專利名稱：：多功能菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，具體地涉及一株多功能土壤芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在我國(guó)，長(zhǎng)期過(guò)量施用化肥導(dǎo)致了土壤板結(jié)、肥力退化等一系列問(wèn)題。同時(shí)，人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥、化肥殘留問(wèn)題日益關(guān)注，綠色食品、有機(jī)食品受到巿場(chǎng)的熱捧。在這種大環(huán)境下，我國(guó)生物肥料產(chǎn)業(yè)得以迅速發(fā)展，生物肥料的年產(chǎn)量達(dá)到400萬(wàn)口屯，在農(nóng)業(yè)部登記的產(chǎn)品種類(lèi)多達(dá)12個(gè)，包括根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌類(lèi)肥料、解鉀菌類(lèi)肥料等。但是，目前巿場(chǎng)上銷(xiāo)售的生物肥料普遍存在著功能單一、質(zhì)量不穩(wěn)定、土壤適應(yīng)性差等問(wèn)題，從而限制了其規(guī)?；茝V。克服上述問(wèn)題的關(guān)鍵在于篩選出抗逆性強(qiáng)的多功能菌株。本發(fā)明正是基于此思路，經(jīng)多年實(shí)驗(yàn)篩選出具備多種功能的土壤芽孢桿菌，并改進(jìn)了現(xiàn)有的孢子粉生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)了生物菌肥生產(chǎn)的突破。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一株多功能土壤芽孢桿菌，本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株生產(chǎn)孢子粉的方法。(二)技術(shù)方案本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌(^^7/船eJ"http://n'c船)YZH-002，該菌株已于2008年2月25曰被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2315。本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌(B""7/we^p/w'cw)CGMCCNo.2315,具備改善土質(zhì)、分泌植物生長(zhǎng)激素、防治病蟲(chóng)害等多種功能。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)前述土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，包括如下步驟:(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養(yǎng)基平板上劃線，于30。C培養(yǎng)14-16h;然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，于30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種于裝有固體培養(yǎng)基的克氏瓶中，涂勻，于3(TC培養(yǎng)3-4天，直至培養(yǎng)基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無(wú)菌水沖洗菌苔，接種于滅過(guò)菌的種子罐，接種溫度70-80°C,發(fā)酵參數(shù)設(shè)置為溫度30-35°C，罐壓0.03-0.05MPa,通氣量l:0.2-0.3(m3/t/h)，pH6.8-7.2，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200-400rpm,培養(yǎng)時(shí)間20-24h;(4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)得到的種子液輸入發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置同步驟(3)，培養(yǎng)時(shí)間28-34h;(5)噴粉將步驟(4)發(fā)酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3-4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然后進(jìn)入噴霧塔，進(jìn)口溫度為180-220。C，出口溫度為50-60°C，得到孢子粉。上述方法中所用到的培養(yǎng)基的組成具體如下(1)活化菌種所用的培養(yǎng)基組成按質(zhì)量百分比計(jì)為(用于種子活化和芽孢生成步驟)蛋白胨5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%。5NaCl3~6%0KC10.5~1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%opH7.0;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比計(jì)為(用于接種罐和發(fā)酵培養(yǎng)步驟)::玉米漿1~10%豆餅粉0.5~5%淀粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0~7.2。本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌可應(yīng)用于制備生物有機(jī)肥、生態(tài)配方肥、生物農(nóng)藥以及土壤改良劑等生物制劑。相應(yīng)地，本發(fā)明所述的孢子粉生產(chǎn)方法也可應(yīng)用于上述制劑的生產(chǎn)。(三)有益效果本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌耐鹽、耐熱、抗逆性強(qiáng)，能夠分泌吲哚丙酸、玉米素、赤霉素等多種植物激素，并能防治線蟲(chóng)及多種真菌病害，適用于生產(chǎn)生物有機(jī)肥、生態(tài)配方肥、生物農(nóng)藥以及土壤改良劑等生物制劑。同時(shí)，本發(fā)明提供的孢子粉生產(chǎn)方法有效減少了核心菌株的死亡率，使得存活率達(dá)93%以上，并將孢子粉的保質(zhì)期提高到12個(gè)月以上。圖l、幾丁質(zhì)分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果圈。本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌(5a"7/w5e^p/2/cw5)YZH-002,該菌株已于2008年2月25日被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCCNo.2315。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌的性質(zhì)及功能實(shí)驗(yàn)本發(fā)明所述的土壤芽孢桿菌是發(fā)明人從水稻根際土壤中分離得到，其性質(zhì)和功能如下。一、形態(tài)及生理生化特性G+、桿狀，大小為(0.4-0.6)x(1.5-3)pm;芽孢側(cè)生，多數(shù)為橢圓形；VF,培養(yǎng)液pH7.07.2;pH5.5-9.8下生長(zhǎng)+。在厭氧培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在7.5%以上的NaCl中不生長(zhǎng)；淀粉水解—，明膠液化+，分解酪素+，接觸酶+，氧化酶-，檸檬酸鹽利用—，葡萄糖產(chǎn)氣—，葡萄糖產(chǎn)酸+,L-阿拉伯糖產(chǎn)酸-，木糖產(chǎn)酸-，甘露醇產(chǎn)酸+，硝酸鹽還原+，甲基紅試驗(yàn)+。以上所用到的檢測(cè)方法均為微生物實(shí)驗(yàn)教科書(shū)中的經(jīng)典方法，+表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，-表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。二、功能實(shí)驗(yàn)1.植物生長(zhǎng)激素的分泌表1激素種類(lèi)分泌量7所用的測(cè)定方法為經(jīng)典的液相色譜法。2、幾丁質(zhì)分解在活化培養(yǎng)基(見(jiàn)本申請(qǐng)技術(shù)方案的記載)中添加濃度為2%的幾丁質(zhì),平板培養(yǎng)所述的土壤芽孢桿菌。36h后，觀察到菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈，如附圖l所示，表明該菌具備很強(qiáng)的分解幾丁質(zhì)能力。幾丁質(zhì)是線蟲(chóng)卵外壁和致病真菌細(xì)胞壁的主要成分，這說(shuō)明該菌具備防治線蟲(chóng)和真菌病害的功能，田間實(shí)驗(yàn)也證明其效果顯著。3.抗逆性實(shí)驗(yàn)3.1耐鹽性取35。/n的(NH4)2S04溶液10mL，加入土壤芽孢桿菌菌液1亳升(發(fā)酵菌液，菌體數(shù)量40-50億個(gè)/mL)，浸泡土壤芽孢桿菌0~15天。用10mL蒸餾水代替35。/。的(NH4)2S04浸泡做對(duì)照。然后，將浸泡液加入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶(內(nèi)有無(wú)菌坡璃珠)中，50100rpm振蕩培養(yǎng)30min。取1mL稀釋液加入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，搖勻，重復(fù)上述操作，直至稀釋至104倍。取1(T6、10—7、10—s倍的稀釋液各0.1mL置于平板中，涂勻，3(TC培養(yǎng)12天，計(jì)數(shù)。存活率結(jié)果如表2所示，從表2可看出該菌株有較強(qiáng)的耐鹽性。表2耐鹽性實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.2耐熱性:以8(TC和9(TC為溫度處理，以1、3小時(shí)為時(shí)間處理，以自然保存溫度為對(duì)照，對(duì)所述土壤芽孢桿菌進(jìn)行耐熱處理。然后取1亳升菌液(發(fā)酵菌液，菌體數(shù)量40-50億個(gè)/mL)加入裝有99ml無(wú)菌水的三角瓶(內(nèi)有無(wú)菌玻璃珠)中，50~100rpm振蕩培養(yǎng)30min。取1mL稀釋液加入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，搖勻，重復(fù)上述操作，直至稀釋至10—8倍。取10"6、10—7、10—8倍的稀釋液各O.lmL置于平板中，涂勻，3(TC培養(yǎng)12天，計(jì)數(shù)，結(jié)果如表3所示。根據(jù)表3的數(shù)據(jù)，我們可以看出8(TC處理3小時(shí)的菌劑中芽孢存活率為93.25%,表現(xiàn)出很高的耐熱性。表3耐熱性實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2孢子粉的制備(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養(yǎng)基平板上劃線，于3(TC培養(yǎng)14h;然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，于3(TC、250rpm振蕩培養(yǎng)至OD6()()ran=1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種于裝有固體培養(yǎng)基的克氏瓶中，涂勻，于3(TC培養(yǎng)3天，直至培養(yǎng)基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無(wú)菌水沖洗菌苔，接種于滅過(guò)菌的種子罐，接種溫度70。C，發(fā)酵參數(shù)設(shè)置為溫度35"C，罐壓0.03MPa，通氣量1:0.2(m3/t/h)，pH6.8，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)250rpm，培養(yǎng)時(shí)間20h;(4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)得到的種子液輸入發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置同步驟(3)，培養(yǎng)時(shí)間34h;(5)噴粉將步驟(4)發(fā)酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然后進(jìn)入噴霧塔，進(jìn)口溫度為220°C，出口溫度為6(TC，得到孢子粉。以上所用培養(yǎng)基見(jiàn)技術(shù)方案。經(jīng)檢測(cè)，孢子存活率達(dá)95%,孢子粉的保質(zhì)期18個(gè)月。實(shí)施例3孢子粉的制備(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養(yǎng)基平板上劃線，于30匸培養(yǎng)16h;然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，于3(TC、250rpm振蕩培養(yǎng)至00600鵬=1;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種于裝有固體培養(yǎng)基的克氏瓶中，涂勻，于3(TC培養(yǎng)4天，直至培養(yǎng)基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無(wú)菌水沖洗菌苔，接種于滅過(guò)菌的種子罐，接種溫度80。C,發(fā)酵參數(shù)設(shè)置為溫度30r,罐壓0.05MPa,通氣量1:0.3(m3/t/h)，pH7.2，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)400rpm，培養(yǎng)時(shí)間24h;(4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)得到的種子液輸入發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置同步驟(3)，培養(yǎng)時(shí)間28h;(5)噴粉將步驟(4)發(fā)酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然后進(jìn)入噴霧塔，進(jìn)口溫度為18(TC，出口溫度為5(TC,得到孢子粉。以上所用培養(yǎng)基見(jiàn)技術(shù)方案。經(jīng)檢測(cè)，孢子存活率達(dá)96%，孢子粉的保質(zhì)期14個(gè)月。實(shí)施例4在制備生物菌肥中的應(yīng)用將實(shí)施例2所得孢子粉與腐熟好的有機(jī)質(zhì)混合攪拌，經(jīng)70°C-18(TC高溫烘干，制造出含水率不超過(guò)8%的有機(jī)生物顆粒。冷卻至常溫，篩分，得到不同大小的粒子，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的粒子打包入庫(kù)，制得生物有機(jī)菌肥。實(shí)施例5在制備生態(tài)配方肥中的應(yīng)用根據(jù)土壤中的N、P、K含量和不同農(nóng)作物N、P、K需求量，在實(shí)施例4制得的生物有機(jī)菌肥中加入不同含量的N、P、K無(wú)機(jī)養(yǎng)分，混合均勻，制成有機(jī)質(zhì)、無(wú)機(jī)養(yǎng)分和微生物三者有機(jī)結(jié)合的生態(tài)配方肥。實(shí)施例6線蟲(chóng)抑制劑的制備取實(shí)施例3所得孢子粉，向其中加入5%-20%的淀粉、3%-5%的蝦殼粉或蟹殼粉，制得線蟲(chóng)抑制劑。以上比例均為重量百分比。權(quán)利要求1、一株土壤芽孢桿菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，其特征在于該菌株具備改善土質(zhì)、分泌植物生長(zhǎng)激素、防治病蟲(chóng)害等多種功能。2、一種生產(chǎn)如權(quán)利要求l所述的土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，包括如下(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養(yǎng)基平板上劃線，于30'C培養(yǎng)14-16h;然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，于30'C、250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種于裝有固體培養(yǎng)基的克氏瓶中，涂勻，于3'C培養(yǎng)3-4天，直至培養(yǎng)基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無(wú)菌水沖洗菌苔，接種于滅過(guò)菌的種子罐，接種溫度70-80°C,發(fā)酵參數(shù)設(shè)置為溫度30-35°C，罐壓0.03-0.05MPa,通氣量1:0.2-0.3，pH6.8-7.2，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200-400rpm，培養(yǎng)時(shí)間20-24h;(4)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)得到的種子液輸入發(fā)酵罐，發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置同步驟(3),培養(yǎng)時(shí)間28-34h;(5)噴粉將步驟(4)發(fā)酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3-4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然后進(jìn)入噴霧塔，進(jìn)口溫度為180-220°C，出口溫度為50-6。C，得到孢子粉。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所用到的培養(yǎng)基組成是(1)活化菌種所用的培養(yǎng)基組成蛋白胨5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%oNaCl3~6%oKC10.5-'1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%0pH7.0;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米漿1~10%豆餅粉0.5~5%淀粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0—7.2。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌種在制備生物有機(jī)肥、生態(tài)配方肥、生物農(nóng)藥以及土壤改良劑等生物制劑中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法在制備生物有機(jī)肥、生態(tài)配方肥、生物農(nóng)藥以及土壤改良劑等生物制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一株土壤芽孢桿菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，該菌株耐鹽、耐熱、抗逆性強(qiáng)，能夠分泌吲哚丙酸、玉米素、赤霉素等多種植物激素，并能防治線蟲(chóng)及多種真菌病害。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)前述土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，該方法有效減少了核心菌株的死亡率，使得存活率達(dá)93％以上，并將孢子粉的保質(zhì)期提高到12個(gè)月以上。本發(fā)明提供的多功能菌株和其孢子粉生產(chǎn)方法適用于生產(chǎn)生物有機(jī)肥、生態(tài)配方肥、生物農(nóng)藥以及土壤改良劑等生物制劑。文檔編號(hào)A01P5/00GK101525582SQ20081010149公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者劉旭明申請(qǐng)人:北京易眾恒科技有限公司