xù)回交，反復(fù)通過田間選擇和連續(xù)回交獲得開花 正常、結(jié)籽正常的紫紅色BCn植株；6) 將紫紅色BCn植株進行自交獲得種子BCnSl。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，還包括1) 將步驟5)獲得的BCnSl經(jīng)田間鑒定并結(jié)合選擇，獲得遺傳穩(wěn) 定、植株顏色表現(xiàn)為與芥菜母本相同的紫紅色的大白菜植株；2) 將上步獲得的紫紅色的大白菜植株繼續(xù)自交擴繁獲得紫紅色 的大白菜種子。
6、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟5)的回交次數(shù)為3-6次。
7、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行.
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紫紅色大白菜的選育方法。本發(fā)明以紫紅色芥菜為母本，以大白菜為父本，通過遠緣雜交獲得表現(xiàn)為紫紅色的F1代植株；以大白菜為回交父本對雜種植株進行回交；通過多代回交，選擇綜合性狀接近大白菜，植株顏色為紫紅色植株進行自交，獲得遺傳穩(wěn)定的田間表現(xiàn)為紫紅色的大白菜材料。通過上述選育方法，根據(jù)所選擇的大白菜父本的遺傳型狀，可得到不同抱合類型舒心、直筒、疊抱、合抱等，以及不同生育期的紫紅色大白菜材料，大大豐富了大白菜的品種，為大白菜的品質(zhì)育種，生產(chǎn)高品質(zhì)、高營養(yǎng)價值的新材料提供了方向。
文檔編號A01H1/04GK101416607SQ200810239409
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者孫日飛, 張淑江, 菲 李, 章時蕃 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所