專利名稱：：一種爪哇擬青霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種爪哇擬青霉菌株及其在防治害蟲方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在紅火蟻、斜紋夜蛾、粉虱和小菜蛾等害蟲的防治上，多采用傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法，在生物農(nóng)藥防治方面，目前在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)爪哇擬青霉菌株用于防治上述害蟲的相關(guān)專利申請。爪哇擬青霉菌是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新的作用機(jī)理、對環(huán)境無污染、無殘留的特征，可以作為防治某些對蘇云金桿菌(Bt)產(chǎn)生抗藥性的昆蟲的替代防治藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種爪哇擬青霉菌株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述爪哇擬青霉菌株的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)提供一種爪哇擬青霉菌株，所述菌株為爪哇擬青霉菌U-N2，菌株保藏號CCTCCNo:M208085，2008年6月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。所述爪哇擬青霉菌株屬絲孢目、擬青霉屬。所述爪哇擬青霉菌株是從廣西省弄崗自然保護(hù)區(qū)被蟲生真菌自然侵染的小菜蛾蟲體上分離獲得，其在査氏培養(yǎng)基上菌落呈層狀，中間隆起的一層邊緣不整齊，土黃色，菌落背面中央白色，外緣淡黃色，瓶?；颗虼蟪芍鶢罨驒E圓形，向上突然變細(xì)，7.5-12.5X2-2.5um，2-3個(gè)輪生于分生孢子梗上；分生孢子柱形或長橢圓形，4-6.7X1—1.5um，呈離散的長鏈。本發(fā)明同時(shí)提供了所述爪哇擬青霉菌株在制備防治粉虱、斜紋夜蛾、紅火蟻、蚜蟲或小菜蛾的藥物方面的應(yīng)用，本發(fā)明的爪哇擬青霉菌對防治紅火蟻、斜紋夜蛾、蚜蟲、粉虱和小菜蛾等多種害蟲有效。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(l)本菌株是從廣西省弄崗自然保護(hù)區(qū)被侵染的小菜蛾蟲體上分離獲得，為中國本土的菌株，并非從國外引進(jìn)，能較好地適應(yīng)國內(nèi)的自然環(huán)境。(2)本發(fā)明所述的爪哇擬青霉菌是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新作用機(jī)理、對環(huán)境無污染、無殘留的特征，適應(yīng)有機(jī)食品生產(chǎn)的要求。(3)本發(fā)明的爪哇擬青霉菌對防治紅火蟻、斜紋夜蛾、蚜蟲、粉虱和小菜蛾等多種害蟲有效。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一歩詳細(xì)闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明主要闡述該菌株的發(fā)明思想，實(shí)施方式不一一在實(shí)施例中追述，但并不因此限制本發(fā)明，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應(yīng)被視為等效的置換方式，包含在本發(fā)明內(nèi)。實(shí)施例1爪哇擬青霉的分離、純化、鑒定和篩選1.1材料在廣西省弄崗自然保護(hù)區(qū)的蔬菜上采集到一種被蟲真菌侵染的小菜蛾P(guān)lutellaxyostella蟲尸。查氏培養(yǎng)基(Czapek—Dox):N線2g，K2HP041g，KC10.5g，MgS040.5g，F(xiàn)eS040.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，加入水使總體積為1000ml并煮沸后經(jīng)高壓滅鍋12rC滅菌30min。無菌操作條件所有器皿和用具須經(jīng)高壓滅鍋滅菌(12rc，30min)，接種等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)條件置于25t:光照(14L:10D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4"C冰箱貯存。1.2病原菌的分離、鑒定(一)病原菌的分離、純化與鑒定(1)分離從采回的被蟲生真菌感染的小菜蛾蟲尸樣品上分離病原菌。利用5%的次氯酸鈉溶液對樣品進(jìn)行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次，并放入Czapek平板中，倒置于25。C恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到Czapek斜面，再轉(zhuǎn)入4。C冰箱貯存。(2)復(fù)壯將分離到的菌株在Czapek平板上培養(yǎng)7天，待形成菌落后加入0.03%吐溫-80的無菌水收集孢子，待孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，攪拌速度參照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)，然后將帶有小菜蛾幼蟲的葉片浸入1X10'孢子/ml孢子懸浮液中10秒鐘，取出晾千后在90%以上的濕度下保濕24小時(shí)。10天后挑取被感染的小菜蛾，按(1)所述的方法分離到A分離株。(3)純化對A分離株在Czapek平板上培養(yǎng)10天，待形成孢子后，挑取分生孢子制成1Xl()3孢子/ml的孢子懸液，將懸液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個(gè)液滴中只有一個(gè)分生孢子的玻片插入PDA培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得B、C、D、E、F、G共6個(gè)分離株。(4)病原菌的鑒定根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進(jìn)行初歩鑒定。1、菌落形態(tài)描述將獲得的6個(gè)分離株接種到Cz即ek平板上，于25。C條件下培養(yǎng)。23天可見到長出白色的菌絲，菌落呈層狀，中間隆起的一層邊緣不整齊，土黃色，5天后產(chǎn)生分生孢子。菌落背面中央白色，外緣淡黃色。2、菌絲和孢子形態(tài)描述瓶?；颗虼蟪芍鶢罨驒E圓形，向上突然變細(xì)，7.5-12.5x2-2.5罔，23個(gè)輪生于分生孢子梗上。分生孢子柱形或長橢圓形，4-6.7x1-1.5拜，呈離散的長鏈。(二)爪哇擬青霉分離株的篩選蟲生真菌在遺傳、生態(tài)及生物學(xué)等方面具有多樣性，又存在有準(zhǔn)性生殖現(xiàn)象，同種真菌的不同菌株對目標(biāo)害蟲的致病力差異顯著，菌株不同，其LD50、LT5o可相差數(shù)倍至數(shù)十倍。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選與獲得，是取得較好防治效果的首要前提。菌株篩選常用的4個(gè)指標(biāo)分別為致病力、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、菌落生長速率。本發(fā)明以這些指標(biāo)為依據(jù)，篩選爪哇擬青霉的優(yōu)勢菌株。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化獲得的爪哇擬青霉B、C、D、E、F、G共6個(gè)分離株，在Czapek平板于25士0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)。(2)供試?yán)ハx與寄主植物小菜蛾，將網(wǎng)室中詞養(yǎng)在芥藍(lán)上的小菜蛾成蟲，接種到無蟲的芥藍(lán)幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將芥藍(lán)幼苗置于25士0.5'C的光照培養(yǎng)箱中，待小菜蛾發(fā)育至2齡若蟲時(shí)待用。芥藍(lán)5rasW乙、sca/^M^i'sZ.，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗(yàn)苗均采用46片展開葉的盆栽苗。(3)菌落生長速率和產(chǎn)孢量的測定將6個(gè)分離株分別配制成lxl()7孢子/ml的分生孢子懸液，分別取lml懸液滴入Czapek培養(yǎng)基上，用三角玻璃棒涂勻，待12天長出菌絲后用直徑為13mm的打孔器取新鮮菌落，接種于Czapek平板上，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(L:D=14:10)。每個(gè)菌株5次重復(fù)。第14天測定菌落直徑并收集分生孢子用血球計(jì)數(shù)板記數(shù)測定產(chǎn)孢量。具體操作如下用直尺測量菌落直徑，并用直徑為5mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)皿中取菌絲生長均勻的菌塊，然后放入加有20ml0.3%吐溫-80無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)測定產(chǎn)孢量。6個(gè)分離株的菌落生長速率和產(chǎn)孢量見表1，菌落生長速率除B與G、E與F差異不顯著外，其余的分離株之間差異顯著，其中C分離株的菌落生長速率最大，F(xiàn)分離株的菌落生長速率最小。生長14天后，除分離株D與E、G和B的產(chǎn)孢量差異不顯著外，其它分離株之間的產(chǎn)孢量差異顯著，其中C分離株的產(chǎn)孢量最高。表1爪哇擬青霉6個(gè)分離株的生長速率和產(chǎn)孢量(14d)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(4)孢子萌發(fā)率的測定將6個(gè)分離株分別培養(yǎng)14天后，用無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發(fā)法試驗(yàn)。將孢子懸液滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加34滴無菌水保濕(100，RH)，培養(yǎng)24h后鏡檢。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。6個(gè)分離株中，C、G分離株與其它分離株之間的分生孢子萌發(fā)率差異顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。其中C分離株的孢子平均萌發(fā)率最高，D分離株的孢子萌發(fā)率最低。表2爪哇擬青霉6個(gè)分離株的分生孢子萌發(fā)率(24h)<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(5)分離株對小菜蛾2齡幼蟲的致病力測定將6個(gè)分離株培養(yǎng)14天后，用無菌水收集孢子，配制成濃度為1()7分生孢子/mL的孢子懸液。將帶有2齡小菜蛾幼蟲的芥藍(lán)葉片浸入懸液中，對照浸入無菌水中，20s后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉50100頭若蟲，3次重復(fù)。摘下處理過的葉片，插于盛有無菌水的花泥中，置于透明的保鮮盒內(nèi)。再置于25士0.5。C的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察10天。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均可以在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。致病力研究結(jié)果表明，所有分離株的侵染率與對照相比差異顯著。6個(gè)分離株在第3天開始表現(xiàn)出侵染癥狀，從第5天的侵染率可看出C、D、E、G分離株顯著高于B、F分離株，第10天時(shí)C分離株與其它分離株的侵染率差異顯著。從總體而言，分離株C的致病力較強(qiáng)，平均為91.47%(10天)，B分離株的侵染率較低，為73.23%(10天)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3:表3爪哇擬青霉6個(gè)分離株對小菜蛾的致病力<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(6)爪哇擬青霉分離株的篩選在篩選優(yōu)良分離株時(shí)，致病性和產(chǎn)孢量是重要的參考指標(biāo)，孢子萌發(fā)率和菌落生長速率次之。在本發(fā)明中從菌落生長速率、產(chǎn)孢量和致病性上看，分離株C較為優(yōu)良，具有致病性強(qiáng)、產(chǎn)孢量高等特點(diǎn)，結(jié)合表1和表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。綜合比較各方面的因素，C分離株為最佳菌株，將其命名為IJ-N2菌株，經(jīng)貴州大學(xué)劉愛英教授鑒定為爪哇擬青霉Zsar/"j'avam'，(Friendrichs&Bally)，其菌株保藏號CCTCCNo:M207088，2007年6月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。所述爪哇擬青霉ZsanVzj'awm/ci^(Friendrichs&Bally)菌株IJ-N2，屬絲孢目，擬青霉屬。在查氏培養(yǎng)基上菌落呈層狀，中間隆起的一層邊緣不整齊，土黃色，菌落背面中央白色，外緣淡黃色，瓶梗基部膨大成柱狀或橢圓形，向上突然變細(xì)，7.5-12.5X2-2.5um，2-3個(gè)輪生于分生孢子梗上。分生孢子柱形或長橢圓形，4-6.7X1-1.5ym，呈離散的長鏈。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均可在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。實(shí)施例2爪哇擬青霉IJ-N2菌株對紅火蟻的致病力測定生物測定是檢測蟲生真菌對目標(biāo)害蟲的致死程度和致死速率的有效手段之一，能為綜合評價(jià)該真菌的生物防治潛力提供重要的參考依據(jù)。本發(fā)明就爪哇擬青霉IJ-N2菌株對紅火蟻的致病力進(jìn)行測定，以篩選出在防治時(shí)所用的最佳濃度。供試?yán)ハx紅火蟻，自廣州大學(xué)城草坪，采集后在室內(nèi)飼養(yǎng)一段時(shí)間，待種群穩(wěn)定后挑選出大小一致的健康大型工蟻用于試驗(yàn)。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的爪哇擬青霉IJ-N2菌株，采用Czapek平板，于25土0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)14天，加入0.3%吐溫-80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)確定孢子濃度后，再配成5X105、1X106、5X106、1X107、5Xl()7孢子/ml5個(gè)濃度梯度待用。(2)分離株對紅火蟻的致病力測定將紅火蟻大型工蟻浸入5個(gè)梯度的孢子懸浮液中，對照浸入含0.03%吐溫-80的無菌水中，20秒鐘后取出，自然晾干。每處理為30頭蟲，3次重復(fù)。處理過的紅火蟻大型工蟻放置于25士0.5"C的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察14天。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。(3)爪哇擬青霉菌株對紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率接種后的第45天，各處理區(qū)的紅火蟻大型工蟻開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如可觀察到蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現(xiàn)孢子，隨后紅火蟻大型工蟻死亡。表4為爪哇擬青霉處理后紅火蟻大型工蟻第7天、14天的累計(jì)死亡率，結(jié)果表明隨著濃度的增加紅火蟻大型工蟻的死亡率也增加，同一濃度下隨著時(shí)間的增加，煙粉虱2齡的死亡率也增加。其中1X106和1X1()7處理區(qū)，紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率差異不顯著。表4爪哇擬青霉菌株對紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。實(shí)施例3爪哇擬青霉IJ-N2菌株對斜紋夜蛾幼蟲的致病力測定供試?yán)ハx與寄主植物斜紋夜蛾，將網(wǎng)室中飼養(yǎng)在芥藍(lán)上的斜紋夜蛾成蟲，接種到無蟲的芥藍(lán)幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將芥藍(lán)幼苗置于25土0.5。C的光照培養(yǎng)箱中，待斜紋夜蛾發(fā)育至2齡幼蟲時(shí)待用。芥藍(lán)石m^caow2/7e^^L.，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗(yàn)苗均采用810片展開葉的盆栽苗。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的爪哇擬青霉IJ-N2菌株，在Czapek平板上于25士0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)10天，加入0.03%吐溫一80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)確定孢子濃度后，再配成lxl05、5xl05、lxl06、5xl06、lxl07孢子/ml5個(gè)濃度梯度待用。(2)分離株對斜紋夜蛾幼蟲的致病力測定將帶有斜紋夜蛾2齡幼蟲的芥藍(lán)葉片浸入5個(gè)梯度的孢子懸浮液中，對照浸入無菌水中，20s后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉10頭若蟲，3次重復(fù)。處理過的葉片放入滅菌的25cmX35cm托盤中，并放置于25士0.5。C的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，并更換新鮮的芥藍(lán)葉片，連續(xù)觀察10天。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。(3)爪哇擬青霉菌株對斜紋夜蛾2齡的累計(jì)死亡率接種后的第23天，各處理區(qū)的幼蟲開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如蟲體行動(dòng)遲緩、食欲不振，隨后可觀察到蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現(xiàn)孢子，隨后斜紋夜蛾死亡。表5為爪哇擬青霉處理2齡幼蟲后第5天、10天的累計(jì)死亡率結(jié)果，表明隨著濃度的增加，斜紋夜蛾2齡的死亡率也增加，同一濃度下隨著時(shí)間的增加，斜紋夜蛾2齡的死亡率也增加。其中1X106和1X107處理區(qū)，斜紋夜蛾的累計(jì)死亡率差異不顯著。表5爪哇擬青霉對斜紋夜蛾2齡幼蟲的累計(jì)死亡率濃度5d10dlxl050.12±0.43c0.26土1.33c5xl050.16±0.85bc0.31土1.05clxl060.24±1.21b0.56士l,24b5xl060.35±1.23ab0.76±1.81ab1xl070.41±2.01a0.88±2.01aCK0.05±0.42c0.08±0.85d注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。權(quán)利要求1、一種爪哇擬青霉菌株，其特征在于所述菌株為爪哇擬青霉菌IJ-N2，菌株保藏號CCTCCNoM208085，2008年6月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述爪哇擬青霉菌株，其特征在于所述爪哇擬青霉菌株屬絲孢目、擬青霉屬。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述爪哇擬青霉菌株，其特征在于所述爪哇擬青霉菌株在査氏培養(yǎng)基上菌落呈層狀，中間隆起的一層邊緣不整齊，土黃色，菌落背面中央白色，外緣淡黃色，瓶?；颗虼蟪芍鶢罨驒E圓形，向上突然變細(xì)，7.5-12.5x2-2.5)mum，2-3個(gè)輪生于分生孢子梗上；分生孢子柱形或長橢圓形，4-6.7xl-1.5mum，呈離散的長鏈。4、一種權(quán)利要求1所述爪哇擬青霉菌株的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備防治粉虱、斜紋夜蛾、紅火蟻、蚜蟲或小菜蛾的藥物中。全文摘要本發(fā)明公開了一種爪哇擬青霉菌株及其應(yīng)用，所述菌株為爪哇擬青霉菌IJ-N2，菌株保藏號CCTCCNoM208085，2008年6月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。所述菌株是從廣西省弄崗自然保護(hù)區(qū)被蟲生真菌自然侵染的小菜蛾蟲體上分離獲得的野生菌株，將野生菌株回接于小菜蛾蟲體上復(fù)壯獲得爪哇擬青霉菌株，對該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株，經(jīng)長期的侵染生物學(xué)研究和室內(nèi)生物測定，爪哇擬青霉對粉虱、紅火蟻、斜紋夜蛾、蚜蟲、小菜蛾等害蟲具有很強(qiáng)的侵染殺蟲效果。文檔編號A01N63/04GK101343614SQ200810029158公開日2009年1月14日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者任順祥,振黃申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)