專利名稱：：一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種雷公藤不定根培養(yǎng)方法，特別是一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，該方法生產(chǎn)的雷公藤不定根中所含的雷公藤甲素和總生物堿相對較高，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對環(huán)境無污染等特點，并且有利于雷公藤自然資源的保護。
背景技術：
：雷公藤(7>i'/^e/y^'i/y77w7/b/Y/h'Hook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，在我國很早以前就用于醫(yī)學和防治各種害蟲，為著名的殺蟲植物之一。民間多用于防治蔬菜害蟲，故有"菜藥"之稱。其對多種害蟲有效。傳統(tǒng)中醫(yī)上可用于治療腫脹、水腫、黃白疽、痢疾等，具有明顯的抗腫瘤、抗風濕作用。雷公藤屬多年生木質藤本、生長緩慢、處于野生狀態(tài)，因用根入藥，大量應用使資源遭到破壞。雷公藤根中的活性成分含量顯著高于其他部位，是主要藥用部位?，F(xiàn)已從中分離出70多種化學成分，其中雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是中藥雷公藤的主要有效成分之一，作為免疫抑制藥物，可應用于許多自身免疫性疾病的治療，同時它又是一種毒性成分。雷公藤生物堿具有明顯的體液和細胞免疫抑制作用，也是治療類風濕性關節(jié)炎的有效成分。在農(nóng)業(yè)害蟲防治中，雷公藤甲素有較好的觸殺活性，雷公藤總生物堿有較好的胃毒毒殺活性和拒食活性。這些有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，在雷公藤植株內(nèi)含量很低，在其他植物內(nèi)的含量更低，雖然可通過化學分離提取獲得產(chǎn)品，但受氣候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季節(jié)等條件的限制，生產(chǎn)受到一定的限制，加上人類對自然的過度開發(fā)，資源受到破壞，提取量很有限。雷公藤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分在國內(nèi)外已進行了大量研究。在國內(nèi)，尹作鴻等人從雷公藤的莖、葉誘導出愈傷組織，并進行了組織培養(yǎng)，從中分離得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜內(nèi)酯化合物。曹華興等(2002年)申請發(fā)明專利提出采用懸浮法培養(yǎng)雷公藤植物細胞而生產(chǎn)雷公藤總生物堿的方法，該方法得到的產(chǎn)物所含雷公藤總生物堿的含量為植物體的2.9倍。在國夕卜，早在1980年美國喬治頓大學生物學DujackLW等采用細胞懸浮培養(yǎng)法，并報告了組織培養(yǎng)中前體的影響。與此同時，加拿大學者J.PKutney等也用雷公藤莖葉進行組織培養(yǎng)成功，把雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯二醇的產(chǎn)最較f中含量分別提高了3倍和16倍，并探索以托品類(Terpenoids)作為前體物促進雷公藤內(nèi)酯二醇的生物合成。MMjsawa等(1982年)報告了用含蔗糖和植物激素的瓊脂對雷公藤進行組織培養(yǎng)結果，經(jīng)培養(yǎng)后的細胞所含雷公藤內(nèi)酯二醇比原植物含量高IO倍。日木KyowaHakkokogyo公司也為組織培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯二醇申請專利。這些對雷公藤細胞培養(yǎng)的研究從不同方面進行了有益的探索，但遠未達到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。而關于雷公藤不定根懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿的方法尚未見到報道。一般來說，植物的次生代謝產(chǎn)物在已經(jīng)分化的組織中含量較高，且器官培養(yǎng)相對比較穩(wěn)定，因此采用苗或根培養(yǎng)的方法是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的另一條途徑。根培養(yǎng)對植物有著特殊的意義，因為許多植物次生代謝物均來自于根部。但工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)根類的實例并不多，韓國目前在高麗參根類培養(yǎng)方面已經(jīng)取得了突破性進展，采用了510t的反應器，并以培養(yǎng)的根為原料開發(fā)了系列產(chǎn)品。用有一定的器官分化的不定根作為懸浮培養(yǎng)的材料，生產(chǎn)其代謝產(chǎn)物，要比細胞培養(yǎng)有效成分要高得多，但不定根的誘導需要克服更多技術上的困難，并非所有植物均可進行不定根誘導。植物細胞全能性的設想于1902年提出，1948年得到了證實，這為進行植物組織培養(yǎng)工作奠定了理論基礎，自從1956年Routine和Nickel首次申請用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的專利以來，應用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生物質的研究取得了很大的進展。大量研究成果證明，通過植物細胞發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生有用的次生代謝產(chǎn)物越來越顯示出巨大的應用潛力。利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物不受地理、季節(jié)變換和各種環(huán)境因素的影響；可節(jié)省土地，降低成本，縮短生產(chǎn)周期；可以提供一種標準化的生產(chǎn)過程，該過程可以連續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)品的質量和產(chǎn)量穩(wěn)定，便于實行工業(yè)化生產(chǎn)，已是解決各種有效成分含量低的植物資源利用的主要途徑。這是本申請的試驗基礎和理論基礎。
發(fā)明內(nèi)容為了保護雷公藤的自然資源，本發(fā)明的目的在于提供由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法。為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，其特征在于，具體包括下列步驟步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體；用洗潔精洗滌并用自來水反復清洗后，流水沖洗2小時，用含70%質量分數(shù)的酒精消毒20s，然后以無菌水沖洗4次，再用lg/LHgCl2消毒4min，無菌水沖洗4次；步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進行愈傷組織誘導，培養(yǎng)基組成為MS+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，pH值為5.8，并在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25土1。C，保持每天12小時的光照，光照強度為10001500lx，2030天后形成愈傷組織；步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，4045天繼代一次，連續(xù)繼代5代，培養(yǎng)基組成為6，7-V+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT;步驟四，挑選生長快、有光澤、質地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5%10%(w/v)，接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細胞系，培養(yǎng)基的組成為NT+1.0mg/L2,4-D十O.5mg/LKT，選擇250mL三角瓶，裝培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C，自然光照，搖床轉速120轉/分鐘，每2530天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲得雷公藤懸浮細胞系；步驟五，用對數(shù)期生長的雷公藤懸浮細胞系，選取直徑在lmm以下、分散性好、顆粒狀雷公藤懸浮細胞系轉接在NT培養(yǎng)基上進行不定根的誘導，接種量為鮮重5g/L10g/L，NT培養(yǎng)基的組成為NT+(0.51.0)mg/L2，4-D+(26)mg/LNAA+(0.10.5)mg/LKT，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生不定根，繼續(xù)培養(yǎng)至45天，有85%的細胞團產(chǎn)生長度為0.5cm3cm的不定根；步驟六，不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時在超凈工作臺上，挑選步驟五誘導的不定根中，根長度為lcm2cm、細胞團直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，進行繼代培養(yǎng)，在步驟五相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系；同時將篩選的生長旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，繼代保存在MS培養(yǎng)基中，35天繼代一次，MS培養(yǎng)基組成為O.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖3040g/L，pH值為5.8;步驟七，對不定根進行生產(chǎn)培養(yǎng)時，在NT培養(yǎng)基中加入0.51.0mg/L2,4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時加入經(jīng)過濾滅菌的AgNO:、(510)mg/L，培養(yǎng)至第50天收獲。本發(fā)明的方法得到的不定根，其中雷公藤甲素和總生物堿的含量分別為根皮粉的13倍和1.8倍，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占5560%，總生物堿產(chǎn)量占6065%。利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對環(huán)境無污染等特點，并且有利于雷公藤自然資源的保護。圖1為本發(fā)明的試驗流程圖；以下結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。具體實施方式參見圖l，依照本發(fā)明的技術方案，由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，具體包括下列步驟1.愈傷組織誘導以雷公藤(7WpZ^T^7'鵬rz7/b/Y/j7Hook,f.)—年生枝條扦插形成的不定根為外植體，用洗潔精洗滌并用自來水反復清洗后，流水沖洗2小時，用含70。/。質量分數(shù)的酒精消毒20s，無菌水沖洗4次，再用lg/LHgCl2消毒4min，無菌水沖洗4次；將不定根的幼根切成O.7cm左右小段，接種在MS+0.51.0mg/L2，4-D+0.10.5mg/LKT培養(yǎng)基上，pH值為5.8，蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度25。Cil。C，每天保持12小時光照，光照強度為10001500lx，2030d后形成愈傷組織。愈傷組織在6,7-V+0.51.0mg/L2，4-D+0.10.5mg/LKT培養(yǎng)基上，40d45d繼代一次，連續(xù)繼代5代。2.懸浮系的建立挑選生長快、有光澤、質地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5%10%(w/v)，接種在NT+(0.51.0)rag/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT培養(yǎng)基上，250mL三角瓶，裝液體培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C+1°C，自然光照，搖床轉速120轉/分鐘，每25d30d繼代一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，獲得雷公藤懸浮細胞系；3.不定根的誘導用對數(shù)期生長的懸浮細胞，選取直徑在lmm以下、分散性好、顆粒狀懸浮細胞系，轉接在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的組成為NT+(0.5(26)mg/LNAA+(0.10.5)mg/LKT，接種量為鮮重(510)g/L，培養(yǎng)30d開始有不定根產(chǎn)生，繼續(xù)培養(yǎng)至40d，85%的細胞團產(chǎn)生長度為0.53cm的不定根。4.不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時在超凈工作臺上，挑選上述誘導的不定根中長度在lcm2cm、細胞團直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，進行繼代培養(yǎng)，在相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系。5.不定根的液體繼代保存將步驟4篩選的生長旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，繼代保存在附加0.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖3040g/L，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，35d繼代一次。6.促進雷公藤甲素和總生物堿合成的培養(yǎng)條件優(yōu)化對不定根進行生產(chǎn)培養(yǎng)時，在NT培養(yǎng)基中加入0.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.l0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時加入510mg/LAgNO:,(過濾滅菌)，培養(yǎng)至第50天收獲。7.不定根、培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿的提取將培養(yǎng)45d的不定根過濾，在6(TC烘干，培養(yǎng)液自然風干至1/3時，按雷公藤甲素的提取方法，如《中草藥》，2005，36(7)，1065-1068記載的方法提取雷公藤甲素，按雷公藤總生物堿的提取方法，如《中國中藥雜志》1995，20(3):145-147記載的方法提取總生物堿。根據(jù)申請人的試驗結果表明，按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的不定根中雷公藤甲素含量為44.76Pg/g，雷公藤總生物堿為3.59mg/g，在過濾細胞后的培養(yǎng)液中雷公藤甲素含量為1.24Pg/mL、總生物堿含量為147.69Jitg/mL。每100mL培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞后，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占55~60%，總生物堿產(chǎn)量占60-65%。雷公藤不定根與根皮粉質量比較僅培養(yǎng)1g不定根得到的雷公藤甲素就為1、根皮粉的13倍，總生物堿的1.8倍。對本發(fā)明所得不定根提取物對小菜蛾3齡幼蟲的殺蟲活性測定表明，其致死中濃(LD5。)是根皮粉的1/2。以下是申請人給出的相關試驗實施例l不定根及培養(yǎng)液中雷公藤甲素、總生物堿含量的測定精密稱取冷凍干燥后的雷公藤根皮粉、不定根1.000g，置磨口三角瓶中，加入乙酸乙酯20mL浸泡過夜，超聲提取40min，過中性氧化鋁柱(含3g中性氧化鋁，玻璃柱d^.Ocm)，然后用20mL乙酸乙酯進行洗脫，合并洗脫液，減壓回收乙酸乙酯至干，用45Q/。甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，待用。培養(yǎng)液提取取培養(yǎng)液100mL，自然風干至1/3時，用乙酸乙酯以1:1的比例在分液漏斗中混合，經(jīng)三次萃取，合并乙酸乙酯相，過中性氧化鋁柱，適量乙酸乙酯洗脫，減壓回收乙酸乙酯至干，用45%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，用于測定雷公藤甲素和總生物堿。雷公藤甲素的含量測定采用高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱C18色譜柱(4.6mmx250mm,5|iim);流動相甲醇水(45:55);流速1mL/min;檢觀!l波長218nm。雷公藤總生物堿含量的測定采用紫外分光光度法，將提取液用45%甲醇稀釋1030倍，用分光光度計在268nm處測定吸光度值。檢測結果(1)根皮粉中雷公藤甲素含量為9.89iig/g，總生物堿為5.01mg/g;(2)雷公藤不定根中雷公藤甲素含量為44.76pg/g，總生物堿為3.59mg/g。每100mL培養(yǎng)基可培養(yǎng)不定根1.31.5g，貝U100mL培養(yǎng)基培養(yǎng)的不定根中雷公藤甲素和總生物堿產(chǎn)量分別為58.188|ig和4.667mg(按1.3g計算)；(3)在過濾不定根后的培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿含量分別為1.24pg/mL和147.69pg/mL。每100mL培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞后，培養(yǎng)液至少60mL(按60mL計算)，則培養(yǎng)液中含雷公藤甲素和總生物堿至少分別為74.4貼禾口8.8814mg。據(jù)上述數(shù)據(jù)計算可得，培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿產(chǎn)量分別各占總產(chǎn)量的56%和65%;培養(yǎng)1g不定根，培養(yǎng)產(chǎn)物中的雷公藤甲素為1g根皮粉的10倍、總生物堿的2倍。實施例2:不定根及培養(yǎng)液提取物對小菜蛾幼蟲生長發(fā)育的抑制活性測定將雷公藤根皮粉、不定根培養(yǎng)物及培養(yǎng)液分別提取，提取物均分別用丙酮定容至(干樣)10mg/mL，待用。取干凈的甘藍葉片分別在前述樣品液中浸漬處理，晾干后分別飼喂試蟲(小菜蛾3齡幼蟲)，以丙酮處理為對照，連續(xù)飼喂72h。每樣品處理重復3次，每重復10頭試蟲。分別于處理后24，48，72h稱量幼蟲體重，計算相對生長率。相對生長率(mg.mg".d"^體重增加量(mg)/[平均體重(mg)x取食時間(d)]。試驗結果表明不同提取物的甘藍葉片飼喂小菜蛾3齡幼蟲后，對幼蟲的生長均有明顯的抑制作用(表1)，各處理組幼蟲的體重、體重增加量和相對生長率均明顯低于對照。其中不定根提取物處理后小菜蛾體重增加量均為負值，24h后部分試蟲死亡，48h后己不再取食，72h后70。/。左右已經(jīng)死亡，存活的已經(jīng)幾乎不動，幼蟲長度僅為對照的1/5左右，體重比試驗前下降了18.33%。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例3:不定根及培養(yǎng)液提取物對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒毒殺活性測定將雷公藤根皮粉及不定根培養(yǎng)物，冷凍干燥后，取lg，加入乙酸乙酯20mL超聲提取40min，過濾后，揮干乙酸乙酯，提取物用丙酮稀釋成1，5，10，25，50，100mg/mL的溶液，培養(yǎng)液提取物稀釋成培養(yǎng)液和丙酮的體積比為l，5，10，20，40，80，100ml/mL，采用葉碟法測定其毒殺活性。采用VisualBasic6.0程序求出毒殺曲線。試驗結果表明不同提取物對小菜蛾3齡幼蟲均具有明顯的毒殺作用(表2)，其中不定根毒殺作用最強，LD5。(致死中濃)為6.72mg/mL，而根皮粉提取物對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒毒殺LD5o為13.13mg/mL，僅為根培養(yǎng)物活性的1/2左右。表2不同類型雷公藤樣品對小菜蛾幼蟲的毒殺作用(48h)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1.一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，其特征在于，具體包括下列步驟步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體，用洗潔精洗滌并用自來水反復清洗后，流水沖洗2小時，用含70％質量分數(shù)的酒精消毒20s，然后以無菌水沖洗4次，再用1g/LHgCl2消毒4min，無菌水沖洗4次；步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進行愈傷組織誘導，培養(yǎng)基組成為MS+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(0.1～0.5)mg/LKT，pH值為5.8，并在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，保持每天12小時的光照，光照強度為1000～1500lx，20～30天后形成愈傷組織；步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，40～45天繼代一次，連續(xù)繼代5代，培養(yǎng)基組成為6，7-V+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT；步驟四，挑選生長快、有光澤、質地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5％～10％(w/v)，接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細胞系，培養(yǎng)基的組成為NT+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT，選擇250mL三角瓶，裝培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+1℃，自然光照，搖床轉速120轉/分鐘，每25～30天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲得雷公藤懸浮細胞系；步驟五，用對數(shù)期生長的雷公藤懸浮細胞系，選取直徑在1mm以下、分散性好、顆粒狀雷公藤懸浮細胞系轉接在NT培養(yǎng)基上進行不定根的誘導，接種量為鮮重5g/L～10g/L，NT培養(yǎng)基的組成為NT+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(2～6)mg/LNAA+(0.1～0.5)mg/LKT，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生不定根，繼續(xù)培養(yǎng)至45天，有85％的細胞團產(chǎn)生長度為0.5cm～3cm的不定根；步驟六，不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時在超凈工作臺上，挑選步驟五誘導的不定根中，根長度為1cm～2cm、細胞團直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，進行繼代培養(yǎng)，在步驟五相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系；同時將篩選的生長旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細胞團的不定根，繼代保存在MS培養(yǎng)基中，35天繼代一次，MS培養(yǎng)基組成為0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA2～6mg/L，KT0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值為5.8；步驟七，對不定根進行生產(chǎn)培養(yǎng)時，在NT培養(yǎng)基中加入0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA2～6mg/L，KT0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時加入經(jīng)過濾滅菌的AgNO3(5～10)mg/L，培養(yǎng)至第50天收獲。全文摘要本發(fā)明公開了一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，該方法以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為原始材料，對外植體進行愈傷組織誘導、繼代培養(yǎng)，建立懸浮細胞系，通過懸浮細胞系誘導不定根，通過不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)、繼代保存、培養(yǎng)條件優(yōu)化，即可用于擴大培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素和生物堿。該方法得到的不定根中雷公藤甲素和總生物堿的含量分別為根皮粉的13倍和1.8倍，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占55～60％，總生物堿產(chǎn)量占60～65％。利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對環(huán)境無污染等特點，并且有利于雷公藤自然資源的保護。文檔編號A01H4/00GK101248757SQ20081001769公開日2008年8月27日申請日期2008年3月13日優(yōu)先權日2008年3月13日發(fā)明者馮俊濤,興張,琰李,王智輝,王永宏申請人:西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心