專利名稱：一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人參組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)不定芽的方法，具體是 以人參無(wú)菌苗的莖段為外植體，在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，快速獲得人參 不定芽的方法。
背景技術(shù)：
人參(尸a77s;r ^7'/7se/^C. A. Mey.)為五加科人參屬多年生草本 植物，是名貴的中藥材，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津 安神之功效，在臨床醫(yī)學(xué)上可用于治療體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食 少、肺虛喘咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、久病虛羸、驚悸失眠、陽(yáng)痿宮 冷、心力衰竭、心原性休克等多種疾病，同時(shí)人參在保健食品、保健 化妝品中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。人參喜陰涼、濕潤(rùn)的氣候，多生長(zhǎng)于海拔500 1100米山地緩 坡或斜坡地帶的針闊混交林或雜木林中，由于自然繁殖緩慢，采挖過(guò) 于頻繁，野生資源己很稀少，目前已被列為國(guó)家珍稀瀕危保護(hù)植物。 隨著人們生活承平的提高，對(duì)人參的需求量也越來(lái)越大，野生人參資 源己遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，人工栽培人參的價(jià)格也隨之水漲船 高。 '目前對(duì)于人參培養(yǎng)方面的研究主要集中于細(xì)胞培養(yǎng)，人參細(xì)胞和 毛狀根懸浮培養(yǎng)和人參皂苷的生產(chǎn)已被廣泛研究，中國(guó)專利 87102382. 2研究了人參細(xì)胞靜止培養(yǎng)的方法；中國(guó)專利94105427. 6 研究了人參組織和細(xì)胞富鍺培養(yǎng)。人參組織培養(yǎng)的研究尚不多見(jiàn)，中 國(guó)專利86106832和89106227. 0公開(kāi)了以人參根為外植體，通過(guò)愈傷 誘導(dǎo)和不定胚發(fā)生的手段獲取人參再生植株的方法，然而通過(guò)愈傷培
養(yǎng)再生植株的途徑步驟復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。本發(fā)明以人參莖段為外植體， 通過(guò)直接器官發(fā)生的手段直接獲取人參不定芽，大大簡(jiǎn)化了人參組培 苗獲取的流程。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種人參組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)不定芽的 方法，該方法以人參莖段為外植體，通過(guò)器官發(fā)生的手段直接獲取人 參不定芽，簡(jiǎn)化了人參組培苗獲取的流程，為人參人工種植規(guī)?；M 培育苗提供一種有效的途徑，大大縮短人參育苗的時(shí)間和成本。本發(fā)明所述的一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法，該方法為在附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行莖段培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成不定芽，再將不定 芽繼續(xù)在附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，具體操作按下列步驟進(jìn)行a、 選取成熟的人參種子，表面消毒后接種于1/2MS培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)30-45天獲取人參無(wú)菌苗；b、 將人參無(wú)菌苗切除葉片和根部，把莖段切成1-2 cm長(zhǎng)的小段， 插入附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行莖段培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成不定芽，培養(yǎng) 時(shí)間為20-30天，溫度為20-25°C，濕度為40-60%，光照強(qiáng)度為 2000-25001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天；c、 將誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)移至附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò) 繁，繼代周期為20-25天，培養(yǎng)溫度為20-25°C，濕度為40-60%， 光照強(qiáng)度為2000-25001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天即可。步驟b不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖3%+2，4-D 0.1-0.3 mg/L+NAA 0. 1-1. 0 mg/L+6-BA 0. 5-2. 0 mg/L+瓊脂0. 6-0. 8% ， pH值 為5.8-6.0。 .步驟c不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS+蔗糖3%+NAA 0. 1-1. 0 mg/L+6-BA 0. 5-2. 0 mg/L+瓊脂0. 6-0. 8%， pH值為5. 8-6. 0。步驟a人參種子消毒條件為75%乙醇浸泡25-35秒，無(wú)菌水沖洗3-5次，0. 1-0. 2%的HgCl2溶液浸泡6-10分鐘，'再用無(wú)菌水沖洗 3-5次。本發(fā)明以人參莖段為外植體，通過(guò)直接器官發(fā)生的途徑直接誘導(dǎo) 出芽，由外植體直接分化出不定芽，省略了愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程， 速度快， 一般經(jīng)25天左右即可完成不定芽的誘導(dǎo)過(guò)程，再生頻率較 高，變異率較低，周期相對(duì)較短，而且未經(jīng)脫分化的細(xì)胞直接分化芽， 因此體細(xì)胞無(wú)性系變異小，能較好地保持受體植物的遺傳穩(wěn)定性，轉(zhuǎn) 化的外源基因也能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地遺傳，受基因型的限制較小，是大規(guī)模 獲得人參組培苗的有效手段。


圖1為人參莖段誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生圖 圖2為不定芽的擴(kuò)繁圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1a、 選取人參種子10粒，在超凈工作臺(tái)上用75X乙醇浸泡30s， 無(wú)菌水沖洗4次，0. 1。％的HgCl2溶液浸泡8分鐘，再用無(wú)菌水沖洗4 次，接種至1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，使種子萌發(fā)，形成人參無(wú)菌苗； .b、 將人參無(wú)菌苗切除葉片和根部，把莖段切成lcm小段，插入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng) 基+蔗糖3%+2， 4-D 0. 2 mg/L+磁0. 5 mg/L+6-BA 1. 0 mg/L+瓊脂0. 7 X，pH值為5.9，培養(yǎng)溫度為20。C，濕度為40%，光照強(qiáng)度為20001ux， 光照時(shí)間為14小時(shí)/天，培養(yǎng)15天后莖段開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突起，25天 后長(zhǎng)出不定芽，每個(gè)莖段外植體可誘導(dǎo)出1-3個(gè)不定芽；c、 切取誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)移至不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行不定 芽擴(kuò)繁，不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖3%+NAA 0. 5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+瓊脂0.8X， pH值為5.8，繼代周期為2S天，培養(yǎng)溫度為 20°C，濕度為40%，光照強(qiáng)度為20001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天即 可。實(shí)施例2a、 選取人參種子10粒，在超凈工作臺(tái)上用75^乙醇浸泡25s， 無(wú)菌水沖洗3次，0.2X的HgClv溶液浸泡6分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5 次，接種至1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，使種子萌發(fā)，形成人參無(wú)菌 苗；b、 將人參無(wú)菌苗切除葉片和根部，把莖段切成1.5cm小段，插 入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培 養(yǎng)基+蔗糖3%+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+瓊脂 0.8%， pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為22°C，濕度為50%，光照強(qiáng)度為 23001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天，培養(yǎng)20天后莖段開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突 起，30天后長(zhǎng)出不定芽，每個(gè)莖段外植體可誘導(dǎo)出'l-3個(gè)不定芽；c、 切取誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)移至不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行不定 芽擴(kuò)繁，不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖3Q%+NAA 0. 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+瓊脂0.6X， pH值為5.9，繼代周期為20天，培養(yǎng)溫度為 22°C，濕度為50%，光照強(qiáng)度為23001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天即 可。實(shí)施例3a、 選取人參種子10粒，在超凈工作臺(tái)上用75X乙醇浸泡35s， 無(wú)菌水沖洗5次，0. 1%的HgCl2溶液浸泡10分鐘，再用無(wú)菌水沖洗 3次，接種至1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天，使種子萌發(fā)，形成人參無(wú) 菌苗；b、 將人參無(wú)菌苗切除葉片和根部，把莖段切成2cm小段，插入 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng) 基+蔗糖3%+2， 4-D 0. 3 mg/L+NAA 0. 1 mg/L+6-BA 2. 0 mg/L+瓊脂0. 6 X，pH值為6. O，培養(yǎng)溫度為25。C，濕度為60%，光照強(qiáng)度為25001ux，
光照時(shí)間為14小時(shí)/天，培養(yǎng)15天后莖段開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突起，25天 后長(zhǎng)出不定芽，每個(gè)莖段外植體可誘導(dǎo)出l-3個(gè)不定芽；c、切取誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)移至不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行不定 芽擴(kuò)繁，不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖3%+NAA 1. 0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+瓊脂0.7X， pH值為6.0，繼代周期為20天，培養(yǎng)溫度為 25°C，濕度為60%，光照強(qiáng)度為25001ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天即 可。 -
權(quán)利要求
1、一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征在于該方法為在附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行莖段培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成不定芽，再將不定芽繼續(xù)在附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁；具體操作按下列步驟進(jìn)行a、選取成熟的人參種子，表面消毒后接種于1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30-45天獲取人參無(wú)菌苗；b、將人參無(wú)菌苗切除葉片和根部，把莖段切成1-2cm長(zhǎng)的小段，插入附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行莖段培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成不定芽，培養(yǎng)時(shí)間為20-30天，溫度為20-25℃，濕度為40-60％，光照強(qiáng)度為2000-2500lux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天；c、將誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)移至附加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，繼代周期為20-25天，培養(yǎng)溫度為20-25℃，濕度為40-60％，光照強(qiáng)度為2000-2500lux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天即可。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法， 其特征在于步驟b不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖3%+2， 4-D 0. 1-0. 3 mg/L+NAA 0. 1-1. 0 mg/L+6-BA 0. 5-2. 0 mg/L+瓊脂0. 6-0. 8% ， pH值 為5.8-6.0。 '
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法， 其特征在于步驟c不定芽擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS+蔗糖3%+NAA 0.1-1.0 mg/L+6-BA 0. 5-2. 0 mg/L+瓊脂0. 6-0. 8% ， pH值為5. 8-6. 0。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法， 其特征在于步驟a人參種子消毒條件為75%乙醇浸泡25-35秒，無(wú) 菌水沖洗3-5次，0. 1-0. 2X的HgCl2溶液浸泡6-10分鐘，再用無(wú)菌 水沖洗3-5次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人參莖段快速誘導(dǎo)不定芽的方法，該方法以人參莖段為外植體，在附加激素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成不定芽，再將不定芽繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)繁；通過(guò)直接器官發(fā)生的途徑直接誘導(dǎo)出芽，速度快，出芽率高，成本低，一般經(jīng)25天左右即可完成不定芽的誘導(dǎo)過(guò)程，再生頻率較高，變異率較低，周期相對(duì)較短，而且未經(jīng)脫分化的細(xì)胞直接分化芽，因此體細(xì)胞無(wú)性系變異小，能較好地保持受體植物的遺傳穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化的外源基因也能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地遺傳，受基因型的限制較小，不定芽得率相對(duì)較高，是大規(guī)模獲得人參組培人工苗的有效手段。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101156553SQ20071018003
公開(kāi)日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者曹玉錦, 王曉軍, 趙民安 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所