專利名稱：巨噬細(xì)胞遷移抑制因子拮抗劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
(MIF)的生物活性的方法，該方法包括用于治療炎性疾病和癌癥的治 療方法。
背景
在瘤形成性疾病過程中，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲性質(zhì)的獲得是中心 步驟并且通常是決定性的步驟。雖然對(duì)于運(yùn)動(dòng)性而言正常的、未轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞具有嚴(yán)格的生長因子和粘附性要求，但惡性細(xì)胞通過多種機(jī)制 克服這些要求，所述機(jī)制包括功能癌基因突變的獲得、生長因子受體 過表達(dá)和/或細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的組成性脫調(diào)節(jié)。不一致的是，許多實(shí) 體癌也具有非常低的氧張力(Koong等人，2000b; Buchler等人，2004)。
低氧可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)表達(dá)。已經(jīng)證明，MIF 表達(dá)在惡化前腫瘤、惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤中增加。乳腺、前列腺、 結(jié)腸、腦、皮膚和肺-產(chǎn)生的腫瘤均顯示比它們的非癌性細(xì)胞對(duì)應(yīng)物含 有明顯更高水平的MIF信息和蛋白質(zhì)。MIF表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移潛力密切相關(guān)，這可能暗示MIF對(duì)疾病嚴(yán)重性有重要貢獻(xiàn)。通過刺激 腫瘤依賴性基質(zhì)過程例如新血管形成，MIF間接地與腫瘤生長和進(jìn)展 有關(guān)。同樣，MIF與巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化和存活有關(guān)，并且可在 炎性障礙進(jìn)展中發(fā)揮作用。
因此，某些侵襲性肺瘤在保持最佳生長和進(jìn)展中顯示出對(duì)MIF具 有重要的功能需求。此外，MIF可能在炎性障礙的進(jìn)展中是重要的。 因此，對(duì)于治療癌癥的治療學(xué)發(fā)展而言，MIF可能是一種期望的牝標(biāo)。 這樣，對(duì)于特異地靶向MIF并調(diào)節(jié)一種或多種MIF的生物活性以用 于治療癌癥和炎性障礙的治療分子當(dāng)前仍存在尚未滿足的需求。
本概述列舉了本公開主題的若干實(shí)施方案，并且在許多情況下列 舉了這些實(shí)施方案的變型和替換。本概述僅僅是眾多的和不同的實(shí)施 方案的示例。所給實(shí)施方案的一種或多種典型特征的記載同樣是示例 性的。這種實(shí)施方案通常可以存在或不存在所記載的特征；同樣，這 些特征可以用于本公開主題的其它實(shí)施方案，而不論是否在本概述中
列舉。為避免過度的重復(fù)，本概述未列舉或提出此類特征的全部可能 的組合。
本公開主題提供了化合物，通過使MIF與所述化合物接觸其用于 抑制巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)多肽的生物活性。在一些實(shí)施方案中， 所述化合物具有式(I)結(jié)構(gòu)
其中
各R獨(dú)立地是H、囟素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨基 或羧基；
Ri是H、面素、OH、烴基、取代的烴基或芳基；
R2是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且n是0至5的整數(shù)。
在一些實(shí)施方案中，&是碘。在特別的實(shí)施方案中，該化合物是 4-碘-6-苯基嘧啶或其類似物或衍生物。
在一些實(shí)施方案中，該化合物至少與該MIF多肽的第二個(gè)N-末 端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成穩(wěn)定的相互作用。此外，在一些實(shí)施方 案中，該化合物至少與該MIF多肽的第一個(gè)N-末端殘基上的脯氨酸 (Pro-l)形成穩(wěn)定的相互作用(例如，共價(jià)鍵)。MIF (例如，SEQ ID NO:l) 包含單體A、 B和C的同源三聚體，并且單體A可包含與所述化合物 穩(wěn)定地相互作用的該Met-2 (Met-A2)。在一些實(shí)施方案中，該化合物 進(jìn)一步與該MIF多肽的Lys-32、 Pro-33、 Tyr-36、 His-62、 Ser-63、 He國64、 Lys-66、 Tyr-95、 Met國101、 Val-106、 Trp-108和Phe誦113中 的一個(gè)或多個(gè)形成穩(wěn)定的相互作用。
如本文7>開的，MIF生物活性抑制作用可通過對(duì)HIF-la穩(wěn)定性 的影響導(dǎo)致間接抑制低氧可誘導(dǎo)因子la(HIF-la)生物活性。這樣，在 本公開主題的一些實(shí)施方案中，提供了抑制HIF-la多肽生物活性的 方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使MIF多肽與本文公開的具有 式(I)結(jié)構(gòu)的化合物接觸，其接著導(dǎo)致抑制HIF-la的一種或多種生物 活性。在一些實(shí)施方案中，抑制HIF-la多肽活性抑制了 HIF-la多 肽的轉(zhuǎn)錄活性。此外，在該方法的一些實(shí)施方案中，抑制HIF-la多 肽活性在表達(dá)HIF-la的細(xì)胞例如低氧癌細(xì)胞中抑制了血管發(fā)生、輻 射抗性或此二者。在一些實(shí)施方案中，使該MIF多肽與本文公開的化 合物接觸，聯(lián)合用輻射、化學(xué)治療劑或此二者治療該細(xì)胞。
在本公開主題的一些實(shí)施方案中，提供了抑制或防止細(xì)胞致癌活 性的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使細(xì)胞與本文公開的具有 式(I)結(jié)構(gòu)的化合物接觸。在一些實(shí)施方案中，抑制或防止致癌活性包 括抑制細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、不依賴貼壁生長、血管發(fā)生或 其組合。在一些實(shí)施方案中，抑制或防止致癌活性包括通過該化合物 對(duì)MIF多肽的抑制作用而抑制Rho GTP酶家族成員(例如，Racl和/ 或RhoA)的活性。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，其選自肺癌、頭頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌。 在本公開主題的一些實(shí)施方案中，提供了在受試者中治療癌癥復(fù) 發(fā)或降低癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括給所 述受試者施用有效量的本文公開的具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí) 施方案中，治療該癌包括抑制癌癥的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、不依賴 貼壁生長、血管發(fā)生或其組合。此外，在一些實(shí)施方案中，將該化合 物施用于該受試者，聯(lián)合用輻射、化學(xué)治療或此二者治療該癌癥。在 一些實(shí)施方案中，該化學(xué)治療包括低氧-活化的化合物，例如替拉扎
明。在一些實(shí)施方案中，所述的癌癥是選自以下的癌癥肺癌、頭頸 癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌。
在本公開主題的一些實(shí)施方案中，提供了在受試者中治療炎性障 礙的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括給所述受試者施用有效量 的本文公開的具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述炎性 障礙選自特應(yīng)性皮炎、關(guān)節(jié)炎、增生性血管疾病、急性呼吸窘迫綜合 征(ARDS)、細(xì)胞因子-介導(dǎo)的毒性、敗血病、敗血癥性休克、牛皮癬、 白細(xì)胞介素-2毒性、哮喘、MIF-介導(dǎo)的病況、自身免疫性障礙、腫瘤 生長或血管發(fā)生。此外，在一些實(shí)施方案中，所述的自身免疫性障礙 選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、多發(fā)性硬化癥、移植物 抗宿主病和狼瘡綜合征。
在一些實(shí)施方案中，本公開主題進(jìn)一步提供了包含對(duì)SEQ ID NO:2具有結(jié)合專一性的核苷酸序列的反義多核苷酸。在一些實(shí)施方 案中，該反義多核苷酸是一種小千擾RNA(siRNA)。此外，在一些實(shí) 施方案中，該反義核苷酸序列包含SEQIDNO:3。此外，在一些實(shí)施 方案中，該反義核苷酸序列包括SEQIDNO:4。再進(jìn)一步的，在一些 實(shí)施方案中，本公開主題提供了在細(xì)胞或組織中抑制MIF多肽表達(dá)的 方法，其包括使該細(xì)胞或組織與對(duì)MIF中的靶序列(例如，SEQ ID NO:2)具有結(jié)合專一性的所述反義多核苷酸接觸。
相應(yīng)地，本公開主題的目的是提供MIF拮抗劑以及使用它們的方 法。通過本公開主題完全或部分實(shí)現(xiàn)了此目的。本公開主題的目的已在上文說明，并且其通過本^Hf主題完全或 部分實(shí)現(xiàn)了該目的，在研讀了本公開主題的以下說明、附圖和非限制 性實(shí)例之后，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，其它目的和益處將會(huì)變得明 顯。
附圖簡述


圖1是顯示人MIF的X-射線晶體學(xué)確定的三維結(jié)構(gòu)的圖，其以 同源三聚體的形式存在。
圖2是顯示對(duì)細(xì)胞生長、遷移/侵襲和HIF穩(wěn)定化的MIF依賴性 信號(hào)的建議方案的示意圖。MIF表達(dá)/分泌是由生長因子/細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)誘導(dǎo)的。細(xì)胞外MIF結(jié)合其受體CD74，其與CD44相互作用 (35)。然后活性的CD44可以促進(jìn)RhoA和/或Racl GTP酶活化。在 該RhoA通路中，Rho激酶-依賴性持續(xù)的MAP激酶活化導(dǎo)致細(xì)胞周 期蛋白Dl轉(zhuǎn)錄和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤失活(36)。 MIF刺激的Racl活化可 導(dǎo)致片狀的足形成和MMP產(chǎn)生，使得定向遷移和侵襲(22)。最后， MIF內(nèi)在化以及隨后與CSN5結(jié)合促進(jìn)了低氧-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化。
圖3A-3D顯示了數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)證實(shí)MIF轉(zhuǎn)錄和分泌是通過低氧 而提高的，并且胰腺癌的受試者具有高水平的血漿MIF。圖3A是免 疫印跡的照片，其顯示轉(zhuǎn)染了 NS或MIFsiRNA、孵育48小時(shí)、然后 將細(xì)胞置于常氧或低氧條件下、再在24小時(shí)之后收集的上清液的 MIA-Paca-2細(xì)胞。圖3B是顯示結(jié)果的棒圖，該結(jié)果來自轉(zhuǎn)染的 MIA-Paca-2細(xì)胞，其在低氧或常氧下孵育16小時(shí)，然后由細(xì)胞RNA 合成cDNA，再用于測定MIF轉(zhuǎn)錄物水平的實(shí)時(shí)PCR。圖3C是RNA 印跡(Northern blot)的照片，其顯示了在11^-1( +/+和HIF-la一小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞中的mRNA表達(dá)，所述細(xì)胞用1%低氧和MIF攻擊。 圖3D是顯示通過ELISA評(píng)價(jià)來自評(píng)價(jià)化療治療之前收集的健康供體 和胰腺癌患者的血漿MIF水平的圖。*,學(xué)生氏檢驗(yàn)P〈0.05(雙-尾)。
圖4A-4C顯示數(shù)據(jù)，其證實(shí)MIF的損失導(dǎo)致低氧-誘導(dǎo)的HIF-la 的脫穩(wěn)定化。使來自MIF衰竭細(xì)胞的核和胞質(zhì)提取物暴露于常氧、缺氧(圖4A)或低氧(圖4B)，再進(jìn)行HIF-la免疫印跡。圖4C是顯示暴 露于低氧不同次數(shù)的對(duì)照細(xì)胞和MIF衰竭細(xì)胞的VEGF mRNA水平 的實(shí)時(shí)PCR分析的圖。
圖5A-5C顯示了證實(shí)MIF與CSN5相互作用并且促進(jìn) CSN5/HIF-la相互作用的數(shù)據(jù)。圖5A:使MIA-PaCa-2細(xì)胞用CoCl2 孵育4h，再將提取物通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)MIF、 CSN5和p-肌動(dòng)蛋白 進(jìn)行分析，或者用CSN5抗體進(jìn)行免疫沉淀，再將免疫沉淀物通過 MIF的免疫印跡法對(duì)MIF相互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖5B:將siRNA轉(zhuǎn)染 的MIA-PaCa-2用或不用150^M CoCl2孵育4h。平行獲得全細(xì)胞提取 物和核提取物。使用抗-CSN5使全細(xì)胞提取物免疫沉淀。將核提取物 和共免疫沉淀物通過免疫印跡法對(duì)HIF-la進(jìn)4亍分析。圖5C:將siRNA 轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞用或不用lOpM MG-132孵育6h。獲得全細(xì) 胞提取物和核提取物。使用抗-CSN5使全細(xì)胞提取物免疫沉淀。將核 提取物和共免疫沉淀物通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)HIF-la進(jìn)行分析，同時(shí) 將小部分的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物對(duì)總CSN5進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖6是本公開主題的示例性MIF抑制性化合物4-碘-6-苯基嘧啶 的圖。
圖7是顯示示例性MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶與MIF之間分子
相互作用的計(jì)算^^莫型。注意，該碘基團(tuán)位于Met A2處疏水結(jié)合袋的 底部。
圖8是顯示MIF抑制劑4-碘-6-苯基嗜啶是比3'，4，，7-三羥基異黃 酮更有效的MIF酶抑制劑的圖。將500nM重組MIF (rMIF)與所示抑 制劑濃度預(yù)混合5 (實(shí)心)或IO (空心)分鐘，接著添加2mM終濃度的 L-多巴色素甲基酯底物。5分鐘以后，用分光光度法測定OD 475，互 變異構(gòu)化造成無色的底物。
圖9A-9C是免疫印跡圖，其顯示MIF互變異構(gòu)酶抑制劑以MIF-特異性方式阻斷HIF-1穩(wěn)定化。將細(xì)胞用或不用DMSO或者所示濃度 的MIF拮抗劑4-碘-6-苯基嘧啶(#16)或者Orita化合物3，，4'，7-三羥基 異黃酮(TI)預(yù)處理1小時(shí)，然后用CoC12攻擊細(xì)胞。5小時(shí)以后，分離核溶胞產(chǎn)物，再進(jìn)行HIF-1免疫印跡。在圖9A和9B中，使用 MIA-PaCa胰腺癌細(xì)胞。在圖9C中，評(píng)價(jià)了 MIF十/十和MIF-A小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞。
圖10A和10B是顯示MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶比ISO-l更有 效的圖。在
圖10A中，將500nM rMIF與所示抑制劑濃度預(yù)混合30 秒，接著添加2mM終濃度的L-多巴色素曱基酯底物。5分鐘以后， 用分光光度法測定OD 475 (互變異構(gòu)化造成無色的底物)，再對(duì)所得數(shù) 據(jù)繪圖。在
圖10B中，用所示抑制劑將2 x 105 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染或預(yù)-孵育，或者將DMSO加至膠原包被的轉(zhuǎn)換孔(transwell)腔室的上腔室。 16小時(shí)之后，通過擦洗將上腔室中的細(xì)胞除去，再將膜的底部用結(jié)晶 紫染色，溶解，在OD 570讀數(shù)，再對(duì)所得數(shù)據(jù)繪圖。
圖11是顯示MIF的抑制劑防止不依賴貼壁生長的圖。將105 A549 人肺腺癌細(xì)胞鋪于軟瓊脂中，該軟瓊脂中含有介質(zhì)(0.1% DMSO)，或 者10、 50或100jaM的ISO-l或者4-碘-6-苯基嘧咬(CMPD 16)。 20 天以后，對(duì)菌落染色并計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)代表兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。
圖12是顯示通過MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶抑制NSCLC腫瘤 生長的圖。將Balb/c (nu/nu)小鼠皮下注射1 x 106 A549人肺腺癌細(xì)胞 (4只小鼠/組)。在該項(xiàng)研究的過程中每天腹膜內(nèi)注射介質(zhì)或4-碘-6-苯 基嘧咬(化合物16; 2mg)。如所示的，每第四天通過觸診監(jiān)測腫瘤生 長。結(jié)果以每組無胂瘤小鼠的百分?jǐn)?shù)表示。
圖13是顯示MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶在體內(nèi)抑制MIF的圖。 將C57B1/6小鼠注射玉米油，或者注射混懸在玉米油中的lmg的4-碘-6-苯基嘧啶(# 16)，經(jīng)歷6小時(shí)，然后摘除肝臟。將組織勻化后， 將100mg總肝蛋白的L-多巴色素甲基酯互變異構(gòu)酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖14A-14C是MIF/MIF受體捕捉試驗(yàn)的示意圖(
圖14C)，以及從 該試驗(yàn)收集的數(shù)據(jù)的圖(
圖14A和14B)，其提供了一種用于MIF突變 蛋白和候選抑制劑的結(jié)構(gòu)-功能研究的工具。
圖14C(上圖)顯示了用于 評(píng)價(jià)MIF/MIF受體小分子結(jié)合抑制劑和MIF位點(diǎn)特異性突變體/受體 結(jié)合的捕捉試驗(yàn)的圖解。
圖14A是來自該試驗(yàn)的數(shù)據(jù)圖，在該試驗(yàn)中，將CD74包被的板用所示濃度的天然MIF (MIF)、變性的MIF或PIG MIF預(yù)-孵育，接著添加0.2nM生物素-hrMIF。
圖14B是來自該試驗(yàn) 的數(shù)據(jù)圖，在該試驗(yàn)中，將l.O^M的變性的MIF (dMIF)、天然MIF (MIF)或抗-CD74與可溶性的CD74預(yù)-孵育30min，然后加入0.2nM 生物素-hrMIF。對(duì)于抑制劑，將O.ljuM ISO-1或4-碘-6-苯基嘧定(化 合物16)與0.2pM生物素-hrMIF預(yù)-孵育30min，然后將混合物添加 到CD74包被的板中。在
圖14A和14B中，將板展開2小時(shí)，而后孵 育鏈霉抗生物素蛋白-AP，接著孵育PnPP，再測定OD4os。
圖15是顯示MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶與MIF之間相互作用 的示意圖。
圖16是衍生自4-碘-6-苯基嘧啶的MIF抑制劑化合物候選物的示 意圖。
圖17A和17B是顯示穩(wěn)定表達(dá)MIF siRNA細(xì)胞系顯示出有缺陷 的HIF表達(dá)的印跡照片。使含有亂序(scrambled) siRNA (NS)或者 MIF-特異性寡核苷酸的pSuper (puro)質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到 MIA-PaCa-2細(xì)胞中，再用嘌羅霉素選擇。對(duì)四個(gè)代表性的MIF siRNA 克隆與表達(dá)NS寡核苷酸的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行比較，并且進(jìn)行MIF免疫 印跡(
圖17A)。將NS、克隆7和克隆2用和不用150nM CoCl2處理 6小時(shí)，再通過蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)HIF-la(
圖17B)。
序列表簡述
SEQ ID NO: 1是智人MIF多肽序列。
SEQ ID NO: 2是來自MIF的siRNA靶序列。
SEQ ID NO: 3是MIF-把向的siRNA序列的有義鏈。
SEQ ID NO: 4是MIF-乾向的siRNA序列的反義鏈。
詳細(xì)說明
本公開主題的一種或多種實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在以下所附說明中進(jìn)行 說明。本公開主題的其它特征、目的和益處將根據(jù)該說明、附圖和權(quán)說 利要求而變得明顯。本文指出的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它 參考文獻(xiàn)以其全部內(nèi)容通過引用并入本文。本文公開的一些多核苷酸
和多肽序列與GENBANK 登記號(hào)交叉引用。在GENBANK^數(shù)據(jù)庫 中交叉引用的序列明確地通過引用并入本文，如同它們是存在于 GENBANK⑧或其它公共數(shù)據(jù)庫中的等同或相關(guān)序列。與本文公開的序 列相關(guān)的存在于GENBANK^數(shù)據(jù)庫中的所有注釋也通過引用明確地 并入本文。在有沖突的情況下，將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
許多癌癥是高度攻擊性的，并且產(chǎn)生侵襲性惡性腫瘤。胰腺癌一 種攻擊性和侵襲性癌癥類型的實(shí)例，使人沮喪的是其5年總存活率平 均為3-5% (Garcea等人，2005)。不一致的是，這些攻擊性癌癥據(jù)凈艮道 具有非常低的氧張力(Koong等人，2000b; Buchler等人，2004)。低氧 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF;參見圖l)在癌細(xì)胞中的表達(dá)，并 且在癌癥患者中MIF血漿水平升高。MIF表達(dá)還在正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化 細(xì)胞中通過生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)和致癌刺激物而被正性調(diào)節(jié) (Mitchell等人，1999; Liao等人，2003; Petrenko等人，2003)。
MIF在大量多類的人類肺瘤中過表達(dá)。胰腺、乳房、前列腺、結(jié) 腸、腦、皮膚和肺-產(chǎn)生的腫瘤均顯示與它們的非-癌性細(xì)胞對(duì)應(yīng)物相 比含有明顯更高水平的MIF信息和蛋白質(zhì)(Winner等人，2007; Meyer-Siegler等人，1998; Bando等人，2002; Takahashi等人，1998; Markert等人，2001; Shimizu等人，1999; Kamimura等人，2000)。這 些研究中的幾個(gè)研究還報(bào)道，MIF表達(dá)與腫瘤攻擊性和轉(zhuǎn)移潛力密切 相關(guān)，提示MIF對(duì)于癌癥嚴(yán)重度有重要貢獻(xiàn)(del Vecchio等人，2000; Kamimura等人，2000; Meyer-Siegler等人,2002)。
這樣，嘗試用具有靶向MIF特別是MIF催化活化位點(diǎn)的分子介 導(dǎo)抑制這些MIF-介導(dǎo)的胂瘤表型是合乎需要的。例如，在最近的一份 報(bào)告中，發(fā)現(xiàn)僅在表達(dá)MIF的關(guān)連細(xì)胞表面受體的細(xì)胞中，抗-MIF 小分子抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和異種移植腫瘤生長以及血管供應(yīng)(血 管生成)(Meyer-Siegler等人，2006)。
本公開主題提供了新鑒別的抗-MIF拮抗劑的化合物，它們能夠調(diào)節(jié)MIF生物活性并且呈現(xiàn)出催化活性和生物學(xué)抑制活性，這些活性 比以前測試的化合物強(qiáng)5-10x倍。因此，本公開主題提供了化合物， 使用該化合物抑制MIF生物活性的方法，包括用于治療炎性疾病和癌 癥的治療方法。
I.巨噬細(xì)胞遷移抑制因子
MIF是最早描述的細(xì)胞因子之一，并且是一種具有廣泛多種生物 活性的免疫調(diào)節(jié)蛋白(綜述參見Swope等人，1999; Metz等人，1997; 以及Bucala， 1996)。最初，發(fā)現(xiàn)MIF是由活化的淋巴樣細(xì)胞分泌的， 以抑制巨噬細(xì)胞的隨機(jī)遷移，并且與延遲型過敏反應(yīng)有關(guān)(George等 人，1962; Weiser等人，1981; Bloom等人，1966; David， 1966)。 MIF還 顯示提高巨噬細(xì)胞粘附性、吞噬作用和殺滅腫瘤活性(Nathan等人， 1973; Nathan等人，1971; Churchill等人，1975)。令人遺憾的是，許多 早期MIF研究使用混合培養(yǎng)物上清液，其在后來顯示含有其它細(xì)胞因 子，例如IFN-y和IL-4,其也具有巨噬細(xì)胞遷移抑制活性(McInnes 等人，1988; Thurman等人，1985)。重組體MIF的可得性使得能證實(shí) 這些生物活性以及鑒別額外活性。
重組人MIF最初克隆自人T細(xì)胞庫(Weiser等人，1989)，并且顯 示活化血液產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞，體外殺滅細(xì)胞內(nèi)寄生物和腫瘤細(xì)胞，刺 激IL-1(3和TNFa表達(dá)，以及誘導(dǎo)氧化氮合成(Weiser等人1991; Pozzi等人，1992; Weiser等人，1992; Cunha等人，1993)。雖然從這些 早期報(bào)道中的幾篇報(bào)道中可得到的結(jié)論因在所用的重組MIF制備物 中存在生物活性促有絲分裂污染物而令人困惑，但是MIF的有效促炎 癥活性已在其它未遭受這種復(fù)雜因素的研究中得到確證(綜述于 Bucala， 1996)。
更最近的MIF研究已經(jīng)利用純化形式的重組MIF的生產(chǎn)以及 MIF-特異性多克隆和單克隆抗體的開發(fā)，在各種正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀況 和病理生理狀況下建立MIF的生物學(xué)作用(綜述于Rice等人，1998)。 在這些后期報(bào)道的觀察中，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到MIF不但是一種免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子產(chǎn)物，而且是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)特別是腦垂體的激素樣產(chǎn)物。此
項(xiàng)工作構(gòu)建了 MIF作為糖皮質(zhì)激素(內(nèi)源性釋放的那些和治療施用的 那些)抗炎作用的反謫節(jié)劑的有效活性的基礎(chǔ)，具有這樣的作用，即糖 皮質(zhì)激素限制和抑制炎性反應(yīng)的正?；钚员籑IF抑制。因此，在各種 炎性疾病和病況中，內(nèi)源性MIF應(yīng)答被認(rèn)為是引發(fā)因素或者是惡化因 素(綜述于Donnelly等人1997)。
現(xiàn)在知道，MIF具有幾種其它的超過其^^知的與延遲型過敏反應(yīng) 相關(guān)的生物學(xué)功能。例如，如上文所述，由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞釋放的 MIF對(duì)生理學(xué)濃度的糖皮質(zhì)激素應(yīng)答而充當(dāng)腦垂體的調(diào)節(jié)劑(Bucala， 1996)。這導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素免疫抑制活性經(jīng)由TNF-a、 IL-1(3、 IL-6和 IL-8水平改變的首要作用。MIF的其它生物活性包括受刺激的T細(xì)胞 的調(diào)節(jié)(Bacher等人，1996)、 IgE合成的控制(Mikayama等人，1993)、 p53腫瘤抑制蛋白的功能失活(Hudson等人，1999)、葡萄糖和碳水化合 物代謝的調(diào)節(jié)(Sakaue等人，1999)、以及腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤血管發(fā)生 的弱化(Chesney等人，1999); Shimizu等人，1999)。
本發(fā)明人進(jìn)一步確定，如本文詳細(xì)公開的，對(duì)于由低氧誘導(dǎo)的低 氧可誘導(dǎo)因子(HIF)穩(wěn)定化而言，MIF是必需的。不希望受任何特別 的理論的束縳，經(jīng)由促有絲分裂和致癌通路的MIF表達(dá)可能提供一種 用于低氧-誘導(dǎo)的HIF穩(wěn)定化和隨后的低氧適應(yīng)的設(shè)定點(diǎn)(圖2)。 一旦 穩(wěn)定了 ，隨后HIF可以潛在地支配MIF在發(fā)展的贅生物的低氧區(qū)域 中的過表達(dá)，建立由HIF和MIF組成的擴(kuò)增環(huán)。
與在低氧適應(yīng)中對(duì)MIF的需求相一致，MIF還可在肺瘤相關(guān)的 血管發(fā)生中發(fā)揮作用。特別是，MIF瘤內(nèi)表達(dá)與生血管性生長因子表 達(dá)、腫瘤血管密度和切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)強(qiáng)烈相關(guān)(Ren等人，2005; Wilson等人，2005; Shun等人，2005; Hira等人，2005; Chesney等人, 1999; White等人，2001)。這些發(fā)現(xiàn)與一項(xiàng)研究相符，該項(xiàng)研究證實(shí)， 遭受腺瘤性結(jié)腸息肉病的MIF-缺陷小鼠(ApcM^+) "oncomice"在腺瘤 的數(shù)量和大小上顯示出明顯的減小，這與大大減小的腫瘤微血管密度 相對(duì)應(yīng)(Wilson等人，2005)。MIF與D-多巴色素互變異構(gòu)酶共有明顯的序列同源性(36。/。同一 性)。這導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)MIF具有酶活性，并且催化非生理學(xué)底物D-多巴色 素(Rosengren等人，1996)和L-多巴色素甲基酯(Bendrat等人，1997) 的互變異構(gòu)化。另外，苯基丙酮酸和對(duì)羥基苯基丙酮酸(Rosengren等 人，1997)以及3，4-二羥基苯基胺鉻和去甲腎上腺素鉻(Matsunaga等人， 1999)是MIF底物，盡管不清楚這些藥物的任何一種的互變異構(gòu)化是 否包括MIF的天然功能。
人MIF的三維晶體結(jié)構(gòu)揭示，該蛋白質(zhì)是以同源三聚體形式存在 的(參見
圖1; Lolis等人，1996)，并且在結(jié)構(gòu)上與4-草酰巴豆酸酯 (oxalocrotonate)互變異構(gòu)酶、5-羧曱基-2-羥基粘康酸酯、分支酸變位 酶和D-多巴色素互變異構(gòu)酶(Swope等人，1998; Sugimoto等人1999) 相關(guān)。對(duì)于人MIF和對(duì)羥基苯基丙酮酸之間形成的復(fù)合物，已經(jīng)報(bào)道 了該晶體結(jié)構(gòu)(Lubetsky等人，1999)。已發(fā)現(xiàn)該底物與氨基末端處的疏 水性空穴結(jié)合，并且至少與該亞單位之一中的Pro-l、 Lys-32和Ile-64 相互作用，以及與鄰近亞單位中的Tyr-95和Asn-97相互作用。已報(bào) 道了鼠類MIF與(E)-2-氟-對(duì)羥基肉桂酸酯之間類似的相互作用 (Taylor等人，1999)。 MIF的N-末端脯氨酸(Pro-l)似乎是酶活性的重 要?dú)埢?，因?yàn)橛媒z氨酸代替此脯氨酸(P1S)的定向誘變?nèi)狈-多巴色 素互變異構(gòu)酶活性(Bendrat等人，1997)。類似地，甘氨酸代替脯氨酸 (P1G)的MIF突變體對(duì)于D-多巴色素和HPP互變異構(gòu)酶活性也是無 催化活性(Lubetsky等人，1999; Swope等人，1998)。
盡管在30多年前即首次公開了其活性，但僅在最近才描述了經(jīng)典 的MIF的膜結(jié)合受體(Leng等人，2003)。通過表達(dá)克隆和功能分析， 證實(shí)了 CD74是一種細(xì)胞外MIF的高親和力結(jié)合蛋白(Leng等人， 2003)。已顯示MIF結(jié)合CD74的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其為II型跨膜蛋白， 并引發(fā)MIF-依賴性對(duì)ERKMAP激酶、前列腺素E2 (PGE^產(chǎn)生和細(xì) 胞復(fù)制的信號(hào)。由于CD74的細(xì)胞溶質(zhì)部分小并且不含有經(jīng)典的信號(hào) 結(jié)構(gòu)域或搭架結(jié)構(gòu)域，認(rèn)為CD74/MIF復(fù)合物通過其它細(xì)胞表面分子 再放其活化信號(hào)。 一個(gè)這樣的分子是腫瘤相關(guān)抗原CD44,其是通過硫酸軟骨素化CD74的異型結(jié)合而活化的(Naujokas等人，1993)。最近 根據(jù)Shih等人的報(bào)道現(xiàn)描述，CD44對(duì)于MIF-CD74信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而言是 必需的(Shi等人，2006)(參見圖2)。
最近研究證實(shí)，細(xì)胞外MIF在Rho GTP酶家族成員的穩(wěn)態(tài)活化 中的功能導(dǎo)致細(xì)胞生長和遷移表型(Swant等人，2005; Rendon等人，
2006) 。據(jù)認(rèn)為這些MIF-介導(dǎo)的作用與CD74/CD44引發(fā)的信號(hào)相關(guān)(概 述于圖2)。此外，如本發(fā)明實(shí)施例所示的，本文>^開的MIF抑制性化 合物能夠阻斷MIF對(duì)CD74的結(jié)合，從而抑制近端的由細(xì)胞外MIF 引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
通過酵母2雜交篩選還鑒定了幾種其它蛋白質(zhì)與MIF相互作用 (Jung等人，2001; Wadgaonkar等人，2005; Potolicchio等人，2003; Kleemann等人，2000)。這些蛋白質(zhì)之一 Jabl/CSN5也顯示出物理上 與HIF-la和pVHL直接相互作用(Bemis等人，2004)。過去，已顯示 MIF調(diào)節(jié)CSN5功能，后來顯示調(diào)節(jié)對(duì)p27降解的CSN5-依賴性作用、 JNK活化和AP-l-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄(Kleemann等人，2000)。有趣的是，該 報(bào)告發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外MIF調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CSN5的活性。其作者描述了細(xì)胞外 MIF與細(xì)胞內(nèi)CSN5的結(jié)合，并且推測在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞內(nèi)在化之后， MIF結(jié)合并抑制CSN5-依賴性功能(Kleemann等人，2000)。
本發(fā)明人和同事的研究(Winner等人，2007)以及其它人的研究 (Leng等人，2003)強(qiáng)烈地支持了這樣的推測，即細(xì)胞外MIF能夠功能 性地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Jabl/CSN5功能。此外，實(shí)施例和其它研究中提伊的 數(shù)據(jù)證實(shí)，外源性的MIF能夠挽救由MIF siRNA誘導(dǎo)的HIF脫穩(wěn)定 化，但是小分子抑制劑能夠阻斷細(xì)胞外MIF的作用(Winner等人，
2007) 。不希望受理論的束綽，由于MIF的活性位點(diǎn)抑制劑和中和MIF 單克隆抗體二者都阻斷了 MIF-依賴性的HIF穩(wěn)定化，同時(shí)還阻斷了 MIF/MIF受體結(jié)合，可能這種內(nèi)在化步驟與本公開的MIF抑制性化 合物的抑制活性中的至少一些活性有關(guān)。
II. 定義雖然認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解以下術(shù)語，仍說明以下定義以 便于解釋本公開主題。
除非另有定義，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本公開主 題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 一般理解的相同的含義。雖然相似或等同于本 文公開的那些的任何方法、裝置和物質(zhì)可用于本公開主題的實(shí)施或測 試，現(xiàn)仍描述代表性的方法、裝置和物質(zhì)。
根據(jù)長期的專利法條約，當(dāng)用于本申請(qǐng)(包括權(quán)利要求)中時(shí)，
術(shù)語"a"、 "an"和"the"是指"一個(gè)或多個(gè)"。因此，例如，提及"一個(gè)細(xì) 胞"時(shí)，包括多個(gè)此類細(xì)胞，等等。
除非另有說明，用于本說明書和權(quán)利要求書的表述組分?jǐn)?shù)量、反 應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況下被術(shù)語"約，，修飾。相應(yīng)地， 除非有相反的說明，本說明書和所附權(quán)利要求所述的數(shù)字參數(shù)是近似 值，該近似值可以根據(jù)本公開主題尋求獲得的所需特性而改變。
如本文使用的，當(dāng)提及一個(gè)數(shù)值或者提及質(zhì)量、重量、時(shí)間、體 積、濃度或百分?jǐn)?shù)的量時(shí)，術(shù)語"約"意指包括所具體說明的量的變異 值，在一些實(shí)施方案中為±20%，在一些實(shí)施方案中為±10%，在一些 實(shí)施方案中為±5%,在一些實(shí)施方案中為±1%，在一些實(shí)施方案中為 ±0.5%，在一些實(shí)施方案中為±0.1%，因?yàn)榇祟愖儺愔颠m合于實(shí)施所 7>開的方法。
涉及具體的生物活性分子例如多肽(例如，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 (MIF)或低氧可誘導(dǎo)因子la (HIF-la))的如本文使用的術(shù)語"生物活 性"包括由該分子針對(duì)另一分子或底物的任何生物或酶活性。例如，涉 及MIF時(shí)，"生物活性"包括但不限于Thl淋巴細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用 (Abe等人2001 //附附"朋/ 166:747-53)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(例如，細(xì)胞周期蛋 白Dl表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Liao等人2003 /5,V / C7iew 278:76-81; Swant 等人2005/肌o/C7^w 280:23066-72))、細(xì)胞遷移促進(jìn)作用、細(xì)胞侵襲 促進(jìn)作用、不依賴貼壁生長促進(jìn)作用、血管發(fā)生促進(jìn)作用(Chesney等 人1999 Mo/MW 5:181國91; Shimizu等人1999 5/oc/^附.肌o/^". O 附歸w. 264:751-8; Ogawa等人2000 Q威Aie 12:309-14; White等人2001 /. /麵歸/. 166:7549-55; White等人2003 C7iw. 9:853-60)、 HIF-la表達(dá)的促進(jìn)作用、花生四烯酸代謝、E2F轉(zhuǎn)錄因 子調(diào)節(jié)作用^^1^1110)&Moll 2005 Afo/. CW/17:225-36)、 Rb失活作用 (Liao等人2003/5,V7/C7ie附278:76-81; Swant等人2005/5/o/C7ie附 280:23066-72)和p53抑制作用(Hudson等人1999 / 五;c/7. 190:1375-82; Mitchell等人2002TV"". Jew/. 5W. Z7. & 99:345-50)。涉及MIF時(shí)，"生物活性"還包括酶活性，例如互變異構(gòu) 酶活性。
術(shù)語"癌癥"和"癌細(xì)胞"在本文可互換使用，并且通常是指一組特 征為不受控制的、細(xì)胞異常生長的疾病。在一些形式的癌癥中，該癌
("轉(zhuǎn)移癌")。已觀察到一些難治療性的癌癥形式是極低氧的，并且對(duì) 特殊的治療例如放射治療耐受。如本文公開的，在促進(jìn)若干致癌活性 中MIF發(fā)揮直接或間接的作用，所述致癌活性包括遷移、侵襲、細(xì)胞 存活、不依賴貼壁生長、低氧適應(yīng)和血管發(fā)生，它們有助于癌細(xì)胞存 活、生長和轉(zhuǎn)移。這樣，本公開主題提供了抑制MIF的化合物，其用 于治療敏感性癌癥。例如，本文公開的治療性化合物可用于治療頭頸 癌和胰腺癌，因?yàn)橛捎贖IFla活化這些癌癥是極低氧的。MIF有助于 HIF-lg表達(dá)和活性，并且因此該治療性化合物的MIF-抑制活性能夠 抑制這些癌癥的致癌活性。對(duì)于腫瘤生成來說，腎細(xì)胞癌和前列腺癌 還取決于HIF-la活化，因此MIF-抑制性化合物能夠通過MIF的抑 制作用而抑制這些活性。此外，肺癌(例如，肺腺癌)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 均非常具有轉(zhuǎn)移性，并且對(duì)于轉(zhuǎn)移行為(例如，細(xì)胞侵襲和遷移)來說 需要MIF活性。這樣，在這些癌癥中，MIF-抑制性化合物能夠減小 致癌活性和轉(zhuǎn)移活性。再進(jìn)一步的，對(duì)于致癌活性來說乳腺癌需要細(xì) 胞周期蛋白Dl表達(dá)，并且對(duì)于有效的細(xì)胞周期蛋白Dl表達(dá)來說MIF 是必需的(參見附件)。因此，MIF-抑制性化合物在這些癌癥中同樣能 夠抑制致癌活性和轉(zhuǎn)移活性。
如本文使用的，術(shù)語"有效量"意指足以對(duì)被治療的病況或疾病狀態(tài)提供治療的劑量。該有效量可以根據(jù)受試者、疾病和所實(shí)現(xiàn)的治 療而改變。
"低氧可誘導(dǎo)因子1"或"HIF-1"是一種轉(zhuǎn)錄因子，并且對(duì)于在低氧 條件下包括在癌細(xì)胞中的細(xì)胞存活是重要的。HIF-1是由02和生長因 子-調(diào)節(jié)的亞基HIF-la，以及組成型表達(dá)的HIF-1卩亞基(芳烴受體核 易位體，ARNT)，該二者均屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)-PAS (PER、 ARNT、 SIM)蛋白家族。目前，在人類基因組中，已經(jīng)鑒別了轉(zhuǎn)錄因 子HIF的亞基的三種同工型HIF-1、 HIF-2 (也稱為EPAS-1、 MOP2、 HLF和HRF)和HIF-3。在常氧條件下，HIF-la耙向于泛素化 (ubiquitinylation)，并且通過蛋白酶體迅速地降解。然而，在低氧條 件下，HIF-la部分通過與MIF和/或MIF-調(diào)節(jié)的CSN5相互作用而 被穩(wěn)定化，并且易位于核，在核中它與HIF-1(J雜二聚體化。所得活 化的HIF-1驅(qū)使包括MIF的60個(gè)以上基因轉(zhuǎn)錄，在低氧情況下對(duì)于 細(xì)胞適應(yīng)和存活是重要的。
如本文使用的術(shù)語"炎性障礙"是指與免疫系統(tǒng)相關(guān)的障礙，包括 特征為炎癥的障礙。示例性的炎性障礙包括但不限于特應(yīng)性皮炎、關(guān) 節(jié)炎、增生性血管疾病、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、細(xì)胞因子-介 導(dǎo)的毒性、敗血病、敗血癥性休克、牛皮癬、白細(xì)胞介素-2毒性、哮 喘、MIF-介導(dǎo)的病況、自身免疫性障礙、腫瘤生長或血管發(fā)生。"炎 性障礙"，如本文使用該術(shù)語，包括自身免疫性障礙。示例性的自身免 疫性障礙包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰鳥素依賴性糖尿病、多發(fā) 性硬化癥、移植物抗宿主病和狼瘡綜合征。
術(shù)語"抑制劑"和"拮抗劑"是指抑制多肽例如MIF多肽的生物活 性，即使該生物活性失活或者降低該生物活性的化學(xué)物質(zhì)。
術(shù)語"可操作連接的"和"操作性連接的"是指物理或功能上相關(guān)的 兩個(gè)核酸序列。例如，如果兩個(gè)序列是操作性連接的，或者所處位置 使得該調(diào)節(jié)劑DNA序列將影響該編碼或結(jié)構(gòu)性DNA序列的表達(dá)水 平，則啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)性DNA序列稱為與編碼RNA或多肽的DNA序 列"相關(guān)"。術(shù)語"多核苷酸"是指兩個(gè)或更多個(gè)核酸的聚合物。術(shù)語"核酸" 是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及其呈單-或雙-鏈形式的聚合 物。除非特別限定，該術(shù)語包括含有已知的天然核苷酸的類似物的核 酸，其具有與所參考的核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并且以類似于天然存在 的核苷酸的方式代謝。除非另有說明，特定的核酸序列還內(nèi)含地包括 它們保守改變的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確說 明的序列。特別地，簡并密碼子取代可以通過產(chǎn)生序列而實(shí)現(xiàn)，在該 序列中， 一個(gè)或多個(gè)所選擇的(或全部的)密碼子中的第三位置被混合
的-堿基和/或脫氧肌苷殘基替代(Batzer等人(1991) iVwc/dc爿"V/及es 19:5081; Ohtsuka等人(1985) /丑i》(C7^附260:2605-2608; Rossolini 等人(1994) Afo/CW/iVM^ 8:91-98)。術(shù)語"核酸"或"核酸序列"還可 以與基因、開放讀碼框(ORF)、 cDNA和基因編碼的mRNA互換4吏用。
術(shù)語"多肽"、"蛋白質(zhì)"和"肽"，它們?cè)诒疚闹谢Q使用，是指20 個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸或者氨基酸類似物的聚合物，而不管其大小或功能。 盡管"蛋白質(zhì)"通常用于指相對(duì)較大的多肽，而"肽"通常用于指小的 多肽，在本領(lǐng)域中這些術(shù)語的使用是交錯(cuò)的和變化的。術(shù)語"多肽，，如 本文使用的是指肽、多肽和蛋白質(zhì)，除非另有指明。當(dāng)提及一種基因 產(chǎn)物時(shí)，術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"肽"在本文中互換使用。因此，示 例性的多肽包括基因產(chǎn)物、天然存在的蛋白質(zhì)、同系物、直向同源物、 平行同源物、片斷以及前述的其它等效物、變體和類似物。
如本文使用的，提及MIF的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與本文公開的 化合物之間的相互作用時(shí)，術(shù)語"穩(wěn)定的相互作用"是指部分之間的化 學(xué)相互作用，所述的部分包括但不限于共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵例如范德華 相互作用、靜電力、氫鍵或其組合。特別地，本文公開的是抑制性化 合物(例如，式(I)化合物，包括4-碘-6-苯基嘧咬及其任何類似物和衍 生物)與MIF的氨基酸(例如MIF的Met-2)的相互作用。在蛋氨酸的 情況下，"Met-2，，是指從MIF多肽的N-末端計(jì)數(shù)，MIF多肽(例如， 人MIF (SEQ ID NO:l; GenBank登記號(hào)NP—002406,其全部內(nèi)容通 過引用并入本文))的第二個(gè)氨基酸殘基。同樣地，本文公開的某些MIF的抑制性化合物可以與 一個(gè)或多個(gè)另外的MIF殘基穩(wěn)定地相互作用， 該另外的MIF殘基例如但不限于，"Pro-1"(例如，共價(jià)相互作用)、 "Lys-32"、 "Pro-33，，和"Tyr-36"，其分別是指從MIF N-末端計(jì)數(shù)，人
MIF的第一個(gè)氨基酸(脯氨酸)、第三十二
'第三十六
、第三十三
III. MIF-抑制性化合物
人MIF/HPP和MIF/抑制劑共結(jié)晶結(jié)構(gòu)已鑒定為一種底物-結(jié)合 的疏水性空穴，其位于功能性MIF同源三聚體的兩個(gè)相鄰亞基之間 (Lubetsky等人，1999; Taylor等人，1999)。最初基于此底物結(jié)合位點(diǎn) 合理地設(shè)計(jì)MIF生物活性的小化合物抑制劑的嘗試已提供一些成功， 盡管這些化合物不會(huì)使MIF的生物活性抑制到臨床有效性所期望的 程度。(Senter等人，2002; Lubetsky等人，2002; Dios等人，2002)。不 希望受特定的理論的束綽，本發(fā)明人建立了這樣的理論，即通過以結(jié) 構(gòu)為基礎(chǔ)的抑制劑使此底物結(jié)合位點(diǎn)破裂，能夠有效地抵消MIF與其 細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而阻斷其受體-引發(fā)的信號(hào)(圖2)。其它研究 以在該疏水性袋的側(cè)面發(fā)現(xiàn)的Pro Al殘基為目標(biāo)。然后，本文公開的 結(jié)果表明，靶向位于此底物-結(jié)合的疏水性空穴底部的Met A2殘基會(huì) 產(chǎn)生優(yōu)良的MIF催化和生物抑制劑。
迄今為止報(bào)道(Senter等人，2002; Lubetsky等人，2002; Dios等人， 2002)的MIF生物拮抗劑之一 ISO-l (S，R-3-(4-羥基苯基)-4，5-二氫-5-異噁唑乙酸曱S旨)似乎是最強(qiáng)效的(Lubetsky等人，2002; Nicoletti等人， 2005; Al Abed等人，2005; Meyer-Siegler等人，2006)。研究揭示，此 化合物在高濃度下能夠阻斷MIF-依賴性惡性表型(參見實(shí)施例和 Rendon等人，2006; Meyer-Siegler等人，2006)。 ISO-l抑制前列腺癌 細(xì)胞侵襲、腫瘤體積和血管發(fā)生的能力要求存在關(guān)連MIF受體CD74。
本公開主題提供了結(jié)構(gòu)獨(dú)特的詳細(xì)公開于下文的MIF抑制性化 合物，它們?cè)谧钄郙IF-依賴性酶活性、受體結(jié)合、HIF-lcx穩(wěn)定化、 細(xì)胞遷移和貼壁非依賴性方面比ISO-l和相關(guān)化合物實(shí)質(zhì)上更有效(參見實(shí)施例)。本公開化合物的一個(gè)獨(dú)特方面在于，嘧啶環(huán)負(fù)責(zé)占據(jù)
位于該活性位點(diǎn)底部的Met A2位的具有碘基團(tuán)的活性位點(diǎn)(參見實(shí)施 例)。在阻斷低氧-誘導(dǎo)的HIF-la積累以及隨后的表型方面，本公開的 化合物如同siRNA-介導(dǎo)的MIF的降低(knockdown) —樣有效，并 且比其它MIF拮抗劑化合物更有效3-5x倍。
這樣，本公開主題提供了與MIF形成穩(wěn)定的相互作用的化合物， 并且因此可以抑制MIF的生物活性。在一些實(shí)施方案中，所述化合物 可以至少與該MIF多肽的第二個(gè)N-末端殘基的蛋氨酸(Met-2)形成穩(wěn) 定的相互作用。在特殊的實(shí)施方案中，所述化合物與MIF單三聚物 (monotrimer)的單體A的Met-2形成穩(wěn)定的相互作用。在一些實(shí)施方 案中，所述化合物可以進(jìn)一步與MIF多肽的Pro-l、 Lys-32、 Pro-33、 Tyr陽36、 His畫62、 Ser-63、 Ile-64、 Lys曙66、 Tyr畫95、 Met-101、 Val-106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成穩(wěn)定的相互作用。在特歹未的 實(shí)施方案中，所述化合物與MIF的Pro-l形成共價(jià)鍵。
在一些實(shí)施方案中，所述MIF抑制性化合物具有式(I)結(jié)構(gòu)
其中
各R獨(dú)立地是H、 OH、烴基、取代的烴基、氨基或羧基； Ri是H、卣素、OH、烴基或取代的烴基； R2是H、 OH、烴基、取代的烴基或氨基；并且 n是0至5的整數(shù)。
命名的"R"(例如，R、 Ri和R2)基團(tuán)將通常具有本領(lǐng)域中理解 為與具有該名稱的基團(tuán)相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)，除非本文有另外說明。為了說 明的目的，下文定義了如本文所述的某些代表性的"R"基團(tuán)。這些 定義旨在補(bǔ)充和說明而非排除這樣的定義，即它們對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員而言在考察本公開后將會(huì)是明顯的。
如用于本文的，術(shù)語"烴基"是指d.2(j(包括端值)線性的(即，"直鏈，，)、分支的或環(huán)狀的，飽和或至少部分飽和在某些情況下完全不飽 和的(即鏈烯基和炔基)烴鏈，包括例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、 丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯 基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、甲基丙炔基、丁 炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基基團(tuán)。"分支的"是指一 個(gè)烴基基團(tuán)，其中低級(jí)烴基基團(tuán)例如甲基、乙基或丙基連接于線性的
烴鏈。"低級(jí)烴基"是指具有1至約8個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)(即d-8 烴基)，例如l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8個(gè)碳原子。"高級(jí)烴基"是指 具有約IO至約20個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)，例如IO、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(gè)碳原子。在某些實(shí)施方案中，"烴基"特
別是指d—8直鏈烴基。在其它實(shí)施方案中，"烴基"特別是指d.8支鏈烴基。
烴基可任選地被一個(gè)或多個(gè)烴基取代基取代("取代的烴基")，所 述的取代基可以相同或不同。術(shù)語"烴基取代基，，包括但不限于烴基、 取代的烴基、芳基、囟素、芳基氨基、?；⒘u基、芳基氧基、烴氧 基、烴硫基、芳基硫基、芳基烴基氧基、芳基烴基硫基、羧基、烴氧 基羰基、氧代和環(huán)烴基?？梢匝刂摕N鏈任選插入一個(gè)或多個(gè)氧、硫 或取代或未取代的氮原子，其中所述氮取代基是氫、低級(jí)烴基(本文還 稱為"烴基氨基烴基")或芳基。
因此，如本文使用的，術(shù)語"取代的烴基，，包括如本文定義的經(jīng) 基基團(tuán)，其中該烴基基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)原子或官能團(tuán)被另一個(gè)原子或 官能團(tuán)替代，所述的另一個(gè)原子或官能團(tuán)包括例如，烴基、取代的經(jīng) 基、鹵素、芳基、取代的芳基、烴氧基、羥基(形成羥基烴基，例如
(CH2)n-OH,其中n是l-20)、硝基、氨基、烴基氨基、二烴基氨基、 疏酸根和巰基。
此外，如本文使用的，術(shù)語烴基和/或"取代的烴基"包括"烯丙基" 或"烯丙型基團(tuán)"。術(shù)語"烯丙型基團(tuán)"或者"烯丙基"是指基 團(tuán)-CH2lKX:H2及其通過取代形成的衍生物。因此，術(shù)語烴基和/或取 代的烴基包括烯丙基基團(tuán)，例如但不限于，烯丙基、曱基烯丙基、二-甲基烯丙基等。術(shù)語"烯丙型位置"或"烯丙型位點(diǎn)"是指烯丙型基團(tuán)的 飽和的碳原子。因此，連接于烯丙型位點(diǎn)的基團(tuán)例如羥基或其它取代 基團(tuán)可以稱作"烯丙型"。
術(shù)語"芳基"用于本文是指芳族取代基，其可以是單個(gè)的芳族環(huán) 或者稠合在一起的多個(gè)芳族環(huán)，共價(jià)連接的，或者連接到共同的基團(tuán)， 例如但不限于亞曱基或亞乙基部分。該共同連接基團(tuán)還可以是羰基，
例如在二苯甲酮中的；或者是氧，如在二苯基醚中的；或者氮，如在
二苯基胺中的。術(shù)語"芳基"特別地包括雜環(huán)芳族化合物。該芳族環(huán) 可包括苯基、萘基、聯(lián)苯基、二苯基醚、二苯基胺和二苯甲酮等。在
特殊的實(shí)施方案中，術(shù)語"芳基，，意指包含約5至約10個(gè)碳原子例如5、 6、 7、 8、 9或10個(gè)碳原子并且包括5-和6-元烴和雜環(huán)狀芳族環(huán)的環(huán) 狀芳族。
該芳基基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)芳基取代基取代("取代的芳 基，，)，所述的芳基取代基可以相同或不同，其中"芳基取代基"包括烴 基、取代的烴基、芳基、取代的芳基、芳基烴基、羥基、烴氧基、芳 氧基、芳烴基氧基、羧基、?；?、卣素、硝基、烴氧基羰基、芳氧基 羰基、芳烴基氧基羰基、酰基氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲 ?；?、烴基氨基甲?；?、二烴基氨基甲?；?、芳基硫基、烴基硫基、 亞烴基和-NR，R"，其中R'和R"可以各自獨(dú)立地是氫、烴基、取代的 烴基、芳基、取代的芳基和芳基烴基。
因此，如本文使用的，術(shù)語"取代的芳基"包括如本文定義的芳 基基團(tuán)，其中該芳基基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)原子或官能團(tuán)被另 一個(gè)原子或 官能團(tuán)替代，所述的另一個(gè)原子或官能團(tuán)包括例如，烴基、取代的烴 基、離素、芳基、取代的芳基、烴氧基、羥基、硝基、氡基、烴基氨 基、二烴基氨基、硫酸根和巰基。
芳基基團(tuán)的特別的實(shí)例包括但不限于環(huán)戊二烯基、苯基、呋喃、 塞吩、吡咯、吡喃、吡咬、咪唑、苯并咪唑、異蓬唑、異噁唑、吡唑、 吡噪、三溱、嘧啶、喹啉、異喹啉、吲哚、^t唑等。
一般由式例如下式代表的結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 30</formula>如用于本文的，是指環(huán)結(jié)構(gòu)，例如，但不限于3-碳、4-碳、5-碳、6-碳等脂族和/或芳族的包含取代基R基團(tuán)的環(huán)狀化合物，其中該R基 團(tuán)可以存在或不存在，當(dāng)存在時(shí)， 一個(gè)或多個(gè)R基團(tuán)可以各自在該環(huán) 結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)可用碳原子上被取代。R基團(tuán)的存在或不存在以及 R基團(tuán)的數(shù)目是通過整數(shù)n的值來確定的。當(dāng)n是0時(shí)，該結(jié)構(gòu)是未 取代的，在該環(huán)上的各個(gè)原子僅與環(huán)上的鄰近原子和氫原子連接。例 如，當(dāng)該結(jié)構(gòu)是苯基并且n是零時(shí)，在該苯基環(huán)上的碳原子各自與一 個(gè)氫連接，盡管與有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域結(jié)構(gòu)繪制協(xié)議一致，氫原子未顯示出。 每個(gè)R基團(tuán)，如果多于一個(gè)時(shí)，在環(huán)結(jié)構(gòu)的可用碳上被取代而不是在 另一R基團(tuán)上被取代。例如，以下結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 30</formula>
其中n是0至2的整數(shù)，其包括化合物組，其包含但不限于如下 的化合物
在環(huán)狀的環(huán)結(jié)構(gòu)上表示鍵的虛線顯示該鍵可以存在或不存在于 該環(huán)中。即，在環(huán)狀的環(huán)結(jié)構(gòu)上表示鍵的虛線顯示該環(huán)結(jié)構(gòu)選自飽和 的環(huán)結(jié)構(gòu)、部分飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)和不飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)施方案中，本公開主題描述的化合物含有連接基團(tuán)。如 本文使用的，術(shù)語"連接基團(tuán)"包括化學(xué)部分，例如呋喃基、亞苯基、 噻吩基和吡咯基基團(tuán)，其與兩個(gè)或更多個(gè)其它化學(xué)部分特別是芳基基 團(tuán)連接，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
當(dāng)芳族環(huán)或雜環(huán)狀芳族環(huán)的所命名的原子定義為"不存在，，時(shí)，該命名的原子被直接鍵替代。當(dāng)連接基團(tuán)或間隔基團(tuán)定義為不存在時(shí)， 該連接基團(tuán)或間隔基團(tuán)被直接鍵替代。
"亞烴基"是指直線的或分支的二價(jià)脂肪族烴基團(tuán)，其具有l(wèi)至
約20個(gè)碳原子，例如l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(gè)碳原子。該亞烴基基團(tuán)可以是直線 的、分支的或環(huán)狀的。該亞烴基基團(tuán)還可以任選是不飽和的和/或被一 個(gè)或多個(gè)"烴基取代基"取代。沿著該亞徑基基團(tuán)可以任選插入一個(gè)或 多個(gè)氧、硫或者取代的或未取代的氮原子(本文還稱其為"烴基氨基烴 基")，其中所述的氮取代基是如前文所述的烴基。示例性的亞烴基基 團(tuán)包括亞甲基(-CH廣)；亞乙基(-CHrCH2-)；亞丙基(-(CH2)3-);亞環(huán) 己基(—C6H10-) ;—CH=CH—CH=CH— ;—CH-CH—CH2-; -(CH2)q-N(R)-(CH2)廣，其中q和r各自獨(dú)立地是0至約20的整數(shù)， 例如0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20，并且R是氫或低級(jí)烴基；亞甲基二氧基(-O-CH2-O-); 和亞乙基二氧基(-0-(CH2)2-O-)。亞烴基基團(tuán)可以具有約2至約3個(gè) 碳原子，并且可以進(jìn)一步具有6-20個(gè)碳。
如本文使用的，術(shù)語"?；?是指有機(jī)酸基團(tuán)，其中羧基基團(tuán)的-OH 被另一個(gè)取代基替代(即，如由RCO—表示的，其中R是如本文定義 的烴基或芳基基團(tuán))。這樣，術(shù)語"?；?特別地包括芳基酰基基團(tuán)， 例如乙?；秽捅郊柞＜谆鶊F(tuán)。?；鶊F(tuán)的特別的實(shí)例包括乙酰 基和苯甲酰基。
"環(huán)狀"和"環(huán)烴基"是指非芳族的單-或多環(huán)的約3至約10個(gè)碳 原子例如3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10個(gè)碳原子的環(huán)系統(tǒng)。該環(huán)烴基基 團(tuán)可任選是部分不飽和的。該環(huán)烴基基團(tuán)還可任選被如本文定義的烴 基取代基、氧代和/或亞烴基取代?？梢匝卦摥h(huán)狀烴基鏈任選插入一個(gè) 或多個(gè)氧、硫或者取代或未取代的氮原子，其中該氮取代基是氫、烴 基、取代的烴基、芳基或取代的芳基，由此提供雜環(huán)基團(tuán)。代表性的 單環(huán)環(huán)烴基環(huán)包括，但不限于，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、 環(huán)庚基等。此外，該環(huán)烴基基團(tuán)可任選被連接基團(tuán)取代，該連接基團(tuán)例如如上文定義的亞烴基基團(tuán)，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基等。在 此情況下，該環(huán)烴基基團(tuán)可以指，例如環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基甲基等。 此外，多環(huán)環(huán)烴基環(huán)包括金剛烷基、八氫萘基、萘烷、樟腦、茨烷和 去甲金剛烷基。
"烴氧基"或"經(jīng)氧基烴基"是指烴基-o-基團(tuán)，其中烴基如前文
所述。術(shù)語"烴氧基"如本文使用的可以是指d.2(j (包括端值)直線 的、分支的或環(huán)狀的，飽和的或不飽和的氧代經(jīng)鏈，包括，例如，甲 氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。
"芳基氧基"是指芳基-o-基團(tuán)，其中該芳基基團(tuán)如前文所述，
包括取代的芳基。術(shù)語"芳基氧基"如本文使用的可以是指苯基氧基 或己基氧基，以及烴基、取代的烴基、卣素或烴氧基取代的苯基氧基 或己基氧基。
"芳基烴基"是指芳基-烴基-基團(tuán)，其中芳基和烴基如前文所述， 并且包括取代的芳基和取代的烴基。示例性的芳基烴基基團(tuán)包括千基、 苯基乙基和萘基甲基。
"芳基烴基氧基"是指芳基烴基-O-基團(tuán)，其中該芳基烴基基團(tuán) 如前文所述。示例性的芳基烴基氧基基團(tuán)是爺基氧基。
"二烴基氨基"是指-NRR'基團(tuán)，其中R和R'各自獨(dú)立地是如前 文所述的經(jīng)基基團(tuán)和/或取代的烴基基團(tuán)。示例性的烴基氨基基團(tuán)包括 乙基甲基氨基、二甲基氨基和二乙基氨基。
"烴基氧基羰基"是指烴基-O-CO-基團(tuán)。示例性的烴基氧基羰 基基團(tuán)包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丁氧基羰基和叔丁氧基羰基。
"芳基氧基羰基"是指芳基-O-CO-基團(tuán)。示例性的芳基氧基羰 基基團(tuán)包括苯氧基-和萘氧基-羰基。
"芳烴基氧基羰基"是指芳基烴基-O-CO-基團(tuán)。示例性的芳烴 基氧基羰基基團(tuán)是節(jié)氧基羰基。
"氨基甲?；?是指H2N-CO-基團(tuán)。
"烴基氨基甲酰基"是指R'RN-CO-基團(tuán)，其中R和R'中的一 個(gè)是氫并且R和R'中的另 一個(gè)是如前文所述的烴基和/或取代的烴基。"二烴基氨基甲?；?是指R'RN-CO-基團(tuán)，其中R和R，各自 獨(dú)立地是如前文所述的烴基和/或取代的烴基。
"?；趸?是指?；?O-基團(tuán)，其中?；缜拔乃觥?"酰基氨基"是指?；?NH-基團(tuán)，其中?；缜拔乃?。 "芳?；被?是指芳?；?NH-基團(tuán)，其中芳?；缜拔乃?。
術(shù)語"氨基"是指-NH2基團(tuán)。
術(shù)語"羰基"是指-(c=o)-基團(tuán)。
術(shù)語"羧基"是指-COOH基團(tuán)。
術(shù)語"鹵代"、"鹵化物"或"鹵素"如本文使用的是指氟、氯、 溴和碘基團(tuán)。
術(shù)語"羥基"是指-OH基團(tuán)。
術(shù)語"羥基烴基"是指被-OH基團(tuán)取代的烴基基團(tuán)。 術(shù)語"巰基"是指-SH基團(tuán)。
術(shù)語"氧代"是指前文所述的化合物，其中碳原子被氧原子替代。 術(shù)語"硝基"是指-N02基團(tuán)。
術(shù)語"硫代"是指前文所述的化合物，其中碳或氧原子被硫原子替代。
術(shù)語"硫酸根"是指-S04基團(tuán)。
當(dāng)使用術(shù)語"獨(dú)立地選擇'，時(shí)，所指代的取代基(例如，R基團(tuán)如 基團(tuán)Ri和R2，或者基團(tuán)X和Y)可以相同或者不同。例如，Ri和R2 均可以是取代的烴基，或者Ri可以是氫，并且R2可以是取代的炫基s 等等。
在一些具體實(shí)施方案中，穩(wěn)定地與MIF相互作用并抑制MIF生 物活性的化合物是4-殃-6-苯基嗜啶(參見圖6)或其類似物或衍生物。 基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)(SBDD)，例如，可以用于鑒別具有式I結(jié)構(gòu)的另 外的MIF抑制性化合物。用于有效化合物開發(fā)的SBDD的成功是充 分證明了的。其已促使將50種化合物引入臨床試驗(yàn)并促使眾多藥物獲 得批準(zhǔn)(Jorgensen， 2004)。虛擬篩選是SBDD的一個(gè)方面，并且是一 種計(jì)算技術(shù)，其依靠三維結(jié)構(gòu)能夠預(yù)篩選小分子結(jié)構(gòu)的眾多數(shù)據(jù)庫以考察哪個(gè)符合或?qū)?dock)到所選位點(diǎn)。這對(duì)于目標(biāo)化合物可以減少 實(shí)際物理篩選的許多數(shù)量級(jí)。有許多可用的方法，剛性和柔性對(duì)接 (DOCK (Ewing等人，2001)、 Autodock (Morris等人，1998)、 GOLD (Jones等人，1997)、 Ligandfit (Accelrys)、 Ludi (Accelrys)、 FlexX (Tripos) 、 FlexX-pharm (Tripos) 、 FlexE (Tripos)和 Glide (Schrodinger)，并且有許多使用的計(jì)分或評(píng)級(jí)方法例如FlexX (Rarey 等人，1996)、 SCORE (Ewing等人，2001)、 Chemscore (Eldridge等人， 1997)、Ludi (Bohm， 1992)和PLP (Gehlhaar等人，1995)、GOLD (Jones 等人，1997)和Ligandfit (Venkatachalam等人，2003)。
過去在篩選潛在的MIF抑制劑中的成就是使用N-末端脯氨酸作 為用于抑制作用的中央靶殘基。相反，在一些實(shí)施方案中，本公開主 題使用虛擬篩選策略，該策略集中于鑒別耙向位于MET A2處的蛋氨 酸的化合物(即，MIF單體A，位置2，參照人MIF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，該 MIF由A、 B和C單體組成以形成催化活性三聚體)。本/^開的MIF 抑制性化合物證實(shí)這比以前的成就有顯著差異，其比以前鑒別的MIF 抑制性化合物高效 5x倍。本發(fā)明人集中于該活性位點(diǎn)殘基，部分地 是由于l)它位于鄰近N末端脯氨酸的疏水性結(jié)合袋的底部，該脯氨 酸事實(shí)上位于該口袋的側(cè)面(Sun等人，1996);以及，2)以前的研究顯 示通過插入鄰近于Met A2的單個(gè)氨基酸殘基而使該疏水性底物-結(jié)合 袋破裂，導(dǎo)致酶和生物活性完全喪失(Lubetsky等人，2002)。因此，具 有本公開主題包括的式I結(jié)構(gòu)并具有MIF抑制性質(zhì)的其它示例性化合 物可以使用本公開的新穎的篩選和試驗(yàn)方法而無需要過多試驗(yàn)來確 認(rèn)。
IYi 使用方法
本公開主題提供了如上文詳細(xì)公開的MIF抑制性化合物，其能夠 靶向MIF的催化活性位點(diǎn)并作為MIF生物拮抗劑，與以前描述的MIF 抑制劑相比，其具有數(shù)倍有效的MIF生物學(xué)功能的抑制活性。例如， 在一些實(shí)施方案中，本公開的MIF抑制性化合物能夠以比其它MIF抑制性化合物所需要濃度低5x的濃度抑制低氧-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定 化。不希望受任何特定實(shí)施理論的束縛，本公開的MIF抑制性化合物 顯示出呈現(xiàn)這樣的效能，即與它們阻斷MIF與其細(xì)胞表面受體結(jié)合的 能力緊密相關(guān)。因此，并且再次不希望受理論的束綽，本公開的MIF 拮抗劑的生物抑制活性顯示出至少部分地依賴于它們的防止MIF與 其細(xì)胞表面受體CD74結(jié)合的能力。
這樣，本公開主題提供了抑制MIF多肽的生物活性的方法，其包 括使該MIF多肽與本文公開的MIF抑制性化合物接觸?？赏ㄟ^本公 開化合物抑制的MIF的示例性生物活性包括Thl淋巴細(xì)胞的抑制作 用、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(例如，細(xì)胞周期蛋白Dl表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié))、細(xì)胞遷移促 進(jìn)作用、細(xì)胞侵襲促進(jìn)作用、不依賴貼壁生長促進(jìn)作用、血管發(fā)生促 進(jìn)作用、HIF-lot穩(wěn)定化的促進(jìn)作用、花生四烯酸代謝、E2F轉(zhuǎn)錄因 子調(diào)節(jié)、Rb失活作用和p53抑制作用。
此外，如本文公開的，MIF生物活性抑制作用可以導(dǎo)致低氧可誘 導(dǎo)因子la(HIF-la)生物活性的間接抑制。這樣，在本公開主題的一些 實(shí)施方案中，提供了抑制HIF-la多肽生物活性的方法。在一些實(shí)施 方案中，該方法包括使MIF多肽與本文>^開的MIF抑制性化合物接 觸，其接著導(dǎo)致抑制HIF-la的一種或多種生物活性。在一些實(shí)施方 案中，抑制HIF-la多肽活性抑制了 HIF-la多肽的轉(zhuǎn)錄活性。此外， 在該方法的一些實(shí)施方案中，在表達(dá)HIF-la的細(xì)胞例如低氧癌細(xì)胞 中，抑制HIF-la多肽活性抑制了血管發(fā)生、輻射抗性或此二者。在 一些實(shí)施方案中，使該MIF多肽與本文公開的化合物接觸，聯(lián)合用輻 射、化學(xué)治療劑或此二者治療該細(xì)胞。
IV.A.治療方法
更具靶向MIF例如MIF受體結(jié)合的生物活性的藥物的鑒別可以 代表一種新穎的治療方法以抑制癌細(xì)胞的致癌活性并治療癌癥，該方 法至少部分地通過抑制低氧適應(yīng)而起作用。與此相關(guān)，通過使用本文 公開的MIF抑制性化合物的本公開主題提供了治療方法。本文公開的治療方法包括抑制或預(yù)防細(xì)胞致癌活性的方法、治療癌癥的方法和降
低癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法。此外，本文公開的MIF抑制性化合物可以抑 制與免疫和炎性系統(tǒng)功能相關(guān)的MIF生物活性。因此，本MIF抑制 性化合物可進(jìn)一步用于治療炎性和自身免疫性障礙。
在一些實(shí)施方案中，該治療方法包括抑制或預(yù)防細(xì)胞致癌活性的 方法。該方法包括使細(xì)胞與本文公開的MIF抑制性化合物接觸(例如， 式(I)化合物)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是癌細(xì)胞，其選自肺癌、頭 頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌。
抑制或預(yù)防致癌活性可包括抑制該細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、 不依賴貼壁生長、血管發(fā)生或其組合。突變的癌基因或構(gòu)成性活性生 長因子受體的下游的一組關(guān)鍵效應(yīng)器是Rho GTP酶的家族。如圖2 所示，MIF在Rho家族致癌活性中發(fā)揮作用。在三個(gè)主要家族成員 Rac、 Rho和Cdc42中，認(rèn)為Rac在促進(jìn)和維持4曼襲表型中是最重要 的。例如，除了促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞支架重組以外，Rac對(duì)于非小細(xì)胞 肺癌基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)和后續(xù)的侵襲行為來說也是必需的。因此， 在一些實(shí)施方案中，抑制或預(yù)防致癌活性包括通過該化合物對(duì)MIF多 肽的抑制作用來抑制Rho GTP酶家族成員的活性(例如，Racl和/或 RhoA)。
在本公開主題的一些實(shí)施方案中，提供了在受試者中治療癌癥的 方法或者降低癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括 給所述受試者施用有效量的本文公開的MIF抑制性化合物。在一些實(shí) 施方案中，治療癌癥包括抑制癌癥的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、不依賴 貼壁生長、血管發(fā)生或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述的癌癥是選 自以下的癌癥肺癌、頭頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠 質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌。
在癌癥治療方法的一些實(shí)施方案中，該化合物連同用輻射、化學(xué) 治療或此二者治療該癌癥施用于該受試者。例如，在一些實(shí)施方案中， 用于與本文公開的MIF拮抗劑施用相結(jié)合的該化學(xué)治療法可包括低 氧-活化的化學(xué)治療性化合物。"低氧-活化的"化合物是僅在低氧條件下活化成毒性自由基形式的小分子化合物。如前文所公開的，這種 低氧水平在實(shí)體瘤中是常見的。因此，低氧-活化的化合物優(yōu)先在實(shí)體
瘤的低氧區(qū)域內(nèi)被活化成它們的毒性形式?？梢耘c本文公開的MIF拮 抗劑聯(lián)合施用的低氧-活化的化學(xué)治療性化合物的一個(gè)非限制性實(shí)例 是替拉扎明(3-氨基-1,2，4-苯并三嗪-1，4 二氧化物)。關(guān)于一般性地進(jìn)一 步描述作為癌癥治療劑的替拉扎明和低氧-活化的化合物，參見，例如， Zeman等人(1986) Owo /5,W尸/y;s 12 (7): 1239-42以及
Gandara等人(2002) S函Vi 0,/29 (1 S叩pl 4): 102-9。
如所指出的，MIF生物活性還包括免疫功能調(diào)節(jié)作用，并且MIF 在許多炎性障礙中發(fā)揮作用。這樣，在本公開主題的一些實(shí)施方案中， 提供了在受試者中治療炎性障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法 包括給所述受試者施用有效量的本文公開的MIF抑制性化合物。在一 些實(shí)施方案中，所述炎性障礙選自特應(yīng)性皮炎、關(guān)節(jié)炎、增生性血管 疾病、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、細(xì)胞因子-介導(dǎo)的毒性、敗血病、 敗血癥性休克、牛皮癬、白細(xì)胞介素-2毒性、哞喘、MIF-介導(dǎo)的病況、 自身免疫性障礙、腫瘤生長或血管發(fā)生。此外，在一些實(shí)施方案中， 所述的自身免疫性障礙選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、 多發(fā)性硬化癥、移植物抗宿主病和狼瘡綜合征。然而，可治療的炎性 障礙不限于本文具體公開的那些。
IV.B. 受試者
有關(guān)本公開主題的治療方法，在一些實(shí)施方案中，作為術(shù)語用于 本文的"受試者"是指脊推動(dòng)物受試者。優(yōu)選的脊推動(dòng)物是溫血?jiǎng)游铮?優(yōu)選的溫血脊推動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物最優(yōu)選是人。如本 文使用的，術(shù)語"受試者，，包括人和動(dòng)物受試者。因此，根據(jù)本公開主 題提供了獸醫(yī)治療用途。
這樣，本公開主題提供了用于哺乳動(dòng)物的治療方法，該哺乳動(dòng)物 例如人，以及因?yàn)l于滅絕而重要的那些哺乳動(dòng)物例如西伯利亞虎；有 經(jīng)濟(jì)重要性的那些哺乳動(dòng)物例如在農(nóng)場飼養(yǎng)用于供人消費(fèi)的動(dòng)物；和/或?qū)θ擞猩鐣?huì)重要性的動(dòng)物例如作為寵物祠養(yǎng)或在動(dòng)物園中祠養(yǎng)的動(dòng)
物。此類動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于肉食動(dòng)物例如貓和狗；豬包括豬、 公豬和野豬；反芻動(dòng)物和/或有蹄動(dòng)物例如牛、牛、羊、長頸鹿、鹿、 山羊、野牛和駱駝；以及馬。還提供的是鳥類的治療方法，包括那些
種類的鳥的治療方法，即瀕于滅絕的和/或在動(dòng)物園中飼養(yǎng)的鳥類，以 及飛禽，并且更特別的是家養(yǎng)飛禽，即家禽例如火雞、雞、鴨、鵝、 珍珠雞等，因?yàn)樗鼈儗?duì)人也有經(jīng)濟(jì)重要性。因此，還提供的是牲畜的 治療方法，包括但不限于家養(yǎng)的豬、反芻動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、馬(包括賽 馬)、家禽等。
IV.C. 制劑
根據(jù)本主題方法給受試者施用治療化合物的適宜方法包括但不限 于全身施用、胃腸外施用(包括血管內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)施用)、口月l遞 送、頰遞送、皮下施用、吸入、氣管內(nèi)裝置、外科手術(shù)植入、透皮遞 送、局部注射和高速注射/轟擊(bombardment)。適用時(shí)，連續(xù)輸注可 提高化合物在靶位點(diǎn)的累積(參見例如美國專利6，180，082)。根據(jù)本主 題方法使用的施用的具體模式取決于多種因素，包括但不限于所用的 化合物和/或載體，所治療病情的嚴(yán)重度和化合物施用后的代謝或清除 機(jī)制。
本文公開的治療組合物優(yōu)選包括這樣的組合物，即其包括藥學(xué)可 接受的載體。適宜的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，它們可以 含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、殺菌性抗生素和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使 得該制劑與計(jì)劃的接受者的體液等滲；以及水性和非水性無菌混懸液， 它們可以包括懸浮劑和增稠劑。
用于該方法的組合物可以采取例如這樣的形式在油性或水性介 質(zhì)中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并且可以含有配方劑例如懸浮劑、穩(wěn) 定劑和/或分散劑。或者，該活性成分可以呈粉末形式以用于在使用之 前以適宜的介質(zhì)例如無菌無熱源水構(gòu)建。該制劑可以存在于單劑量或 多劑量容器中，例如密封安瓿和管形瓶中，并且可以以冷凍或冷凍干燥(凍干)條件保存，僅需要在使用之前立即添加無菌液體載體。
對(duì)于口服施用，該組合物可以采用例如片劑或膠嚢劑的形式，它
們通過常規(guī)技術(shù)使用例如以下的藥學(xué)可接受的賦形劑制備粘合劑(例 如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯坑酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑 (例如，乳糖、維晶纖維素或磷酸氫鈞)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑 石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如，土豆淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或潤濕 劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。可以通過本領(lǐng)域公知的方法將片劑包衣。 例如，本文公開的MIF拮抗劑可以配制成pH穩(wěn)定的芯，其具有腸溶 或延釋包衣，該包衣保護(hù)MIF拮抗劑直到它達(dá)到胃腸道中所需位置。
用于口服施用的液體制劑可以釆用例如溶液劑、糖漿劑或混懸劑 的形式，或者它們可以以干燥產(chǎn)物提供以用于在使用之前以水或其它 適宜的介質(zhì)構(gòu)建。此液體制劑可以通過常規(guī)技術(shù)使用例如以下的藥學(xué) 可接受的添加劑制備懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫 化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性介質(zhì)(例如，杏 仁油、油性酯類、乙醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(例如，對(duì)羥 基苯曱酸甲酯或丙酯或者山梨酸)。適合時(shí)，該制劑還可以含有緩沖鹽、 調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于口服施用的制劑可以適宜地配制以給 予控制釋放的活性化合物。對(duì)于頰施用，該組合物可以釆用以常規(guī)方 式配制的片劑或錠劑的形式。
該化合物還可以配制成供植入或注射用的制劑。因此，例如，該 化合物可以用適宜的聚合物或疏水性物質(zhì)配制(例如，配制成在可接受 的油中的乳劑)或者離子交換樹脂配制，或者以微溶性衍生物(例如， 以微溶性鹽)配制。
該化合物還可以配制成直腸組合物(例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)例如 可可脂或其它甘油酯類的栓劑或保留灌腸劑)、乳骨劑或者洗液或者透 皮貼劑。
V. RNA干優(yōu)
本公開主題提供了反義多核苷酸，其具有對(duì)MIF編碼序列的部分的結(jié)合專一性，并且能夠通過使細(xì)胞或組織與該反義多核苷酸接觸而
用于調(diào)節(jié)(例如，抑制)MIF多核苷酸在細(xì)胞或組織中的表達(dá)。在一些 實(shí)施方案中，該反義多核苷酸包括核苷酸序列，其具有對(duì)MIF的多核 苷酸序列CCTTCTGGTGGGGAGAAAT (SEQ ID NO:2)的結(jié)合專一 性。在一些實(shí)施方案中，該siRNA包括有義鏈，該有義鏈包含多核苷 酸序列CCUUCUGGUGGGGAGAAAUdTdT (SEQ ID NO:3)的。此 外，在一些實(shí)施方案中，該siRNA包括反義鏈，該反義鏈包含多核苷 酸序列AUUUCUCCCCACCAGAAGGdTdT (SEQ ID NO:4)的。
術(shù)語"調(diào)節(jié)"如本文使用的可以指改變基因的表達(dá)水平、RNA分子 或編碼一種或多種蛋白或蛋白亞基的等效RNA分子的水平或者一種 或多種蛋白或蛋白亞基的活性被上調(diào)節(jié)或下調(diào)節(jié)，這樣，表達(dá)、水平 或活性高于或低于不存在調(diào)節(jié)劑時(shí)所觀測到的表達(dá)、水平或活性。例 如，術(shù)語"調(diào)節(jié)，，可以意指"抑制，，或"壓制"，但是該詞語"調(diào)節(jié)"的使用 不限于此定義。
術(shù)語"RNA"是指一種分子，其包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基。"核 糖核甘酸"意指在p-D-呋喃核糖部分的2'位具有羥基基團(tuán)的核苷酸。 該術(shù)語包括雙鏈RNA，單鏈RNA，具有雙鏈和單鏈區(qū)域的RNA，分 離RNA例如部分純化的RNA，尤其是純的RNA，合成的RNA，重 組產(chǎn)生的RNA，以及改變的RNA，或類似物RNA，它們因一個(gè)或多 個(gè)核苷酸的添加、缺失、替代和/或改變而不同于天然存在的RNA。 此類改變可包括非-核普酸物質(zhì)的添加，例如添加到siRNA的末端或 內(nèi)部，例如在該RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸處。在本/>開主題的RNA 分子中的核苷酸還可包含非標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸，例如非天然存在的核苷酸 或者化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以稱為類 似物或者天然存在的RNA的類似物。
術(shù)語"反義多核苷酸"可以指"小干擾RNA"、"短干擾RNA"、"小 發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA"、 "siRNA，，和"shRNA",它們可互換使用，并且是指 能夠介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。參見例如Bass 等人，2001; Elbashir等人，2001a;和PCT國際公開Nos. WO 00/44895、<formula>formula see original document page 41</formula>在一個(gè)實(shí)施方案中，該反義多核苷酸是siRNA，并且包含雙鏈多 核苷酸分子，該分子包含互補(bǔ)有義區(qū)和反義區(qū)，其中該反義區(qū)包含與 靶核酸分子的區(qū)域互補(bǔ)的序列(例如，編碼MIF的核酸分子)，這樣， 當(dāng)容許對(duì)該靶核酸分子雜交時(shí)，該siRNA特異性地與該乾核酸分子結(jié) 合。在另一實(shí)施方案中，該siRNA包含具有自我-互補(bǔ)有義區(qū)和反義 區(qū)的單-鏈多核苷酸，其中該反義區(qū)包含與靶核酸分子的區(qū)域互補(bǔ)的 序列。在另一實(shí)施方案中，該siRNA包含具有一個(gè)或多個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)的單 -鏈多核苷酸和包含自我互補(bǔ)有義區(qū)和反義區(qū)的莖，其中該反義區(qū)包含 與靶核酸分子的區(qū)域互補(bǔ)的序列，并且其中該多核苷酸可以在體內(nèi)或 體外被處理而產(chǎn)生活性的能夠介導(dǎo)RNAi的siRNA。如本文使用的， siRNA分子不必限于僅含有RNA的那些分子，但進(jìn)一步包括化學(xué)修 飾的核苷酸和非核普酸。
本公開主題利用了短的、雙鏈RNA分子引起細(xì)胞基因下調(diào)節(jié)(一 種稱為RNA干擾的過程)的能力。如本文使用的，"RNA干擾"(RNAi) 是指一種由小干擾RNA (siRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的 過程。參見Fire等人，1998和美國專利6，506，559，其各自以其全部內(nèi) 容通過引用并入本文。轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程被認(rèn)為是一種在進(jìn)化上 保守的細(xì)胞防御機(jī)制，該機(jī)制已進(jìn)化到防止外源基因的表達(dá)(Fire， 1999)。
RNAi可能已進(jìn)化到保護(hù)細(xì)胞和生物避免產(chǎn)生由某些病毒(特別是 雙鏈RNA病毒或者生命周期包括雙鏈RNA中間物的那些病毒)感染 所致的雙鏈RNA (dsRNA)分子，或者避免通過特異性地將單-鏈RNA
i機(jī)整l到宿主基因e組中。' '
在細(xì)胞中長dsRNAs的存在刺激了酶Dicer(—種核糖核酸酶III) 的活性。Dicer催化dsRNA降解成稱為小干擾RNA (siRNA)的短伸展 的dsRNA (Bernstein等人，2001)。由Dicer-介導(dǎo)的降解產(chǎn)生的該小干擾RNA通常長約21-23個(gè)核苷酸，并且含有約19個(gè)堿基對(duì)雙鏈體。 降解之后，該siRNA摻入到稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的內(nèi) 切核酸酶復(fù)合物中。該RISC能夠介導(dǎo)細(xì)胞中存在的單-鏈RNA的裂 解，所述單-鏈RNA是與siRNA雙鏈體的反義鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。根據(jù) Elbashir等人，靶RNA的裂解發(fā)生在在接近該單-鏈RNA區(qū)域的中間， 所述單-鏈RNA與siRNA雙鏈體的反義鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的(Elbashir等人, 2001b)。
RNAi已描述于若干細(xì)胞類型和生物中。Fire等人，1998描述了 C. e/^fl"s中的RNAi。 Wianny & Zernicka-Goetz， 1999公開了在小鼠 胚胎中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。 Hammond等人，2000能夠通過將 dsRNA轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞中而在果蠅細(xì)胞中誘導(dǎo)RNAi。通過引入合成 的21個(gè)核苷酸RNA的雙鏈體，Elbashir等人2001a證實(shí)了在培養(yǎng)的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在RNAi，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞。
其它研究顯示，siRNA雙鏈體的靶-互補(bǔ)鏈上的5'-磷酸基促進(jìn)了 siRNA活性，并且ATP被用于維持在該siRNA上的5，-磷酸基部分 (Nykanen等人，2001)。當(dāng)引入siRNA分子中時(shí)，可以耐受的其它修 飾包括糖-磷酸基骨架的修飾，或者核苷被氮或硫雜原子中的至少一個(gè) 取代(PCT國際公開WO 00/44914和WO 01/68836)，以及某些核苷酸 修飾，該核苷酸修飾可能抑制雙鏈RNA-依賴性蛋白激酶(PKR)的活 化，特別是2'-氨基或2，-0-甲基核苷酸以及含有2'-0或4，-C亞甲基 橋的核苷酸的修飾(加拿大專利申請(qǐng)2,359,180)。
公開了 dsRNA和RNAi的用途的其它文獻(xiàn)包括PCT國際公開 WO 01/75164 (使用來自果蠅的細(xì)胞的體外RNAi系統(tǒng)和特異性siRNA 分子用于某些功能基因組和某些治療應(yīng)用中的用途)；WO 01/36646 (在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用dsRNA分子抑制特定基因表達(dá)的方法)；WO 99/32619 (將dsRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞以用于抑制基因表達(dá)的方法)；WO 01/92513 (通過使用提高RNAi的因子介導(dǎo)基因抑制的方法)；WO 02/44321 (合成的siRNA構(gòu)造體)；WO 00/63364和WO 01/04313 (抑制多核苷酸序列功能的方法和組合物)；以及WO 02/055692和WO 02/055693 (使用RNAi抑制基因表達(dá)的方法)，其各自以其全部內(nèi)容通 過引用并入本文。
在一些實(shí)施方案中，本公開主題使用RNAi以至少部分地抑制 MIF的表達(dá)。抑制優(yōu)選為正常表達(dá)量的至少約10%。在一些實(shí)施方案 中，該方法包括使靶細(xì)胞與足以抑制MIF表達(dá)的量的反義多核苷酸接 觸。在一些實(shí)施方案中，該靶細(xì)胞存在于受試者中，并且該RNA被 引入該受試者中。
該RNA可具有包含第一鏈和第二鏈的雙鏈區(qū)，所述第一鏈包含 與編碼靶蛋白(例如，MIF)的基因的編碼鏈相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列， 所述第二鏈包含與該第一鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。所述第一鏈和所 述第二鏈相互雜交以形成該雙鏈分子。該雙鏈區(qū)的長度可以為至少15 個(gè)堿基對(duì)；在一些實(shí)施方案中，長度為15至50個(gè)堿基對(duì)；在一些實(shí) 施方案中，該雙鏈區(qū)的長度為15至30個(gè)堿基對(duì)。
在一些實(shí)施方案中，RNA包含通過分子內(nèi)自我雜交形成雙鏈區(qū)的 一條鏈，其優(yōu)選在至少19個(gè)堿基上是互補(bǔ)的。在一些實(shí)施方案中， RNA包含通過分子間雜交形成雙鏈區(qū)的兩個(gè)分離的鏈，其在至少19 個(gè)堿基上是互補(bǔ)的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，任何數(shù)量的適合的普通技術(shù)均可用于 將所述RNA引入到靶細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，編碼該RNA的載 體被引入到該靶細(xì)胞中。例如，該編碼RNA的載體可以轉(zhuǎn)染到該耙 細(xì)胞中，然后該RNA通過細(xì)胞聚合酶而被轉(zhuǎn)錄。
在一些實(shí)施方案中，可以生產(chǎn)包含編碼該RNA的核酸的重組病 毒。然后，將該RNA引入到靶細(xì)胞中包括將該靼細(xì)胞用該重組病毒 感染。細(xì)胞聚合酶轉(zhuǎn)錄該RNA，導(dǎo)致RNA在把細(xì)胞中表達(dá)。工程重 組病毒對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。熟練技術(shù)人員將容易理解， 需要有與選擇適宜病毒和載體組分有關(guān)的多個(gè)因素，以優(yōu)化與本公開 主題使用的重組病毒產(chǎn)生，而不需要在本文作進(jìn)一步的詳細(xì)討論。重 組病毒產(chǎn)生和用途的詳情可以在公開的PCT國際申請(qǐng)
43PCT/US02/22010中找到，其全部內(nèi)容通過引用并入本文?；蛘?，可以 寸吏用用于生產(chǎn)重組病毒的商業(yè)試劑盒，例如pSILENCER ADENO l.O國CMV SYSTEM (Ambion， Austin, Texas, USA)。
實(shí)施例
包括以下實(shí)施例以闡明本公開主題的模式。根據(jù)本公開以及本領(lǐng) 域技術(shù)人員的一般水平，熟練技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅是用 于示例性的，并且可以使用許多變化、修飾和改變而不會(huì)脫離本公開 主題的范圍。
實(shí)施例1
以HIF-la-依賴性方式低氧誘導(dǎo)MIF表達(dá)和分泌 對(duì)低氧張力應(yīng)答增加了 MIF表達(dá)，這已在癌細(xì)胞系中證實(shí)(Bacher 等人，2003; Koong等人，2000a)。由于胰腺癌據(jù)報(bào)道是極低氧的(Koong 等人，2000b)，因此啟動(dòng)研究以調(diào)查在人胰腺癌細(xì)胞系中低氧對(duì)MIF 的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，兩種人胰腺癌細(xì)胞系MIA-PaCa-2(圖3)和PANC-1 對(duì)低氧-誘導(dǎo)的MIF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)敏感。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)經(jīng)歷低 氧環(huán)境時(shí)，MIF分泌(圖3A)和轉(zhuǎn)錄(圖3B)顯著增加。附圖3是來自設(shè) 計(jì)抗人MIF的短干擾RNA (siRNA)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的數(shù)據(jù)。另 外，已發(fā)現(xiàn)來自HIF-la-缺陷小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs) (Ryan等人，1998; Zundel等人，2000)非常耐受低氧-誘導(dǎo)的MIF轉(zhuǎn)錄 (圖3C)。
一般地說，腫瘤低氧已描繪成一種優(yōu)良的肺瘤疾病的預(yù)后指標(biāo) (Ja腦en等人，2005; Me國and Fraker， 2005; Shannon等人，2003)和 胰腺癌，特別是(Koong等人，2000b)。在一項(xiàng)使本公開的體外發(fā)現(xiàn)(圖 3A和3B)與臨床情況相聯(lián)系的嘗試中，接著測定了預(yù)先診斷為胰腺癌 的患者中的MIF血漿水平。建立一項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)正常對(duì)照供體和胰腺 癌患者的血漿樣品中MIF水平，該胰腺癌患者不經(jīng)歷任何癌癥治療。 如圖3D所示，對(duì)照血漿的中間MIF水平為24.8 ng/ml，而胰腺癌患者的平均MIF水平為36.8 ng/ml (P = 0.0382，根據(jù)雙尾學(xué)生氏檢驗(yàn))。 這些結(jié)果首次顯示了血漿中MIF水平與胰腺癌患者之間的正相關(guān)性。
實(shí)施例2
MIF對(duì)于低氧-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化和隨后的轉(zhuǎn)錄是必需的 HIF-la的一些轉(zhuǎn)錄耙可能還調(diào)節(jié)HIF-a的表達(dá)和/或穩(wěn)定化 (Epstein等人，2001; Hagen等人，2003)。實(shí)施例1中的結(jié)果證實(shí)，MIF 是HIF-la基因轉(zhuǎn)錄的乾，并且強(qiáng)烈地由低氧誘導(dǎo)。由于充分證明了 由HIF-la調(diào)節(jié)低氧-誘導(dǎo)的基因表達(dá)，因此研究了經(jīng)由低氧的HIF-la 穩(wěn)定化是否對(duì)MIF的喪失敏感。
將MIF-特異性siRNA轉(zhuǎn)染到MIA-Paca-2細(xì)胞中，然后在0.2% 02 (缺氧)中孵育16小時(shí)。如圖4A所示，通過siRNA缺失MIF導(dǎo)致 細(xì)胞質(zhì)MIF表達(dá)喪失大于90%，同時(shí)對(duì)p-肌動(dòng)蛋白表達(dá)無影響。雖 然在模擬轉(zhuǎn)染的或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中通過缺氧處理而使 HIF-la在細(xì)胞核中有效地^皮穩(wěn)定，缺乏MIF的細(xì)胞在HIF-la穩(wěn)定化 中完全缺乏(圖4A)。為了更充分地研究在低氧-介導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化 中對(duì)于MIF的需求，進(jìn)行評(píng)價(jià)暴露于1% 02(低氧)的含有與缺乏MIF 的胰腺癌細(xì)胞的時(shí)間過程。該發(fā)現(xiàn)揭示，在低氧-介導(dǎo)的HIF穩(wěn)定化 中在所評(píng)價(jià)的全部時(shí)間點(diǎn)對(duì)于MIF有強(qiáng)烈的需求(圖4B)，并且這種需 求是在HIF蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的水平上(還參見Winner等人，2007)。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的低氧-誘導(dǎo)的表達(dá)是腫瘤惡性進(jìn) 程中的關(guān)鍵步驟，并且是多種抗癌模式的靶標(biāo)(Zhong and Bowen， 2006)。由于這種促-血管生成生長因子在刺激腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生中 的效能，已經(jīng)報(bào)道，中斷VEGF的表達(dá)或信號(hào)是抗-致瘤性的 (Grunstein等人，1999; Tsuzuki等人，2000; Graeven等人，2001)。為 了確定低氧-誘導(dǎo)的VEGF轉(zhuǎn)錄否是通過MIF缺失而減弱的，針對(duì)暴 露于低氧不同時(shí)間的MIF足夠或缺乏的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。數(shù) 據(jù)顯示，最大低氧-誘導(dǎo)的VEGF轉(zhuǎn)錄嚴(yán)重依賴于MIF(圖4C)，這可 以解釋為什么MIF對(duì)于肺瘤-相關(guān)的血管發(fā)生而言是如此極端重要的(Chesney等人，1999; Wilson等人，2005; White等人，2001; Shun等人， 2005)。廣義上講，這些研究顯示胰腺瘤形成的潛力一表明總體上是通 過低氧-引發(fā)的信號(hào)影響的(Koong等人，2000b)—可能依賴于MIF的 存在。
實(shí)施例3
MIF在胰腺癌細(xì)胞中結(jié)合CSN5以及MIF缺失導(dǎo)致CSN5結(jié)合和
HIF-la穩(wěn)定化的喪失
由于據(jù)報(bào)道MIF調(diào)節(jié)CSN5功能(Kleemann等人，2000)，并且近 來顯示CSN5對(duì)于低氧3秀導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化而言是必需的(Bemis等 人，2004)，下一個(gè)探索是確定在HIF-la穩(wěn)定化中MIF與CSN5之間 是否有任何功能相關(guān)性。為了確定在胰腺癌細(xì)胞中MIF是否與CSN5 相互作用，由暴露于不同濃度的CoCl2的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行共-免疫 沉淀。如圖5A所示，在全部條件下用在CoCl2存在下觀察到的非常 適度的增量測試，MIF有效地與CSN5共同免疫沉淀。MIF/CSN5相 互作用的增加是非常具有重現(xiàn)性的，并且表明可能有一定水平的影響 MIF/CSN5細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的調(diào)節(jié)作用。
由于CSN5的結(jié)合發(fā)揮作用以功能性穩(wěn)定HIF-la (Bemis等人， 2004),接下來要確定MIF的喪失是否破壞了 HIF-la與CSN5的結(jié)合。 來自未處理的和CoCl2-處理的MIF-足夠和耗竭的細(xì)胞的 CSN5/HIF-la復(fù)合物的共-免疫沉淀揭示，MIF的損失顯著減少了 CSN5與通過PHD抑制作用誘導(dǎo)的HIF-la的結(jié)合(圖5B)。盡管在細(xì) 胞溶胞產(chǎn)物中HIF-la表達(dá)(上圖)與CSN5破壞的HIF-la量(中圖)之 間顯示出顯著差異，在MIF耗竭的細(xì)胞中所觀測到的CSN5/HIF-la 相互作用的喪失僅僅是由于HIF-la穩(wěn)定化的全部喪失這種可能性是 不能排除的。
為解決此問題，將蛋白酶體抑制劑用于人為穩(wěn)定在MIF-含有的和 MIF-耗竭的細(xì)胞中的HIF-la。重要的是，用蛋白酶體-抑制劑處理的 MIF-耗竭的胰腺癌細(xì)胞與含有MIF的細(xì)胞含有等量的穩(wěn)定的HIF-la(圖5C)。該發(fā)現(xiàn)表明了 MIF在調(diào)節(jié)HIF-la蛋白降解中而無轉(zhuǎn)錄和翻 譯的作用。
然后對(duì)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物評(píng)價(jià)CSN5/HIF-la在MG-132-介導(dǎo)的 HIF-la穩(wěn)定的細(xì)胞中的相互作用。有趣的是，MG-132-處理的含有 MIF的細(xì)胞含有顯著量的結(jié)合HIF-la的CSN5，然而MIF-缺乏的細(xì) 胞僅含有小部分的這種CSN5/HIF-la復(fù)合物(圖5C)。值得注意的是， CSN5水平?jīng)]有因MIF狀態(tài)而變化(圖5C)。這些結(jié)果表明了 MIF在 CSN5-依賴性HIF-la穩(wěn)定化中的直接功能作用。
結(jié)合起來，這些發(fā)現(xiàn)揭示了在胰腺癌細(xì)胞中MIF和HIF-la之間 的一種新穎的共-調(diào)節(jié)軸。該數(shù)據(jù)表明，MIF表達(dá)和分泌是通過低氧以 HIF-la-依賴性方式提高的，并且更重要的是，穩(wěn)態(tài)MIF對(duì)于低氧-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化是必需的。該結(jié)果進(jìn)一步表明，MIF通過促進(jìn) CSN5結(jié)合HIF-la而有助于HIF-la穩(wěn)定化，并且這與以前將MIF描 繪成CSN5-生物行為的功能調(diào)節(jié)劑的報(bào)道相符(Kleemann等人， 2000)。
這些研究進(jìn)一步表明，MIF代表了 一種設(shè)計(jì)抗瘤藥理劑的優(yōu)良靶 點(diǎn)。不但MIF對(duì)于確定低氧環(huán)境中的HIF-la穩(wěn)定性是必需的，后續(xù) HIF的穩(wěn)定化發(fā)揮作用增加了 MIF的表達(dá)和分泌，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 性增加以及增殖潛力提高。下一組實(shí)施例公開了對(duì)本公開的-MIF抑制 性化合物的鑒別和測試的研究，并且證明了它們?cè)谧钄嗟脱?誘導(dǎo)的 HIF-la穩(wěn)定化和后續(xù)惡性表型中是有效的。
實(shí)施例4
小分子MIF抑制性化合物的虛擬篩選和測試 唯一報(bào)道的針對(duì)MIF的虛擬篩選使用了早期版本的具有 Advanced Chemistry Development (ACD)庫的DOCK,并且在該庫中 發(fā)現(xiàn)的化合物類似于正常底物，有一些則具有非常高的活性(富集率為 3。/。)(Orita等人，2001)。對(duì)于本研究，設(shè)計(jì)并測試了 一種新穎的能并且在一個(gè)剛性體dock中使用計(jì)算機(jī)程序LUDI (Accelrys, San Diego California, U.S.A.),其考慮了氫鍵供體和接受體以及脂肪族性質(zhì)(參 數(shù)8A半徑，無鍵，或可旋轉(zhuǎn)鍵，保存5000匹配、300最小命中數(shù)， 脂肪族一芳香族的和靜電一檢測選項(xiàng)，使用ACD庫)。轉(zhuǎn)換來自使用 GENFRATM (Accelrys)的 ACD (Elsevier MDL ， San Ramon， California, U.S.A.)的sdf文件，獲得適合于虛擬篩選軟件LUDI的 343,802個(gè)結(jié)構(gòu)的庫(與Orita等人(Orita等人，2001)使用的Dock相 反)。使用最初的三個(gè)能量函數(shù)，并對(duì)手工一致性分值排列成表。排列 前100個(gè)命中化合物，發(fā)現(xiàn)它們中76個(gè)化合物是商業(yè)可得的，并且從 CHEMNAVIGATOR (San Diego, California, U.S.A.; Walters and Murcko，2002)獲得。最初獲得的這76個(gè)化合物中，發(fā)現(xiàn)僅有41個(gè)以 100 |iiM濃度在水溶液中是可溶的?？梢赃M(jìn)一步對(duì)這35個(gè)水不溶性化 合物在較低濃度下測試它們的溶解度和催化抑制活性。最初可溶解的 41個(gè)化合物中，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)抑制純化的重組MIF對(duì)純化蛋白的催化 活性(22.0%成功率(9/41),相比之下在Orita (Orita等人，2001)中為 <3%)。當(dāng)測試這些化合物的包含于全細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的催化活性以評(píng) 價(jià)細(xì)胞環(huán)境中的專一性時(shí)(在Orita的研究中未進(jìn)行)，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)化合 物仍然是抑制性的。發(fā)現(xiàn)有一個(gè)顯示出對(duì)MIF催化活性和生物活性的 優(yōu)良的抑制活性4-碘-6-苯基嘧啶(參見圖6和7)。
Orita和同事鑒別了 524種潛在的抑制劑，并測試了它們的MIF 互變異構(gòu)酶抑制作用。他們發(fā)現(xiàn)，這些化合物中有14種具有MIF酶 抑制劑活性(命中率 2.67%…相對(duì)于目前 20。/。的命中率)，據(jù)報(bào)道 Kj值范圍為0.038至7.4 nM。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本新穎的虛擬篩選方法 以及使用它鑒別的化合物，與在早先篩選中鑒別的最有效的抑制劑對(duì) 照測試該鑒別的化合物。從兩個(gè)獨(dú)立的公司獲得此化合物3，，4，，7-三羥 基異黃酮(TI4艮道的Ki為38nM)，并與三個(gè)目前-鑒別的化合物比較。 令人意外的是，雖然已報(bào)道TI具有38 nM的Ki，由本發(fā)明人和同事 進(jìn)行的該分析結(jié)果顯示，與兩個(gè)本公開化合物所要求和所呈現(xiàn)的類似 抑制活性相比，3，，4，，7-三羥基異黃酮弱若干數(shù)量級(jí)。此外，發(fā)現(xiàn)4-碘-6-苯基嘧啶(在實(shí)施例和圖中亦稱為化合物#16)具有比3，，4，，7-三羥基 異黃酮(TI)低5x的IC50 (16 ~ 5 nM對(duì)TI ~ 25pM)(圖8)。應(yīng)當(dāng)指出， 兩種商業(yè)來源的3，，4，，7-三羥基異黃酮均獲得了相似結(jié)果。此發(fā)現(xiàn)表 明，目前-鑒別的MIF拮抗劑4-碘-6-苯基嘧啶是迄今為止報(bào)道的最強(qiáng) 效的MIF抑制劑。可以相信，結(jié)合本文描述的其它數(shù)據(jù)，這驗(yàn)證了新 穎的本公開的計(jì)劃用于鑒別新穎MIF小分子抑制劑的虛擬篩選方法。
實(shí)施例5
小分子MIF催化性抑制劑以MIF-特異性方式阻斷HIF-la穩(wěn)定
化
如上文指出的(參見圖4)，已經(jīng)確定MIF對(duì)于胰腺癌細(xì)胞的低氧 和脯氨酰羥化酶抑制劑-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化以及隨后的低氧適應(yīng)是 必需的。下面測試MIF藥理抑制劑是否能夠重現(xiàn)我們已經(jīng)使用MIF siRNA所觀測到的對(duì)HIF-la的脫穩(wěn)定化作用(圖4)。除了測試該新確 定的MIF拮抗劑4-碘-6-苯基嘧啶(也稱為"化合物#16")，還測試了在 Orita篩選中鑒別的TI化合物(圖8)。當(dāng)以極高濃度使用時(shí)(IOO -圖9A)，由化合物弁16對(duì)MIF的抑制作用完全抑制了胰腺癌細(xì)胞中由 CoCl2 (—種脯氨酰羥化酶抑制劑)誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化。
同是在此MIF抑制作用的生物分析中被相似地觀測到。如圖9B所示， 4-碘-6-苯基嘧啶以劑量依賴性的方式抑制HIF-la穩(wěn)定化，并且在 IOjiM下抑制HIF-la接近對(duì)照的50%。相反，3，，4，，7-三羥基異黃酮 在10jiM下顯示無抑制活性，并且在50pM下僅有輕微的抑制活性。 眾所周知，這種在生物抑制活性中-5倍的差異近似地對(duì)應(yīng)于催化抑制 活性中 5倍的差異，這是在比較這兩種化合物時(shí)觀測到的(圖8)。重 要應(yīng)指出的是，對(duì)CoClr誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)和分泌觀測到類似的抑制 作用(由ELISA測定)，在50pM下#16抑制大于PHD抑制劑i秀導(dǎo)的 VEGF的80%,相比之下用TI對(duì)VEGF大約有20%降低。有趣的是， ISO-l也能夠抑制由CoCh誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化，但是在100 |iiM或更高濃度下僅適當(dāng)有效，這與其酶抑制活性極其密切相關(guān)(
圖10)。
最后，為了驗(yàn)證#16對(duì)HIF-la抑制作用的作用是通過其對(duì)MIF 的抑制作用，對(duì)含有MIF的細(xì)胞和MIF-缺乏的細(xì)胞測試抑制活性。 如圖9C所示，#16有效地阻斷MIF+/+鼠類胚胎成纖維細(xì)胞中的 HIF-la穩(wěn)定化，而MIF一成纖維細(xì)胞未受MIF抑制劑影響。不希望 受理論的束繂，此發(fā)現(xiàn)可能因以下兩原因而有重要意義l)這證實(shí)了 MIF對(duì)化合物#16的特異性和，2)這提供了一種另外的和有用的篩選 工具，以評(píng)價(jià)#16的同類物以及其它新鑒定有效的小分子MIF抑制刑 的MIF特異性。
結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)表明新類型的間接的HIF-a抑制劑的鑒別。 由于它在給予低氧適應(yīng)以及所致的攻擊性和轉(zhuǎn)移表型中的核心重要 性，因此現(xiàn)在有一種巨大的推力來鑒別HIF-a的小分子抑制劑。本發(fā) 現(xiàn)表明，靶向MIF的小分子代表了一種抑制此重要轉(zhuǎn)錄因子的獨(dú)特 的、間接的方式。
實(shí)施例6
MIF拮抗劑抑制MIF-依賴性細(xì)胞遷移和不依賴貼壁生長 以上實(shí)施例證實(shí)，與目前-鑒別的MIF抑制性化合物相比，以前 描述的催化性MIF抑制劑(例如，3'，4，，7-三羥基異黃酮一圖8和9)的 原型是一種更小有效性的MIF的作用的催化和生物抑制劑。接下來對(duì) 照目前-鑒別的MIF抑制性化合物并且特別是4-碘-6-苯基嘧啶來評(píng)價(jià) 原型MIF生物抑制劑(ISO-l)。 ISO-l是一種充分表征的MIF的體外 和體內(nèi)生物作用抑制劑(Lubetsky等人，2002; Nicoletti等人，2005; Al Abed等人，2005; Meyer-Siegler等人，2006)。根據(jù)本發(fā)明人和同事的 最近研究(Rendon等人，2006)以及其它實(shí)驗(yàn)室的研究(Ren等人，2006; Sun等人，2005; Ren等人，2005; Meyer-Siegler等人，2006)提示，MIF 對(duì)于最大的肺瘤細(xì)胞遷移/侵襲是必需的，并且ISO-l抑制了 MIF-依 賴性細(xì)胞遷移和不依賴貼壁生長(Rendon等人，2006; Meyer-Siegler等 人，2006)。這樣，對(duì)照ISO-l測試了 4-碘-6-苯基嘧啶(本文還稱其為"化合物#16")，并且確定了對(duì)MIF的催化活性和生物活性的相對(duì)抑制作 用。如
圖10所示，化合物#16的ICsn在酶和遷移抑制作用方面比ISO-l 低10x倍(ISO-l在IOjiM下完全無活性)，這表明此種分子與ISO-l 相比是一種明顯更有效的和更有活力的IF拮抗劑。重要的是，這些遷 移抑制作用結(jié)果與在MIA-PaCa-2胰腺癌細(xì)胞中以相同方式進(jìn)行時(shí) 幾乎相同。
接下來測試和比較ISO-l和#16抑制肺腺癌不依賴貼壁生長的相 對(duì)能力。如
圖11所示，ISO-l和化合物#16均抑制A549軟瓊脂生長， 但是發(fā)現(xiàn)#16比ISO-l更有效5-10倍(類似于來自
圖10的ICs。數(shù)據(jù))。 這一發(fā)現(xiàn)是重要的，不但是因?yàn)樗?yàn)證了在惡性疾病干涉中MIF的小 分子耙向性的用途，而且因?yàn)樗b別了一種新型的、與任何其它報(bào)道 的化合物相比更有效的MIF抑制劑。
在一項(xiàng)設(shè)計(jì)用于評(píng)價(jià)抗-MIF化合物的體內(nèi)效能的研究中，在人非 小細(xì)胞肺癌(NSCLC)長出的異種移植模型中測試了 4-碘-6-苯基嘧啶 (化合物#16)。由于發(fā)現(xiàn)化合物#16抑制A549的貼壁非依賴性(
圖11)， 猜測肺瘤長出將類似地被抑制。如
圖12所示，雖然在第16天開始介 質(zhì)處理的小鼠發(fā)展為皮下腫瘤病變，但用化合物16處理的小鼠仍然無 肺瘤。這些數(shù)據(jù)表明，化合物#16以及本文公開的相關(guān)式I化合物是 能夠遞送的并且事實(shí)上能夠抑制肺瘤長出。
還完成了一項(xiàng)確定化合物#16的MTD和體內(nèi)抑制活性的研究。每 組使用2只小鼠，發(fā)現(xiàn)每天注射(持續(xù)7天)0.5、 1、 2和4mg劑量(分 別為25、 50、 100和200mg/kg)的4-碟-6-苯基嘧啶顯示無明顯的毒性。 接下來分析化合物#16的體內(nèi)酶抑制作用。發(fā)現(xiàn)單次一次性注射 50mg/kg的4-碘-6-苯基嘧啶，在注射后6小時(shí)，抑制內(nèi)源性肝MIF 酶互變異構(gòu)酶活性大于50%(
圖13)。結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)證實(shí)，本公 開的MIF拮抗劑(以4-碘-6-苯基嘧啶為例)在體內(nèi)研究中安全并且有 效，并且與原型MIF小化合物抑制劑ISO-l更有效約10倍。此外， 通過本新穎的虛擬篩選和系統(tǒng)測試方法，本文〃^開的式I的本MIF抑 制性化合物的發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了本方法和試驗(yàn)設(shè)計(jì)用于鑒別其它MIF小分子抑制劑。
實(shí)施例7
MIF抑制劑阻斷MIF/MIF受體相互作用 如前文所指出的，小分子拮抗劑阻斷MIF生物功能的能力需要阻 斷MIF結(jié)合其細(xì)胞表面受體(Meyer-Siegler等人，2006)。已設(shè)計(jì)高通 量試驗(yàn)以研究MIF的抑制劑結(jié)合其細(xì)胞表面受體CD74 (Leng等人， 2003)。捕捉試驗(yàn)是基于生物素化的人重組MIF (hrMIF)配體結(jié)合 CD74的細(xì)胞外MIF結(jié)合域的結(jié)合(參見
圖14C)。
為評(píng)價(jià)MIF/MIF受體相互作用的有效抑制劑，使生物素化的MIF 與MIF特異性抑制劑或未標(biāo)記的MIF共-孵育。在未標(biāo)記的MIF的 情況下，這還提供了簡單的試驗(yàn)方法以測定位點(diǎn)特異性突變體的相對(duì) MIF受體結(jié)合能力，為了結(jié)構(gòu)-功能研究，可以構(gòu)建該突變體。
通過舉例，
圖14A和14B顯示了兩種捕獲分析法試驗(yàn)，其證實(shí) l)在Pro-1處突變的MIF蛋白質(zhì)的部分缺陷的CD74結(jié)合，已知其是 酶和生物功能所需的(Sw叩e等人，1998)(
圖14A);以及，2)化合物16 和ISO-1非常有效地阻斷MIF/sCD74(
圖14B)。注意
圖14B中描述的 試驗(yàn)，針對(duì)使用的0.2pM生物素化的MIF，由于僅使用O.lpM MIF 拮抗劑，對(duì)于此分析可能的最大抑制作用為50%。這樣，化合物#16 以最高可能的百分?jǐn)?shù)抑制MIF受體結(jié)合(即50%)。還應(yīng)注意的是在阻 斷MIF/MIF受體相互作用中化合物#16比ISO-1的增加的效能。此捕 捉試驗(yàn)顯然是一種非常有價(jià)值的工具，使用該工具研究酶活性和生物 活性之間的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。此外，測試突變體MIF蛋白的結(jié)合研究 可以揭示以氨基酸殘基，用該殘基修飾用于小分子MIF耙向篩選。預(yù) 期從候選化合物測試與偶合所收集的受體結(jié)合數(shù)據(jù)結(jié)合那些來自個(gè)別 點(diǎn)突變蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)能夠使人們修飾和擴(kuò)展在MIF活性位點(diǎn)中的氨 基酸殘基乾。
實(shí)施例1-7的討論在整個(gè)腫瘤發(fā)生中所有實(shí)體瘤均需要微環(huán)境適應(yīng)。此適應(yīng)性應(yīng)答
的標(biāo)志之一是瘤內(nèi)低氧的產(chǎn)生，其刺激了 HIF-定向的促-致瘤性的/血 管生成性基因的表達(dá)。本發(fā)現(xiàn)確立這些基因產(chǎn)物之一 MIF在胰腺癌患 者中升高，并且代表了細(xì)胞外細(xì)胞因子/生長因子MIF與轉(zhuǎn)錄因子 HIF-1 a之間獨(dú)特的功能相互關(guān)系的 一種組分。這一點(diǎn)被本數(shù)據(jù)證實(shí)， 該數(shù)據(jù)顯示，缺乏MIF的細(xì)胞或者用小分子MIF拮抗劑處理的那些 細(xì)胞耐受低氧和PHD抑制劑-誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化以及隨后的代謝 性和血管生成性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄。由于HIF表達(dá)被描述為直接促進(jìn)腫 瘤攻擊性，并且據(jù)報(bào)道胰腺癌是極低氧的(Koong等人，2000b)，可能 的是MIF功能性促進(jìn)腫瘤維持、環(huán)境適應(yīng)和最終的預(yù)后。因此，本公 開的MIF拮抗劑代表了新一類的間接的HIF-la拮抗劑和抗癌劑。
實(shí)施例8
鑒別另外的對(duì)MIF受體結(jié)合/催化活性以進(jìn)一步優(yōu)化針對(duì)MIF的 計(jì)算虛擬篩選所必需的氨基酸
構(gòu)建若干MIF重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，其含有單獨(dú)的點(diǎn)突變，以評(píng)價(jià) 它們對(duì)于MIF生物學(xué)(體外受體結(jié)合)與催化作用的相對(duì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān) 系。為鑒別新穎的、更有效的MIF抑制劑，可以進(jìn)行虛擬篩選，集中 于發(fā)現(xiàn)對(duì)受體結(jié)合和/或催化功能必需的那些氨基酸。由18，000，000多 個(gè)化合物組成的若干虛擬庫可以被計(jì)算篩選。
在人M/F #在,法#并^^^^1產(chǎn)蠱。MIF的三維結(jié)構(gòu)的重新研 究揭示，有若干充分保守的氨基酸殘基環(huán)繞MIF的底物結(jié)合袋或者在 該袋中，該氨基酸殘基可以直接影響MIF/底物相互作用，或者可以想 到可能修飾該結(jié)合袋性質(zhì)。已報(bào)道的對(duì)于底物結(jié)合MIF而言重要的殘 基包括來自一個(gè)MIF單體的Pro-l、 Lys-32、 Ile-64以及來自鄰近 一個(gè)的Tyr-95、Asn-97 (Lubetsky等人，1999)。本發(fā)明人和同事由MIF/ 底物結(jié)合袋的結(jié)晶結(jié)構(gòu)已鑒別了許多其它殘基，它們對(duì)于底物/受體的 對(duì)接或結(jié)合有潛在的重要性。它們包括殘基Met-2、 Pro-33、 Tyr-36、 His-62、 Ser-63、 Lys-66、 Met-lOl、 Val-106、 Trp-108和Phe-113。有趣的是，除Met-101以外，這些殘基在許多物種中并且在某些情況 下，在MIF遠(yuǎn)親D-多巴色素互變異構(gòu)酶之間是極端充分保守的(Swope 等人，1998)。
所有的位點(diǎn)特異性突變可通過使用QUICKCHANGE 定點(diǎn)誘變 試劑盒(Stratagene，La Jolla， California, U.S.A.)進(jìn)行。簡而言之，可以 4吏PCR引物對(duì)含有目標(biāo)突變，并且pETllb/MIF原核表達(dá)質(zhì)粒 (Bernhagen等人，1994)的PCR擴(kuò)增根據(jù)制造商描述的執(zhí)行。所有為 突變而靶向的殘基可以用丙氨酸代替目標(biāo)氨基酸，并且所有突變體可 以通過測序來驗(yàn)證。
對(duì)于每個(gè)突變體，可以如所描述的(Bernhagen等人，1994)來表達(dá)、 純化和重折疊MIF酶。相對(duì)酶活性可以如緊接著的下文描述來評(píng)價(jià)， 并且CD74結(jié)合研究可以如下文描述來確定。這些突變的數(shù)據(jù)可用于 鑒別MIF的關(guān)鍵殘基，其將被靶向到先導(dǎo)抗-MIF小分子拮抗劑中。 該信息能夠進(jìn)一步優(yōu)化虛擬篩選，以及通過構(gòu)建現(xiàn)有化合物以包括與 這些殘基的相互作用，顯示化學(xué)合成將會(huì)靶向的另外位點(diǎn)。
多S^,^^^游雜浙定法。在MIF特異性生物測定法中測試候 選化合物之前，所有鑒別的拮抗劑可以針對(duì)它們各自在多巴色素互變 異構(gòu)酶測定法中抑制MIF-依賴性催化活性的能力來篩選。MIF催化 和抑制研究可根據(jù)描述的(Lubetsky等人，2002)執(zhí)行。簡而言之，通過 用高碘酸鈉如以前描述的(Dios等人，2002)將L-3，4-二羥基苯丙氨酸甲 酯(Sigma， St. Louis， MO)氧化，可以以2.4 mM制備L-多巴色素曱基 酯。通過將多巴色素甲基酯(0.3 ml)加至在50mM磷酸鉀緩沖溶液、 pH 6、 0.5mM EDTA中的含有500nM rMIF (Bernhagen等人，1994) 的比色皿中，5分鐘以后用分光光度法測定475 nm處的吸收度降低， 可以在室溫下測定活性。使用此方法，如上文所述純化的所有突變體 MIF酶可以與野生型MIF酶的相對(duì)活性相對(duì)比來測定。此外，可以 將在本實(shí)施例最后部分中鑒別的候選抑制劑以不同濃度溶解在 DMSO中，并在添加多巴色素底物之前1分鐘加入到有MIF的比色 亞中(DMSO的終濃度將不超過0.1%)。Ci)7￥ ^爽試發(fā)?？梢匀缫郧懊枋?Leng等人，2003)來表達(dá)和純化 可溶性CD74蛋白(sCD7473-232)。簡而言之，包含A.A. 73-232的編碼 區(qū)域的cDNA可以被PCR擴(kuò)增并連接到pCR T7/CT TOPO F大腸桿 菌表達(dá)載體(Invitrogen， Carlsbad, California, U.S.A.)中。重組sCD74 可以在IPTG誘導(dǎo)下在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中表達(dá)。該sCD74 蛋白可以從細(xì)菌溶胞產(chǎn)物通過Ni-NTA親合色鐠法純化。hrMIF的生 物素化可以根據(jù)制造商的技術(shù)說明書(Biotin Labeling Kit; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, U.S.A.)進(jìn)行。
可以將96孔板用60 pl/孔的純化的、可溶性的O.lmg/ml的CD74 (CD74"-""包被，再在4。C下孵育過夜?？梢杂肨-TBS洗滌板，然后 在SUPERBLOCK (Pierce， Rockford， Illinois, U.S.A.)中在4。C下孵 育過夜。除去阻斷緩沖溶液以后，可以將不同濃度的抗-CD74、變性 的MIF、 MIF或突變MIF在室溫下孵育30min。然后將0.2pM的生 物素-MIF直接加至該板中，再在4。C下孵育過夜。為了抑制劑分析， 可以將不同濃度的化合物與0.2pM生物素-MIF在室溫下和暗處預(yù)-孵 育30min，然后加至板中并孵育過夜。用T-TBS洗滌該板4次以后， 將鏈霉抗生物素曙AP (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, U.S.A.) 加至孔中，再在室溫下和暗處孵育另外1小時(shí)。洗涂之后，加入60pl/ 孔的PNPP (Sigma),再使之在暗處顯影直至在405nm處讀數(shù)。
奸考M/F催必活^在,《敗虛擬謬逸。計(jì)算方法可以用于篩選至多 1800萬個(gè)潛在的MIF的小分子抑制劑。該策略開始的規(guī)則是靶結(jié)合 位點(diǎn)是MIF結(jié)合袋的底部的蛋氨酸(A2)，如前文所公開的。此靶殘基 不同于前文描述的虛擬篩選(Orita等人，2001)，并且本文提供的數(shù)據(jù) 顯示可以使用此新穎方法發(fā)現(xiàn)另外的化合物。除了靶向MetA2，可以 結(jié)合突變數(shù)據(jù)的結(jié)果以包括那些發(fā)現(xiàn)在MIF/MIF受體相互作用中是 重要的區(qū)域，和/或發(fā)現(xiàn)對(duì)于催化功能是必需的那些區(qū)域。可以運(yùn)行許 多具有不同評(píng)分算法的虛擬篩選軟件，以達(dá)到用于鑒別先導(dǎo)化合物的 一致分值，以測試針對(duì)MIF的催化活性和生物活性?？梢允褂米钚掳?本的DOCK (Ewing等人，2001)、 FlexX (Rarey等人，1996)和CSCORETM (Tripos, St. Louis， Missouri, U.S.A.)來預(yù)篩選更大的數(shù)據(jù) 庫，得到較小的結(jié)合數(shù)據(jù)庫，其可以使用更靈活的方案以DOCK 6.1 (容許有柔性受體)、Autodock (Goodsell等人，1996)、 Surflex (Jain， 2003)和Molegro (Thomsen & Christensen， 2006)來檢查。使用多種方 法和計(jì)分技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于沒有可轉(zhuǎn)移到任何系統(tǒng)的通用方式。當(dāng)組合 起來時(shí)，這還增加了該"命中化合物(hits)"的富集并降低了假陽性。
可以檢索并含有商業(yè)可得的化合物的小分子數(shù)據(jù)庫是含1,990 個(gè)小分子的有Gasteiger載荷產(chǎn)生的Sybyl的NCI分集組；目前含有 超過4，600，000個(gè)小分子的ZINC庫，其具有更準(zhǔn)確的AMSOL計(jì)算 的部分項(xiàng)目(這是ACD庫的可替代庫，具有更大數(shù)目的分子，它們已 根據(jù)不嚴(yán)格的Lipinski氏規(guī)則對(duì)大小、logP、 H-鍵受體和供體的數(shù)目 進(jìn)行了過濾)(Walters等人，1999; Walters and Murcko， 2002; Lipinski, 2000)和Chemnavigator (Walters and Murcko， 2002); 具有 超過14,000,000個(gè)的獨(dú)特的、商業(yè)可得的結(jié)構(gòu)的iResearch庫。可檢 查該iResearch庫與ZINC庫的重疊，并且所述獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可以形成 一個(gè)新的庫。對(duì)于該iResearch 2D數(shù)據(jù)庫，CONCORD可用于產(chǎn)生 3D構(gòu)象。
圖7中顯示的數(shù)據(jù)是使用嚴(yán)格的對(duì)接操作以Ludi (Accelrys)軟件 和ACD庫(使用Corina和Genfra轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生的。然而，Ludi可以不 與上文提及的對(duì)接軟件一樣好地執(zhí)行，并且限于配體柔性和部分載荷。 最初的DOCK篩選可使用0.3A的網(wǎng)格間距，接觸截止值為4.5A，能 量截止值10A。對(duì)于MIF耙結(jié)合袋，AMBER (Cornell等人，1995)載 荷可用于網(wǎng)格生成。然后對(duì)于最前的10,000個(gè)分子，可以執(zhí)行嚴(yán)格的
配體對(duì)接，并且結(jié)合接觸分值、化學(xué)分值和能量分值。接著可以將這 些用于完全柔性的對(duì)接。類似方法可以與其它虛擬篩選軟件使用。該 方案可根據(jù)結(jié)果而改變。
實(shí)施例9
通過虛擬組合庫篩選以及受體結(jié)合數(shù)據(jù)分析優(yōu)化化合物本實(shí)施例基于鑒別和測試的MIF的抑制劑，以及使用實(shí)施例9所 概述的乾向虛擬篩選的方法鑒別的獨(dú)特模板。虛擬組合庫篩選以及來 自點(diǎn)突變體的受體結(jié)合/催化活性的數(shù)據(jù)分析可用于推導(dǎo)化合物優(yōu)化。
j擬逸會(huì)岸Z^;^廖逸。Sybyl軟件LEGION (Thorpe等人， 1999)允許以反應(yīng)為基礎(chǔ)的組合庫的產(chǎn)生，該組合庫中已知化學(xué)合成反 應(yīng)被用于產(chǎn)生可合成獲得的化合物的庫。這提高了設(shè)計(jì)分子的可能性， 事實(shí)上該分子可如列舉的試劑制備，并且對(duì)于每種新化合物發(fā)生反應(yīng)。 或者，LEGION 可以以產(chǎn)物為基礎(chǔ)的方式使用，該方式對(duì)該核分子 的用戶定義位點(diǎn)產(chǎn)生系統(tǒng)改變。然后，可以使用柔性對(duì)接軟件更充分 地評(píng)價(jià)這些庫，以考慮在該MIF結(jié)合袋中的配體和受體的構(gòu)象柔性。 此方法還可用于實(shí)施例8中發(fā)現(xiàn)的任意新的生物活性化合物。如果這 些操作不應(yīng)導(dǎo)致新的更具活性的類似物，可以使用可替代的/ 組合產(chǎn)生程序COMBILIBMAKER (Cramer等人，1998; Pearlman 和Smith, 1999)，其使用了連接在用戶指定位置處的側(cè)鏈庫。來自實(shí) 施例8的MIF突變數(shù)據(jù)可用于指向該模板的區(qū)域，使該分子"生長" 以覆蓋對(duì)于MIF/MIF受體相互作用和/或催化活性重要的殘基側(cè)鏈。
^合參說必々合^才黃。對(duì)于MIF來說，4-碘-6-苯基嘧啶和相關(guān) 化合物在其它配體中是獨(dú)特的，原因是，不希望受理論束縳，是該碘 基團(tuán)錨著在結(jié)合于Met A2位處的MIF的底部(
圖15)。嘧啶環(huán)形成2 個(gè)氫鍵，N3連接于lie A64 (骨架相互作用)并且Nl連接Lys A32的 側(cè)鏈。苯基基團(tuán)通過堆疊在Tyr A36上產(chǎn)生另外的穩(wěn)定作用?；瘜W(xué)優(yōu) 化有若干可能性(
圖16): l)修飾碘基團(tuán)以形成連接Met A2的氫鍵(用 CH2OH代替1)， 2)在苯環(huán)的2位引入羥基基團(tuán)將氫鍵結(jié)合于嘧啶的 Nl位，以及增加了與Lys A32的側(cè)鏈的靜電作用(0-NH3)， 3)在苯基 基團(tuán)的3位用CH2CH2OH代替能夠使得與Lys A66的側(cè)鏈相互作用， 4)在苯基基團(tuán)的4位用H-鍵受體或供體代替以增加與Tyr A36的OH 的相互作用，5)在苯基基團(tuán)的5位用H-鍵接受體代替能夠使得與Trp A108 (NH)相互作用，6)在苯基基團(tuán)的5和6位用H-鍵接受體或供體 代替能夠使得與Tyr C95 (OH)相互作用，7)在嘧啶環(huán)的C2位用H-鍵接受體或供體代替能夠使得與Ser A63相互作用(
圖15)。來自實(shí)施例 8的突變的數(shù)據(jù)能夠提供關(guān)于要靶向殘基的重要線索，并且因此在確 定哪種衍生物可合乎需要用于制備和測試中能夠發(fā)揮重要的作用。
描述了合成方案用于MIF抑制劑化合物4-碘-6-苯基嘧啶的衍生 化(方案1)。該方案意味著可用作從實(shí)施例8所述的虛擬篩選策略鑒別 的其它化合物的合成研究的概括模板?？梢允紫葒@先導(dǎo)化合物繪制 立體-電子空間。相應(yīng)地，設(shè)計(jì)了使用最小數(shù)目步驟、從容易商購得到 的原料和試劑開始的合成順序。此合成計(jì)劃的額外益處在于，可以改 變?cè)擁樞?，其中取代基摻入到任一個(gè)環(huán)中。此外，如果需要，人們能 夠使該取代基官能化(例如，醇的氧化，少數(shù)幾個(gè)命名的取代反應(yīng))。1 的合成可以從可商得的原料6在一個(gè)簡單步驟中進(jìn)行(Sakamoto等人， 1980)，該原料6本身對(duì)于試驗(yàn)(eq l)而言是有吸引力的候選者。
方案l.衍生物2-5從商業(yè)可得的起始物質(zhì)7合成。 醇衍生物2-4的合成可以使用普通順序?qū)崿F(xiàn)(方案1)，其在此兩步順序中可在第一步或在第二步使用Suzuki偶合(Gong和Pauls, 2000; Wang等人，2005; Saygili等人，2004)。此合成的附加益處是，烴基代 硼酸化合物是商業(yè)可得的，并且如果該羥基基團(tuán)造成一些困難，則它 們可以容易地用多種保護(hù)劑來保護(hù)，如方案中所示。5的合成是根據(jù) 公開的操作(Sawayama等人，1977)，并且顯示于eq 2中。
通過最初使用化合物4-碘-6-苯基嘧啶作為核心結(jié)構(gòu)，并且按照上 文所述(方案l)代表性的合成方案，可以鑒別此MIF拮抗劑的其它有 效類似物。此外，實(shí)施例8中描述的虛擬篩選研究可產(chǎn)生其它目標(biāo)分 子，其可使用Sybyl軟件-產(chǎn)生的組合庫接著合成先導(dǎo)衍生物而可用于 分析。MIF-依賴性受體結(jié)合/催化研究的廣泛突變分析可揭示若干氨基 酸殘基，使用新穎取代基或本文公開的核心結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展或者在該核心 結(jié)構(gòu)上的擴(kuò)展，所述殘基可以被更適合地靶向。
實(shí)施例10
鑒別的MIF拮抗劑的催化和生物抑制活性的篩選和評(píng)價(jià) 除了測試實(shí)施例8中所述MIF-依賴性催化和受體結(jié)合的抑制作 用以外，可以在兩個(gè)獨(dú)立的體外MIF生物測定法中測試所有候選MIF 抑制性化合物。所有先導(dǎo)衍生物抗-MIF化合物以及新鑒別的分子可以 最先測試催化和受體結(jié)合抑制活性(參見實(shí)施例8)。在針對(duì)催化/受體 結(jié)合阻斷活性測試這些化合物之后，然后可以對(duì)全部化合物評(píng)價(jià)對(duì) HIF穩(wěn)定化和細(xì)胞遷移的抑制作用，而不管酶或受體結(jié)合抑制作用。
MIF結(jié)合CD74的需求可以在HIF-la穩(wěn)定化試驗(yàn)中測試。事實(shí) 上，先前的研究顯示，CD74是前列腺癌細(xì)胞侵襲和貼壁非依賴性所需的，并且同樣是ISO-l阻斷這些作用的能力所需的(Meyer-Siegler 等人，2006)。如圖9所示，MIF'〃細(xì)胞在表型方面類似于MIF siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因?yàn)閮煞N缺乏MIF的細(xì)胞類型均證實(shí)明顯降低了 PHD-抑制劑誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化?？梢灶愃频貙?duì)CD74一成纖維細(xì)胞測試 它們使低氧或PHD抑制劑誘導(dǎo)的HIF-la穩(wěn)定化。此外，可以測試在 生物測定法中發(fā)現(xiàn)為抑制性的候選化合物在MIF一和CD74一小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞中的特異性。
經(jīng)洽溪遞AT/F命浙浙^應(yīng)應(yīng)定必邦謬逸。本公開的發(fā)現(xiàn)， 即MIF在HIF穩(wěn)定性中發(fā)揮中心作用，是來自在胰腺癌細(xì)胞系中進(jìn) 行的研究。這些研究進(jìn)一步顯示，MIA-PaCa-2胰腺癌細(xì)胞對(duì)MIF抑 制劑-介導(dǎo)的HIF脫穩(wěn)定化非常敏感(圖9A和9B)。此細(xì)胞系可用于 大規(guī)模測試候選MIF拮抗劑。為了放大此體外篩選規(guī)模，可以使用以 DuoSet ELISA為基礎(chǔ)的測定法以檢測人細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中的總HIF-la (R&D Systems)。初始研究證實(shí)，MIF siRNA和MIF拮抗劑化合物 弁16(50pM)抑制CoCl2-誘導(dǎo)的HIF穩(wěn)定化，均為對(duì)照的 75-90%，其 是通過此HIF-la ELISA評(píng)價(jià)的。可以將MIA-Paca-2細(xì)胞以5 x 105 細(xì)胞/孔鋪板于24孔板上達(dá)16小時(shí)。培養(yǎng)基可以用新制培養(yǎng)基代替， 所述的新制培養(yǎng)基含有0.1% DMSO (-對(duì)照)，50nM #16 (+對(duì)照)和5、 50nM濃度的測試抑制劑，均為雙份孔。1小時(shí)以后，可以用150|nM CoCl2攻擊細(xì)胞另外6小時(shí)。用PBS漂洗細(xì)胞2次之后，根據(jù)制造商 的技術(shù)說明書，可以將供應(yīng)的試劑盒溶解緩沖液用于溶解該細(xì)胞。 HIF-la包被和阻斷之前，可以根據(jù)技術(shù)說明書進(jìn)行捕獲抗體，并且稀 釋的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物可以在HIF-la ELISA板上分析。
可以對(duì)證實(shí)對(duì)抗HIF-la積累的活性的那些化合物進(jìn)行更廣泛和 更寬濃度范圍的測試。特別是，可以在5nM至50inM的范圍之間測 試10倍增量劑量。通過評(píng)價(jià)針對(duì)低氧-誘導(dǎo)的(相對(duì)于PHD-抑制劑誘 導(dǎo)的)HIF-la的抑制活性，可以進(jìn)一步確證先導(dǎo)MIF抑制性化合物。 此外，可以測試化合物抗低氧-誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)(通過ELISA)以及 GLUT-1表達(dá)水平(通過蛋白質(zhì)印跡法)。入腐靡^勿應(yīng)遷移。可能理想的是，測定MIF-受體結(jié)合是否是所 有MIF抑制劑的抑制作用所需要的。Meyer-Siegler等人教導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞遷移和貼壁非依賴性需要CD74 (Meyer-Siegler等人，2006),但是不 太確定在MIF-依賴性HIF穩(wěn)定化中對(duì)CD74的需求。這樣，可以在 人胰腺癌細(xì)胞系中對(duì)所有候選抗-MIF化合物測試HIF穩(wěn)定化和細(xì)胞 遷移的抑制作用，以確定在兩項(xiàng)測定法中是否有相關(guān)的抑制活性，以 及它是否與MIF受體結(jié)合和/或催化活性相關(guān)。
簡而言之，可以將2 x 105MIA-PaCa-2人胰腺癌細(xì)胞混懸在0.3ml 遷移培養(yǎng)基(DMEM， 0.5。/。BSA)中，再在介質(zhì)(0.1% Me2SO)、 5 或50 pM候選抑制劑存在下使之孵育30分鐘。可以將膠原包^C的 (10pg/ml，在PBS中一過夜)轉(zhuǎn)移孔腔室放置在0.4ml遷移培養(yǎng)基中， 并將細(xì)胞置于上層腔室中。16小時(shí)以后，可以將來自上層腔室的細(xì)胞 揩出，膜底可以用結(jié)晶紫染色，再用異丙醇/乙酸溶解，接著經(jīng)分光光 度法在OD 570處讀數(shù)。對(duì)細(xì)胞遷移顯示出抑制作用的那些化合物可 以進(jìn)一步在更寬的濃度范圍(例如，5nM至50pM)內(nèi)測試，并可以確 定ICso濃度。
'勝。為了確定CD74是否為MIF-依賴性HIF穩(wěn)定化所必需，可以幾 乎匯合的條件下將野生型(C57Bl/6)和CD74; (C57B1/6) MEFs以雙份 在24孔板中鋪板達(dá)16小時(shí)。平行地，可以將MIF〃-小鼠成纖維細(xì)胞 (C57B1/6)以雙份以相同密度鋪板。16小時(shí)以后，可以用低氧(1%02) 或PHD抑制劑攻擊細(xì)胞達(dá)另外6小時(shí)，再通過本實(shí)施例上文描述的 總HIF-la ELISA針對(duì)相對(duì)HIF-la穩(wěn)定化檢驗(yàn)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物?？梢栽u(píng) 價(jià)HIF濃度(根據(jù)內(nèi)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線外推)，以確定低氧或CoCh誘導(dǎo) 的HIF穩(wěn)定化在CD74-缺陷細(xì)胞中是否有類似于MIF-缺乏的細(xì)胞中 觀測到的缺陷的缺陷(圖9)。
為了測試先導(dǎo)抗-MIF化合物的特異性，如上文所鋪板的野生型 MIF一和CD74〃-成纖維細(xì)胞(均為C57Bl/6)可以用前面確定的HIF有效 抑制劑量處理1小時(shí)，接著用CoCl2處理6小時(shí)。然后可以通過ELISA確定HIF-la蛋白水平，在野生型MEFs中的相對(duì)減少可以與在MIF^ 和CD74一細(xì)胞中觀測到的任何減少相比較。
最后，當(dāng)并且如果對(duì)任何毒性證據(jù)可疑時(shí)，可以和這些試驗(yàn)一起 進(jìn)行平行的體外細(xì)胞毒性研究。簡而言之，可以用介質(zhì)(DMSO)或在 lnM至IO(HiM范圍的濃度下的候選化合物處理細(xì)胞達(dá)24小時(shí)。對(duì)于 這些研究，可以使用稱為ALAMAR BLUETM (Serotec Limited, Oxford， 英國)的四唑鎮(zhèn)還原的方法?？梢砸?0%溶液將ALAMARBLUETM試 劑加至細(xì)胞中達(dá)4小時(shí)，然后在530nm激發(fā)光和5卯nm發(fā)射光的波 長處在熒光板讀數(shù)器上讀數(shù)?？梢酝ㄟ^將來自介質(zhì)處理的孔的焚光值 與用各個(gè)藥物處理的焚光值分開來評(píng)價(jià)毒性。
實(shí)施例11
鑒別MIF拮抗劑測試以確定以HIF-la-依賴性方式改變胰腺腫瘤
生長和病理學(xué)的能力
可以評(píng)價(jià)在用先導(dǎo)抗-MIF化合物處理的小鼠中移植的胰腺癌異 種移植物的腫瘤生長和伴隨的低氧適應(yīng)。HIF-la和HIF-la靼基因 (CA9 、 GLUT-1)的免疫組織化學(xué)分析可以連同各種組織學(xué)生物標(biāo)記例 如血管發(fā)生、低氧、細(xì)胞凋亡和壞死一起評(píng)價(jià)。表達(dá)組成性MIF siRNA 或者HIF-la的顯性干擾突變體的對(duì)照胰腺癌細(xì)胞系可以在用和不用 抑制劑處理的情況下測試，以確定MIF和HIF特異性。
確定在^兌爭M/F #祐浙義埋邦小扃哞乂腐應(yīng)^#移控橫辨# yf^長掙絲。在1)抗-MIF抑制劑4-碘-6-苯基嘧啶；2)4-碘-6-苯基嘧 啶同類物；和3)根據(jù)實(shí)施例8-10鑒別的先導(dǎo)及優(yōu)化的先導(dǎo)候選化合 物存在下，可以檢驗(yàn)CD74-陽性人胰腺癌細(xì)胞系發(fā)展為實(shí)體瘤的能力。 可以將2 x 106 MIA-PaCa-2細(xì)胞皮下注射到棵Balb/c (""/"")雌性小 鼠脅腹。每只小鼠可以進(jìn)行一次植入，每項(xiàng)試驗(yàn)可由10只小鼠/組組 成(重復(fù)一次，達(dá)到總計(jì)20只小鼠/組)。對(duì)照小鼠可以單獨(dú)注射玉米油， 而測試小鼠可以注射所討論的抗-MIF化合物(初始化合物濃度 =50mg/kg;每24小時(shí)i.p.;稀釋在玉米油中)。為了獲得腫瘤生長曲線，可以使用游標(biāo)卡尺每天測量三個(gè)互呈直角的腫瘤直徑，并使用下
式確定質(zhì)量(Taetle等人，1987):質(zhì)量(mg)=(寬度，mm)2 x (長度， mm)/2?？梢砸云骄鄬?duì)治療組胂瘤體積士 SEM對(duì)所測定的質(zhì)量繪圖。 在對(duì)照腫瘤達(dá)到不超過總體重(-2 gm)的10%后，使小鼠安樂死，可 以通過頸脫位法處死來自各組的小子集，用于緊接著在下文描述的低 氧和低氧標(biāo)記物測定，IHC和血管形成指數(shù)。
然后，可以在建立的腫瘤模型中測試在胰腺腫瘤異種移植物模型 中，所觀察到的MIF對(duì)腫瘤長出最具抑制性和特異性的化合物。簡而 言之，可以給小鼠皮下植入2xl(^MIA-PaCa-2細(xì)胞，再如上文所述 使用游標(biāo)卡尺測量質(zhì)量。 一旦腫瘤達(dá)到200 mg，可以將小鼠分成每組 IO的組，在各組中具有肺瘤的相同大小表示?？梢越o對(duì)照小鼠單獨(dú)注 射玉米油，而測試小鼠可以注射測試化合物(50mg/kg;每24小時(shí)i.p.; 稀釋于玉米油中)?？梢詮娜缟衔乃鰪闹踩腴_始建立腫瘤生長曲線。 在對(duì)照腫瘤達(dá)到總體重( 2gm)的10%以后，使小鼠安樂死，可以通過 頸脫位法處死來自各組的小子集，用于緊接著在下文描述的低氧和低 氧標(biāo)記測定，IHC和血管形成指數(shù)。在這些測定法中，發(fā)現(xiàn)具有最大 活性(與MIF-缺陷的MIA-PaCa-2細(xì)胞比較)的那些化合物可用于劑量 反應(yīng)測定，以用于肺瘤生長抑制和最大耐受劑量測試。
Af/F #戎浙義埋#'/、薦哞浙;€入腐靡;^#移^#^錄處#
在、標(biāo)記參々J&^承^。對(duì)于初始用4-碘-6-苯基嘧啶以及其它先導(dǎo)和 /或同類化合物測試，可以評(píng)價(jià)腫瘤低氧標(biāo)記物和肺瘤相關(guān)血管發(fā)生。 簡而言之，當(dāng)建立腫瘤負(fù)荷時(shí)，由于麻醉對(duì)低氧的混雜作用，可以通 過頸脫位法處死小鼠。正好在處死小鼠之前，可以將 HYPOXYPROBE-lTM (60 mg/kg; Southcot Corporation, Research triangle Park, North Carolina, U.S.A.)經(jīng)靜脈內(nèi)施用于一個(gè)亞組小鼠。 可以將來自對(duì)照組和抗-MIF拮抗劑處理的小鼠的代表性腫瘤的小切 片在液氮中快速冷凍。稱重以后，可以將該異種移植物包埋到 TISSUE-TEK (Sakura Finetechnical Co" Ltd., Tokyo, Japan)中，再 在-70C下保存直到分析。從每個(gè)包埋的標(biāo)本切割連續(xù)的切片。每個(gè)標(biāo)本的一個(gè)切片可以用H&E染色。此外，使用細(xì)胞凋亡原位檢測試劑 盒(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan沐據(jù)制造商的 方案，可以使另一連續(xù)切片經(jīng)歷原位TUNEL分析。還可以分別通過 抗-因子VIII (抗-小鼠)和抗-哌莫硝唑染色對(duì)連續(xù)切片檢測血管含量和 低氧。其它連續(xù)切片可以通過IHC檢測HIF-la、 HIF-2a、 CA9和 GLUT-1 (HIF-靶基因)?？梢詫?duì)低氧區(qū)域、血管生成和細(xì)胞凋亡之間 的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，與來自對(duì)照小鼠的腫瘤的相對(duì)。
W/試Af/F-缺潛#，f ^ ,遂H/F-/ a衷迷遂腐應(yīng)膚^Vf長A "及 考戎-M/F ^合參^教^^。不希望受理論的束綽，在胰腺胂瘤長出物 中觀測到的MIF拮抗劑衰減作用可能是由于MIF-依賴性HIF-la穩(wěn) 定化的抑制作用以及所致的低氧適應(yīng)和新血管發(fā)生的損失。為了進(jìn)一 步測試這種可能性，可以針對(duì)MIF表達(dá)缺陷或者表達(dá)顯性抑制性突變 HIF-la的MIA-PaCa-2細(xì)胞系，測試潛在拮抗劑的相對(duì)作用。此外， 對(duì)照組與MIF或HIF缺陷細(xì)胞系在實(shí)體瘤中發(fā)展的能力的無攻擊的 比較可以提供重要的觀點(diǎn)，即MIF是否通過HIF-la的調(diào)節(jié)作用主要 影響肺瘤長出。
該顯性負(fù)性HIF-la (d/n HIF-la)突變體包括DNA-結(jié)合和二聚體 化結(jié)構(gòu)域，但缺少任何反式激活或Or調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(Forsythe等人， 1996)。通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液逆轉(zhuǎn)錄病毒性地感染MIA-PaCa-2細(xì) 胞，可以制備顯性負(fù)性HIF-la-表達(dá)性細(xì)胞系，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒上清 液是通過用pLXSN-HA-dnHIF-la短暫轉(zhuǎn)染Phoenix封裝的細(xì)胞系而 制備的。最近，通過在MIF特異性MIF siRNA中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染而開發(fā) 了 MIF-缺陷性細(xì)胞系(
圖17A和17B)。簡而言之，可以將2xl(^個(gè)對(duì) 照、MIF-缺陷性細(xì)胞(克隆7 -
圖17A和17B)或d/n HIF-la表達(dá)性細(xì) 胞經(jīng)皮下注射到10組棵Balb/c (""/w")雌性小鼠(20gm)中，對(duì)于初始 試驗(yàn)，每一組的腫瘤長出物曲線可以通過上文所述的質(zhì)量測定來評(píng)價(jià)。 對(duì)于先導(dǎo)化合物，可以給20只小鼠的研究組注射對(duì)照、MIF-缺陷性 細(xì)胞(克隆7 -
圖17)或d/n HIF-la表達(dá)性細(xì)胞?？梢越o每組的1/2 (10只 小鼠)單獨(dú)注射玉米油，而另外的^可以注射所討論的先導(dǎo)化合物(50mg/kg;每24小時(shí)i.p.;稀釋于玉米油中)。可以如上節(jié)所述通過游標(biāo) 卡尺每24小時(shí)測量腫瘤質(zhì)量。在對(duì)照腫瘤達(dá)到總體重( 2gm)的10% 以后，使小鼠安樂死，可以通過頸脫位法處死來自各組的小子集，用 于在上節(jié)所述的低氧和低氧標(biāo)記測定，IHC和血管形成指數(shù)。
Af/F橫戎浙4沐^W處義矽菱浙,。由于藥物在個(gè)體之間敏感度 的差異性，對(duì)于前瞻性的臨床藥學(xué)而言，知道最大耐受劑量和治療窗 是多少可能是理想的。通過進(jìn)行最大耐受劑量(MTD)研究，可以對(duì)有 希望的抗-MIF先導(dǎo)化合物進(jìn)行測試，以確定它們的相對(duì)毒性。已經(jīng)確 定的是50mg/kg是耐受的，下一步可以在一小組小鼠(例如，5只小鼠 /組)中確定，首先用100mg/kg開始，然后逐步使用200、 300、 400 及最后500mg/kg劑量進(jìn)行的增加劑量是否類似耐受。在每天腹膜內(nèi) 注射化合物7天期間，在最后一次注射之后，可以對(duì)小鼠嚴(yán)密監(jiān)測疼 痛或不安至多4天。
總之，對(duì)于以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)而言，該可溶性細(xì)胞因子/ 生長因子，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)代表了獨(dú)特有效的靶標(biāo)。MIF 有助于腫瘤的生長、運(yùn)動(dòng)和低氧適應(yīng)，MIF抑制性小分子阻斷了所有 這些促-致瘤性作用。這些發(fā)現(xiàn)與MIF缺陷性小鼠正常地發(fā)育和生長 的事實(shí)結(jié)合，強(qiáng)有力地表明，本文公開的有效的MIF拮抗劑代表了一 代新的、比目前使用的那些具有更低毒性和更強(qiáng)效果的抗癌疾病治療 劑。
將會(huì)理解，可以改變本^Hf主題的各種細(xì)節(jié)而不會(huì)脫離本公開主 題的范圍。此外，上文所述僅是為說明的目的，而不是為了限制的目 的。
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權(quán)利要求
1.抑制巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)多肽的生物活性的方法，其包括使該MIF多肽與具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物接觸其中各R獨(dú)立地是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨基或羧基；R1是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基或芳基；R2是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且n是0至5的整數(shù)。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述化合物至少與所述MIF多 肽的第二 N-末端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成穩(wěn)定的相互作用。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述MIF多肽包含單體A、 B 和C的同源三聚體并且單體A包含Met-2 (Met-A2)。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化合物進(jìn)一步與所述MIF 多肽的Pro-l、 Lys-32、 Pro-33、 Tyr-36、 His畫62、 Ser-63、 Ile-64、 Lys-66、 Tyr-95、 Met-lOl、 Val-106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成 穩(wěn)定的相互作用。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MIF多肽是哺乳動(dòng)物MIF 多肽。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的MIF多肽包含SEQ ID NO:l。
7. 權(quán)利要求l所述的方法，其中Ri是碘。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的化合物是4-碘-6-苯基嘧 啶或其類似物或衍生物。
9. 抑制低氧可誘導(dǎo)因子la (HIF-la)多肽生物活性的方法，其包其中:括使巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)多肽與具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物接 觸各R獨(dú)立地是H、卣素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨 基或羧基；Ri是H、卣素、OH、烴基、取代的烴基或芳基； R2是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且 n是0至5的整數(shù)， 其中使所述MIF多肽與所述化合物接觸抑制了 MIF多肽生物活 性，從而抑制HIF-la生物活性。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述化合物至少與所述MIF多 肽的第二 N-末端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成穩(wěn)定的相互作用。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述MIF多肽包含單體A、 B 和C的同源三聚體并且單體A包含Met-2 (Met-A2)。
12. 權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述化合物進(jìn)一步與所述MIF 多肽的Pro-l、 Lys-32、 Pro曙33、 Tyr-36、 His-62、 Ser-63、 Ue畫64、 Lys-66、 Tyr-95、 Met-101、 Val-106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成 穩(wěn)定的相互作用。
13. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的MIF多肽是哺乳動(dòng)物MIF 多肽。
14. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的MIF多肽包含SEQ ID NO:l。
15. 權(quán)利要求9所述的方法，其中&是碘。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的化合物是4-碘-6-苯基嘧 啶或其類似物或衍生物。
17. 權(quán)利要求9所述的方法，其中抑制HIF-la多肽活性抑制了其中:HIF-la多肽的轉(zhuǎn)錄活性。
18. 權(quán)利要求9所述的方法，其中抑制HIF-la多肽活性抑制了在 表達(dá)HIF-la的細(xì)胞中的血管發(fā)生、輻射抗性或此二者。
19. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的細(xì)胞是低氧癌細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求19所迷的方法，其中使所述MIF多肽與所述化合物 接觸，聯(lián)合用輻射、化學(xué)治療劑或此二者治療所述細(xì)胞。
21. 抑制或預(yù)防細(xì)胞致癌活性的方法，其包括使細(xì)胞與具有式(I) 結(jié)構(gòu)的化合物接觸其中各R獨(dú)立地是H、閨素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨基或羧基；Ri是H、閨素、OH、烴基、取代的烴基或芳基；R2是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且n是0至5的整數(shù)。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中R!是碘。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的化合物是4-碘-6-苯基嘧 啶或其類似物或衍生物。
24. 權(quán)利要求21所迷的方法，其中所述化合物至少與巨噬細(xì)胞遷 移抑制因子(MIF)多肽的所述第二 N-末端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成 穩(wěn)定的相互作用。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述MIF多肽包含單體A、 B 和C的同源三聚體并且單體A包含Met-2 (Met-A2)。
26. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述化合物進(jìn)一步與所述MIF 多肽的Pro-l、 Lys-32、 Pro國33、 Tyr-36、 His-62、 Ser-63、 Ile-64、 Lys- Tyr-95、 Met-lOl、 Val-106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成 穩(wěn)定的相互作用。
27. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的MIF多肽是哺乳動(dòng)物 MIF多肽。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的MIF多肽包含SEQ ID NO:l。
29. 權(quán)利要求21所述的方法，其中抑制或預(yù)防致癌活性包括抑制 細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、不依賴貼壁生長、血管發(fā)生或其組合。
30. 權(quán)利要求24所述的方法，其中抑制或預(yù)防致癌活性包括通過 所述化合物對(duì)所述MIF多肽的抑制作用而抑制Rho GTP酶家族成員 的活性。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述Rho GTP酶家族成員是 Racl或RhoA。
32. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，其選自肺 癌、頭頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌。
33. 在受試者中治療癌癥復(fù)發(fā)或降低癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括 給所述受試者施用有效量的具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物其中各R獨(dú)立地是H、 g素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨 基或羧基；Ri是H、囟素、OH、烴基、取代的烴基或芳基；R2是H、卣素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且n是0至5的整數(shù)。
34. 權(quán)利要求33所迷的方法，其中&是碘。
35. 權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的化合物是4-碘-6-苯基嘧 啶或其類似物或衍生物。
36. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述化合物至少與巨噬細(xì)胞遷 移抑制因子(MIF)多肽的所述第二N-末端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成穩(wěn)定的相互作用。
37. 權(quán)利要求36所述的方法，其中所述MIF多肽包含單體A、 B 和C的同源三聚體并且單體A包含Met-2 (Met-A2)。
38. 權(quán)利要求37所述的方法，其中所述化合物進(jìn)一步與所述MIF 多肽的Pro-l、 Lys-32、 Pro-33、 Tyr-36、 His-62、 Ser畫63、 He畫64、 Lys-66、 Tyr-95、 Met-lOl、 Val-106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成 穩(wěn)定的相互作用。
39. 權(quán)利要求33所述的方法，其中治療所述癌癥包括抑制所述癌 癥的遷移、侵襲、細(xì)胞存活、不依賴貼壁生長、血管發(fā)生或其組合。
40. 權(quán)利要求33所述的方法，其中將所述化合物給予所述受試者， 聯(lián)合用輻射、化學(xué)治療或此二者治療所述癌癥。
41. 權(quán)利要求40所述的方法，其中所述化學(xué)治療包括低氧-活化的 化合物。
42. 權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的低氧-活化的化合物包括 替拉扎明。
43. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的癌癥是選自以下的癌癥 肺癌、頭頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺 癌。
44. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的受試者是人。
45. 在受試者中治療炎性障礙的方法，其包括給所述受試者施用有 效量的具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物其中各R獨(dú)立地是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基、氨 基或羧基；R是H、卣素、OH、烴基、取代的烴基或芳基；R2是H、鹵素、OH、烴基、取代的烴基、芳基或氨基；并且n是0至5的整數(shù)。
46. 權(quán)利要求45所述的方法，其中&是碘。
47. 權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的化合物是4-碘-6-苯基嘧 啶或其類似物或衍生物。
48. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述化合物至少與巨噬細(xì)胞遷 移抑制因子(MIF)多肽的所述第二N-末端殘基上的蛋氨酸(Met-2)形成 穩(wěn)定的相互作用。
49. 權(quán)利要求48所述的方法，其中所述MIF多肽包含單體A、 B 和C的同源三聚體并且單體A包含Met-2 (Met-A2)。
50. 權(quán)利要求49所述的方法，其中所述化合物進(jìn)一步與所述MIF 多肽的Pro-l、 Lys曙32、 Pro-33、 Tyr-36、 His-62、 Ser畫63、 Ile-64、 Lys-66、 Tyr-95、 Met-lOl、 Val畫106、 Trp-108和Phe-113中的一個(gè)或多個(gè)形成 穩(wěn)定的相互作用。
51. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述炎性障礙選自特應(yīng)性皮炎、 關(guān)節(jié)炎、增生性血管疾病、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、細(xì)胞因子-介導(dǎo)的毒性、敗血病、敗血癥性休克、牛皮癬、白細(xì)胞介素-2毒性、 哮喘、MIF-介導(dǎo)的病況、自身免疫性障礙、腫瘤生長或血管發(fā)生。
52. 權(quán)利要求51所述的方法，其中所述的自身免疫性障礙選自類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、多發(fā)性硬化癥、移植物抗宿主 病和狼瘡綜合征。
53. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的受試者是人。
54. —種反義多核苷酸，其包含對(duì)SEQ ID NO:2具有結(jié)合專一性 的核苷酸序列。
55. 權(quán)利要求54所述的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸是 小干擾RNA (siRNA)。
56. 權(quán)利要求54所述的反義多核苷酸，其中所述反義核苷酸序列 包括SEQ ID NO:3。
57. 權(quán)利要求54所述的反義多核苷酸，其中所述反義核苷酸序列 包括SEQ ID NO:4。
58.在細(xì)胞或組織中抑制巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)多肽的表達(dá) 的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求54的反義多核苷酸接 觸。
全文摘要
提供了使用MIF抑制性化合物抑制巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)多肽的一種或多種生物活性的方法。所述方法包括用于治療癌癥和炎性疾病的治療方法。
文檔編號(hào)A01N43/54GK101528039SQ200780028307
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者J·B·梅爾, J·O·特萊恩特, R·A·密特徹爾 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)公司