專利名稱：：一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物殺蟲劑，尤其是涉及一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其為一種通過微生物發(fā)酵后提取得到的具有殺蟲活性的堿性蛋白酶和以其為主要活性物質(zhì)的高效微生物殺蟲劑。二
背景技術(shù)：
：自九十年代以來，全球化學(xué)農(nóng)藥以每年2%左右的比例下降，而生物農(nóng)藥的產(chǎn)量每年以10%_20%的速度遞增。由于長期施用化學(xué)農(nóng)藥，農(nóng)田生態(tài)平衡遭到了嚴(yán)重破壞，害蟲防治難度日益增大'。其次，農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留對(duì)人類造成了巨大威脅，并嚴(yán)重影響我國農(nóng)產(chǎn)品的出口，而生物防治剛好能克服諸多弊端。目前，全世界生物農(nóng)藥產(chǎn)品已經(jīng)超過100多種，其中生物技術(shù)產(chǎn)品有10余種。在生物農(nóng)藥中，90°%以上是微生物殺蟲劑。隨著對(duì)濫用化學(xué)農(nóng)藥危害性的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)無公害綠色食品的需求和對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，人們清楚地認(rèn)識(shí)到應(yīng)用微生物殺蟲劑不僅是單純的治蟲，而且有利于保護(hù)環(huán)境，有利用于生態(tài)平衡，有利于民族健康。微生物具有易培養(yǎng)、易進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，因此從微生物的代謝產(chǎn)物中尋找高效低毒、易被分解的殺蟲物質(zhì)成為微生物殺蟲劑研究的熱點(diǎn)。由于生物農(nóng)藥中產(chǎn)品開發(fā)方面有明顯優(yōu)勢，世界各國都爭相投資，研究和開發(fā)新型生物農(nóng)藥。在自然界，存在著許多對(duì)害蟲有致病作用的微生物，利用這種致病性來防治害蟲是一種有效的生物防治方法。我們可以從這些病原微生物中篩選出施用方便、藥效穩(wěn)定、對(duì)人畜和環(huán)境安全的菌種，進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)開發(fā)，從而制成微生物殺蟲劑。微生物殺蟲劑是生物科學(xué)與工程技術(shù)結(jié)合發(fā)展的產(chǎn)物，隨著現(xiàn)代生物工程的迅速發(fā)展，微生物殺蟲劑將有很大的開/O.、/*曰發(fā)刖景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決上述
背景技術(shù)：
中的不足之處，提供一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其低殘留、殺蟲譜廣、高效、能降解、選擇性強(qiáng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9%-16%表面活性劑10/0-2%高滲劑1%-1.5%增效劑1%-3%助劑3%-5%水68%_84%上述表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。上述堿性蛋白酶的制造方法為(1)菌種培養(yǎng)采用種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配制；(3)發(fā)酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵得發(fā)酵液；(4)粗提發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后離心，脫色，過濾和減壓干燥得粗品堿性蛋白酶；(5)精制粗品經(jīng)純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過濾層析，然后干燥濃縮得成品。上述發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基配方(w/w)為葡萄糖1.2%、蔗糖0.6%、淀粉1.2%，豆餅粉3%，酵母粉0.3%，K2HP043H200.2%;發(fā)酵時(shí)間為36h，溫度為36'C，初始ra值8.0，搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min。消泡劑為0.3%-0.6%花生油。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下本發(fā)明涉及一種活性物質(zhì)為BQ-An堿性蛋白酶的殺蟲劑，其通過枯草芽孢桿菌BQ-An為出發(fā)菌株，進(jìn)行微生物發(fā)酵，提取到具有殺蟲活性的堿性蛋白酶，經(jīng)過大量藥效試驗(yàn)證明，該活性物質(zhì)具有與環(huán)境相容、選擇性強(qiáng)、防效高、無殘留等特點(diǎn)，且殺蟲譜廣，對(duì)小齡幼蟲防治效果顯著。四圖l為本發(fā)明發(fā)酵工藝圖；圖2為本發(fā)明菌株篩選圖。五具體實(shí)施例方式本發(fā)明為一種農(nóng)藥。通過土壤中的微生物BQ-An發(fā)酵提取得到的具有殺蟲活性的堿性蛋白酶，以其為主要活性物質(zhì)的生產(chǎn)高效微生物殺蟲劑，具有無毒、高效、低殘留的特點(diǎn)，可有效防治小齡幼蟲。實(shí)施例1、樣品采集按照多點(diǎn)取樣(不同地點(diǎn)、不同土層深度)混合的方法，鏟去表層土，采用簡易打孔器，打取深度為3—15cm的土樣，裝入無菌牛皮紙袋或鋁盒中，做好記錄。采集的土樣應(yīng)沒有大的顆粒，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干后立即進(jìn)行分離培養(yǎng)。其中取樣的土壤為任何普通的土壤，任何普通的土壤中均含有枯草芽孢桿菌，即取樣不受客觀條件的限制，具有重復(fù)性。2、分離與純化(參見圖2):將采來的土樣陰干、研磨后，稱取5g，放入150ml盛有45ml生理鹽水的三角瓶中，搖動(dòng)3-5min，在8(TC水浴中加熱10min，殺滅不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和其他菌類。采用土壤稀釋分離法，吸取lmL的稀釋液加入到含有9mL水的試管中，振蕩混勻，制得10—2土壤稀釋液；按照上述方法分別制取10-3、10-4、10-5土壤稀釋液。分別取10-3、10-4、10-5土壤稀釋液0.05mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上。倒置在28t:的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取單菌落，鏡檢，采用劃線分離的方法純化。初篩(1)初篩培養(yǎng)基(%)(w/w):脫脂奶粉6.0;酵母膏0.1;葡萄糖0.1;MgS04.7H2O0.01;KH2PO40.05;K2HPO40.l;瓊脂2.0;pH7.0。(2)用接種環(huán)將分離得到的菌株接種在彈性蛋白平板培養(yǎng)基上，并置于37。C培養(yǎng)2—3天，然后觀察直徑和透明圈大小，以透明圈直徑與菌落直徑的比值(HC值)作為初篩指標(biāo)。將比值大的用稀釋倒平板或劃線法進(jìn)行分離純化，挑取單菌落接入斜面，于37"C培養(yǎng)24-32小時(shí)。3、復(fù)篩(參見圖2):(1)發(fā)酵培養(yǎng)基(％)(w/w):酪蛋白3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液2.0;K2HPO40.2;MgS047H200.01;pH6.0。(2)將初篩所得菌株分別接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床振蕩發(fā)酵24小時(shí)后，4°C、4000rpm離心30分鐘，取上清液，用標(biāo)準(zhǔn)底物、分光光度計(jì)測定各菌株彈性蛋白酶的活力反復(fù)試驗(yàn)，選擇一株活力最高的菌株作為發(fā)酵菌株。酶活測定參照工業(yè)部頒國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。4、微生物發(fā)酵條件優(yōu)化1、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化(1)碳源選擇在原發(fā)酵基本培養(yǎng)基上，保持碳源含量不變，分別采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖+蔗糖(1:1)、蔗糖+淀粉(1:1)、葡萄糖+淀粉(1:1)及葡萄糖+蔗糖+淀粉(2:1:2)等有機(jī)物作為碳源，以不加任何碳源作為對(duì)照。(2)氮源選擇選擇(1)試驗(yàn)中抑菌效果最好的碳源組成方式作為碳源，改變氮源的組成。供選擇的氮源有蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、尿素、玉米漿、麥麩、(NH4)2S04,以不加任何氮源作對(duì)照。(3)無機(jī)離子選擇按照已篩選好的最佳碳源、最佳氮源作為碳氮源，稱取適量的無機(jī)鹽，使得金屬離子在培養(yǎng)基中的濃度為0.02mol/L，以不加任何無機(jī)離子為對(duì)照。供選擇的無機(jī)鹽有硫酸鋅、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鐵、磷酸氫二鉀及硫酸鎂。(4)最優(yōu)培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)從上述培養(yǎng)基基本成分研究中，確定最佳碳源和氮源及加入的無機(jī)鹽種類。為進(jìn)一步確定各培養(yǎng)基成分因子含量之間的相關(guān)性，選取碳源、氮源、生長因子(酵母膏)和無機(jī)鹽等4個(gè)因素進(jìn)行正交篩選試驗(yàn)。每個(gè)因素取3個(gè)水平，根據(jù)正交表"(34)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。表l培養(yǎng)基組分U(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注A:葡萄糖+蔗糖+淀粉；B:豆餅粉；C:酵母膏；D:磷酸氫二鉀發(fā)酵培養(yǎng)基ra的選擇-用4mol/LHC1和1mol/LNaOH將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0，最適溫度下，150r/min搖床培養(yǎng)38h，取發(fā)酵液測酶活。3、發(fā)酵時(shí)間的選擇將菌株發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)成6、12、18、24、30、36、42、48h，調(diào)節(jié)pH為7.0，36。C下150r/min搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液測酶活。4、發(fā)酵溫度的選擇將菌株發(fā)酵溫度設(shè)成21、24、27、30、33、36、40°C，150r/min搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵液測酶活。5、搖床轉(zhuǎn)速的選擇將搖瓶的轉(zhuǎn)速分別設(shè)為120、150、175、200、230r/min，調(diào)節(jié)最適pH，最適溫度下，培養(yǎng)36h，取發(fā)酵液測定酶活。6、消泡劑的選擇于已知最適條件下?lián)u瓶發(fā)酵。在發(fā)酵液中加入不同的花生油作為消泡劑，進(jìn)行酶的產(chǎn)生試驗(yàn)。結(jié)果篩選得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方(w/w)為葡萄糖1.2%+蔗糖0.6%+淀粉1.2°/。，豆餅粉3%，酵母粉0.3%，K2HP043H200.2%;最佳發(fā)酵時(shí)間36h，最佳溫度36。C，初始最佳PH值8.0，搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min。消泡劑以0.3%-0.6%花生油為宜。5、微生物發(fā)酵產(chǎn)物的提取和純化工藝為(參見圖1)1、發(fā)酵液的預(yù)處理(1)發(fā)酵液的預(yù)處理-取發(fā)酵完畢的發(fā)酵液100ml，加入絮凝劑NaA102，室溫?cái)嚢?min后靜置待分層。絮凝劑NaA102的用量以質(zhì)量百分比0.1%—0.15%為適宜。(2)、發(fā)酵液的提取a離心將預(yù)處理后的發(fā)酵液的上清液裝入離心管，在4"C條件下8000r/min離心8min;b脫色向洗脫液中加入1%的活性炭，用水浴加熱至90。C，保溫?cái)嚢?0分鐘，趁熱過濾，取濾液低溫干燥可得粗蛋白酶。C鹽析將上述所得粗蛋白酶溶解，調(diào)pH為7.8，在冰浴條件下邊攪拌邊加入60%(w/w)的飽和硫酸銨溶液中，然后繼續(xù)攪拌lh放置于4"C條件下4000r/min離心30min，收集沉淀，溶于0.2mol/L、pH7.4的硼酸緩沖液中，再用0.05mol/L的硼酸緩沖液透析。d超濾將透析所得酶液置于超濾容器中在4"C的環(huán)境中，在氮?dú)鈮毫?.5個(gè)大氣壓力下，用截留分子量為10萬的膜超濾5h，收集截留的液體。eS印hadexG—75凝膠柱層析在低溫4'C的環(huán)境下，選擇S印hadexG—75作為填充介質(zhì)。稱取一定量的S印hadexG—75在沸水中充分溶脹，冷卻，裝柱。將DEAE-S印hadexA50收集到的活性峰濃縮后上樣。用O.lmol/LpH7.4的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.5ml/min，用核酸/蛋白檢測儀檢測，收集堿性蛋白酶活性組分。然后冷凍干燥濃縮于4'C保存。本發(fā)明活性物質(zhì)為堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑的制備過程用芽孢桿菌BQ-An作生產(chǎn)菌株，選擇用最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵也濃縮提取活性物質(zhì)堿性蛋白酶后，加入表面活性劑、增效劑、助劑、填料等，攪拌后即可包裝。微生物殺蟲劑主要組分比例為(w/w):堿性蛋白酶9%_16%表面活性劑1%_2%高滲劑1%-1.5%增效劑1%-3%助劑3%-5°/。水68%-84%表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，高滲劑為0P-80，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成。所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。本發(fā)明活性物質(zhì)為堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑室內(nèi)藥效試驗(yàn)1、分析方法；藥膜法測定殺蟲劑對(duì)小齡幼蟲的觸殺毒力將殺蟲劑等比稀釋成5個(gè)梯級(jí)濃度(X109、X108、X107、X106、X105)。在閃爍瓶(直徑X高二25mmX55mm)中加入0.5ml藥液，每處理重復(fù)3次，以不加殺蟲劑為對(duì)照。加好藥液后閃爍瓶平放在水平桌面上滾動(dòng)，使閃爍瓶內(nèi)側(cè)形成均勻的藥膜。每瓶接5頭幼蟲，瓶子橫放，讓試蟲在藥膜上爬行3h,然后轉(zhuǎn)入有孕穗期連根(用脫脂棉包住并加水保濕)小麥莖(高約10cm)的礦泉水瓶中(倒放)，再接入食料。用海綿塞封住礦泉水瓶瓶口。最后將試蟲置于25。C、光周期14:10h(L:D)的光照培養(yǎng)箱中，2d后檢査死蟲數(shù)。殺蟲劑毒力的評(píng)判在確定殺蟲劑的處理標(biāo)準(zhǔn)濃度后，對(duì)藥劑處理后的藥劑致死率加以校正，可直接查Abbort校正值表得到。用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算毒力回歸方程式、相關(guān)系數(shù)及LC5。。毒力回歸方程LC50(uI7L)y=2.5249+1.9562x0.956218.4188權(quán)利要求1、一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9％-16％表面活性劑1％-2％高滲劑1％-1.5％增效劑1％-3％助劑3％-5％水68％-84％2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于堿性蛋白酶的制造方法為(1)菌種培養(yǎng)采用種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配制；(3)發(fā)酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵得發(fā)酵液；(4)粗提發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后離心，脫色，過濾和減壓干燥得粗品堿性蛋(5)精制粗品經(jīng)純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過濾層析，然后干燥濃縮得成品。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.2%、蔗糖0.6%、淀粉1.2%，豆餅粉3%，酵母粉O.3%，K2HP043H200.2%，其中百分比為w/w;發(fā)酵時(shí)間為36h,溫度為36。C，初始ra值8.0，搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min。消泡劑為0.3%-0.6%花生油。全文摘要本發(fā)明涉及一種活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其低殘留、殺蟲譜廣、高效、能降解、選擇性強(qiáng)。本發(fā)明包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9％-16％，表面活性劑1％-2％，高滲劑1％-1.5％，增效劑1％-3％，助劑3％-5％，水68％-84％。上述表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉∶硝酸銨∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35；還摻入微量的堿金屬鹽類MgCl₂或K₂O₃等作為添加劑。文檔編號(hào)A01P7/00GK101396025SQ20081023171公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者劉雙發(fā),安德榮申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)