專利名稱：一種大白菜初級(jí)三體系的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大白菜初級(jí)三體系的培養(yǎng)方法，屬于利用細(xì)胞遺傳學(xué)理論與育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
染色體是遺傳物質(zhì)——基因的載體。普通二倍體生物的染色體都是成對(duì)存在的，不同的生物種類有不同的染色體數(shù)目，如大白菜有10對(duì)染色體。若某對(duì)染色體多出1條額外染色體，則稱為該對(duì)染色體的初級(jí)三體。某物種的各對(duì)染色體若均具有其初級(jí)三體，則成為該物種的初級(jí)三體系。初級(jí)三體系是用以基因定位的遺傳材料，是分子遺傳學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究相結(jié)合的特殊材料，在遺傳和育種研究中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。初級(jí)三體系的選育是一項(xiàng)系統(tǒng)工程。目前，僅小麥、水稻、玉米、谷子、番茄等少數(shù)重要農(nóng)作物創(chuàng)建成初級(jí)三體系。大白菜原產(chǎn)中國(guó)，國(guó)內(nèi)外大白菜分子遺傳學(xué)研究正在展開(kāi)，目前尚沒(méi)有初級(jí)三體材料，制約了分子細(xì)胞遺傳學(xué)的深入開(kāi)展。此外，在現(xiàn)有技術(shù)中，選育初級(jí)三體的方法均采用四倍體與二倍體雜交獲得三倍體，然后用三倍體與二倍體進(jìn)行回交，再?gòu)幕亟蛔哟羞M(jìn)行篩選，該方法效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大，選育一套初級(jí)三體一般需要6-8年。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種快速培養(yǎng)大白菜初級(jí)三體系的方法，為開(kāi)展大白菜分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究和大白菜育種奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的基本原理是同源四倍體植物減數(shù)分裂不規(guī)則，除產(chǎn)生染色體數(shù)正常的2n小孢子外，還產(chǎn)生染色體數(shù)多一條的2n+1小孢子。細(xì)胞具有全能性，利用現(xiàn)代組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，2n小孢子、2n+1小孢子在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下均可獲得再生植株，從而直接獲得三體植株。
本發(fā)明的特點(diǎn)是采用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)四倍體大白菜的游離小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)獲得的小孢子植株中直接進(jìn)行初級(jí)三體的篩選和鑒定。本發(fā)明包括以下步驟(1)游離小孢子培初花期一盛花期摘取花蕾，花蕾大小以小孢子單核靠邊期為準(zhǔn)；淺層培養(yǎng)法培養(yǎng)，小孢子密度3-5萬(wàn)/ml；基本培養(yǎng)基NLN(小孢子胚胎發(fā)生培養(yǎng)基)，附加蔗糖13％-17％，6-BA(6-芐氨基嘌呤)0.2ug/L，活性炭0.01g/L；首先于33℃預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(熱激處理)后，繼續(xù)在25℃下培養(yǎng)直至形成子葉形成熟胚；(2)小孢子單株系的建立培養(yǎng)基MS(幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，附加蔗糖30g/L，瓊脂12g/L；子葉形胚接種到培養(yǎng)基上，通過(guò)腋芽增值和繼代培養(yǎng)，使每個(gè)小孢子植株成為一個(gè)小孢子株系；(3)2n+1(三體)植株的篩選常規(guī)壓片法，分別對(duì)各個(gè)小孢子株系進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，選出2n+1＝21的(三體)株系；(4)三體類別的鑒定分別對(duì)選出的各個(gè)2n+1(三體)株系進(jìn)行根尖染色體核型分析，依據(jù)染色體的大小、形態(tài)等表性特征，確定各2n+1(三體)株系的三體類別，并按染色體由長(zhǎng)到短次序進(jìn)行編號(hào)(如，1號(hào)三體、2號(hào)三體等)；(5)三體植株標(biāo)記性特征的確定以正常的二倍體為對(duì)照，在相同的栽培管理?xiàng)l件下，對(duì)生殖生長(zhǎng)階段的植株進(jìn)行詳細(xì)的觀察、測(cè)定、比較，分別找出各個(gè)不同三體的性狀特征。
具體地，本發(fā)明的培養(yǎng)方法詳述如下以同源四倍體大白菜為材料，取小孢子為單核靠邊時(shí)期的花蕾0.1％氯化汞消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次，用玻璃棒壓碎花蕾，使小孢子懸浮在B5培養(yǎng)液中，尼龍網(wǎng)過(guò)濾去除碎渣，離心洗滌3次，獲得純凈小孢子，用NLN-15培養(yǎng)基(小孢子胚胎發(fā)生培養(yǎng)基)在培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，每皿2ml，封口膜封口，置恒溫培養(yǎng)箱中熱激(33℃)培養(yǎng)24小時(shí)，然后在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)直至形成肉眼可見(jiàn)的子葉型胚，轉(zhuǎn)入MS(幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基)固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)直至形成完整植株，利用根尖壓片法進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，選出染色體數(shù)目為2n+1＝21的三體植株，對(duì)選出的三體植株進(jìn)行核型和帶型分析，確定各三體植株的三體染色體類別(如1號(hào)三體、2號(hào)三體等)，田間種植觀測(cè)，確定各三體的外部標(biāo)記性特征。
本發(fā)明取得的技術(shù)效果是利用該方法培養(yǎng)初級(jí)三體，效率高，時(shí)間短，較常規(guī)的創(chuàng)建方法相比，創(chuàng)建一套初級(jí)三體，一般可縮短2-3年。利用本發(fā)明創(chuàng)建的一套大白菜初級(jí)三體可廣泛用以大白菜的基因定位、遺傳效應(yīng)研究、染色體工程育種和分子工程育種等。


圖1是大白菜9405初級(jí)三體系的檢索表。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例 以大白菜9405初級(jí)三體系的培養(yǎng)為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
原理說(shuō)明同源四倍體大白菜9405減數(shù)分裂不規(guī)則，除產(chǎn)生染色體數(shù)正常的2n小孢子外，還產(chǎn)生染色體數(shù)多一條的2n+1小孢子。通過(guò)上述小孢子培養(yǎng)途徑獲得小孢子植株，進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，從獲得的小孢子植株選出136個(gè)2n+1的三體植株，通過(guò)核型和帶型分析，從136個(gè)2n+1的三體植株中鑒定出了一整套初級(jí)三體(1號(hào)三體、2號(hào)三體、3號(hào)三體、4號(hào)三體、5號(hào)三體、6號(hào)三體、7號(hào)三體、8號(hào)三體、9號(hào)三體、10號(hào)三體)。
具體培養(yǎng)方法同源四倍體大白菜9405為試材；于初花期至盛花期，取小孢子為單核靠邊時(shí)期的花蕾，經(jīng)0.1％氯化汞消毒10分鐘、無(wú)菌水沖洗4次；在小燒杯中用玻棒壓碎花蕾使小孢子懸浮在含蔗糖150g/L的B5培養(yǎng)液中，尼龍網(wǎng)過(guò)濾去除碎渣；濾液置離心管中，低速(1000轉(zhuǎn)/分)離心使小孢子沉于底部，棄上清夜，加入新鮮培養(yǎng)液洗滌、離心，重復(fù)3次；最后用附加蔗糖150g/L、6-BA(6-芐氨基嘌呤)0.2ug/L、活性炭0.01g/L的NLN-15培養(yǎng)基(小孢子胚胎發(fā)生培養(yǎng)基)懸浮小孢子，血球計(jì)數(shù)板測(cè)定密度，使小孢子最終密度達(dá)到30000-50000個(gè)/ml；用吸管分裝于直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，每皿2ml，封口膜封口；置恒溫培養(yǎng)箱中熱激(33℃)培養(yǎng)24小時(shí)，然后在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)直至形成子葉型胚；將子葉型胚轉(zhuǎn)入含蔗糖30g/L、瓊脂12g/L的MS固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)直至形成完整植株；根尖壓片法對(duì)培養(yǎng)出的植株進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，選出染色體數(shù)目為2n+1＝21的三體植株；對(duì)選出的2n+1＝21的三體植株進(jìn)行核型和帶型分析，根據(jù)染色體的大小、形態(tài)、著絲點(diǎn)的位置、隨體的有無(wú)等表征，確定各三體植株的三體染色體類別(如1號(hào)三體、2號(hào)三體等)；田間種植觀測(cè)，確定各個(gè)不同三體植株的外部標(biāo)記性特征。該初級(jí)三體系的核型參數(shù)和植株表征如表1和檢索表(檢索表見(jiàn)圖1)表1大白菜9405初級(jí)三體系的核型參數(shù)表

權(quán)利要求
1.一種大白菜初級(jí)三體系的培養(yǎng)方法，其特征在于對(duì)四倍體大白菜的游離小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)獲得的小孢子植株中直接進(jìn)行初級(jí)三體的篩選和鑒定，包括以下步驟(1)游離小孢子培養(yǎng)初花期—盛花期摘取花蕾，花蕾大小以小孢子單核靠邊期為準(zhǔn)；淺層培養(yǎng)法培養(yǎng)，小孢子密度3-5萬(wàn)/ml；基本培養(yǎng)基NLN(小孢子胚胎發(fā)生培養(yǎng)基)，附加蔗糖13％-17％，6-BA(6-芐氨基嘌呤)0.2ug/L，活性炭0.01g/L；首先于33℃預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(熱激處理)后，繼續(xù)在25℃下培養(yǎng)直至形成子葉形成熟胚；(2)小孢子單株系的建立培養(yǎng)基MS(幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，附加蔗糖30g/L，瓊脂12g/L；子葉形胚接種到培養(yǎng)基上，通過(guò)腋芽增值和繼代培養(yǎng)，使每個(gè)小孢子植株成為一個(gè)小孢子株系；(3)2n+1(三體)植株的篩選常規(guī)壓片法，分別對(duì)各個(gè)小孢子株系進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，選出2n+1＝21的(三體)株系；(4)三體類別的鑒定分別對(duì)選出的各個(gè)2n+1(三體)株系進(jìn)行根尖染色體核型分析，依據(jù)染色體的大小、形態(tài)等表性特征，確定各2n+1(三體)株系的三體類別，并按染色體由長(zhǎng)到短次序進(jìn)行編號(hào)；(5)三體植株標(biāo)記性特征的確定以正常的二倍體為對(duì)照，在相同的栽培管理?xiàng)l件下，對(duì)生殖生長(zhǎng)階段的植株進(jìn)行詳細(xì)的觀察、測(cè)定、比較，分別找出各個(gè)不同三體的性狀特征。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大白菜初級(jí)三體系的培養(yǎng)方法，屬于利用細(xì)胞遺傳學(xué)理論與育種技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括(1)游離小孢子培養(yǎng)；(2)小孢子單株系的建立；(3)2n+1(三體)植株的篩選；(4)三體類別的鑒定；(5)三體植株標(biāo)記性特征的確定。本發(fā)明的特點(diǎn)是采用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)四倍體大白菜的游離小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)獲得的小孢子植株中直接進(jìn)行初級(jí)三體的篩選和鑒定。利用本發(fā)明的方法創(chuàng)建初級(jí)三體，效率高，時(shí)間短，較常規(guī)的創(chuàng)建方法相比，創(chuàng)建一套初級(jí)三體，一般可縮短2－3年。利用本發(fā)明創(chuàng)建的一套大白菜初級(jí)三體可廣泛用以大白菜的基因定位、遺傳效應(yīng)研究、染色體工程育種和分子工程育種等。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1784952SQ200510112658
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者申書(shū)興, 張成合, 陳煥英, 陳雪平, 李曉峰, 王彥華 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)