專利名稱：：中藥青蒿的一種組織培養(yǎng)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物的繁殖方法，特別涉及中藥青蒿(^^m&fl朋，aL.)的一種組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
：從中藥青蒿C4WemWfl朋"waL.)中分離得到的抗瘧疾有效單體青蒿素，是第一個(gè)由我國(guó)科學(xué)家自主發(fā)明并得到全球認(rèn)可的藥物。以青蒿素為基礎(chǔ)開發(fā)出的抗瘧疾藥物受到世界衛(wèi)生組織(WHO)的高度重視。瘧疾是當(dāng)今世界上流行最廣，發(fā)病率及死亡率最高的熱帶寄生蟲傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織近年統(tǒng)計(jì)報(bào)告目前全世界有29億人生活居住在瘧疾流行區(qū)，每年發(fā)病人數(shù)3-5億，死亡人數(shù)200-300萬(wàn)，在非洲瘧疾己成為頭號(hào)殺手。為了控制瘧疾的蔓延，世界衛(wèi)生組織強(qiáng)烈推薦以青蒿素為基礎(chǔ)的綜合治療(artemisinin陽(yáng)basedcombinationtherapies,ACTs)，國(guó)際市場(chǎng)只寸青蒿類抗疙藥需求猛增，這給我國(guó)的青蒿素產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了機(jī)會(huì)。目前世界上青蒿素的生產(chǎn)是用種子繁殖中藥青蒿，從中藥青蒿植株中直接提取青蒿素。中藥青蒿雖然分布很廣，但是天然中藥青蒿中青蒿素含量過(guò)低(0.7%以下)。由于中藥青蒿自交不親和的特性，通過(guò)種子繁殖的中藥青蒿后代在形態(tài)上存在明顯的差異，青蒿素含量變化也很大，且平均含量有下降的趨勢(shì)，所以人工栽培時(shí)很難得到遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)群體。通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的高產(chǎn)中藥青蒿株系在推廣應(yīng)用時(shí)，也存在著如何保持遺傳穩(wěn)定性的問(wèn)題。這些問(wèn)題致使青蒿素的市場(chǎng)價(jià)格偏高，嚴(yán)重地限制了青蒿素類藥物在貧窮落后的瘧疾高發(fā)區(qū)的推廣使用，降低青蒿素類藥物成本的關(guān)鍵是提高中藥青蒿中青蒿素的含量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供中藥青蒿"Wem^aa朋wL.)的一種組織培養(yǎng)快速繁殖方法。本發(fā)明所提供的中藥青蒿組織培養(yǎng)快速繁殖方法，是將中藥青蒿的頂芽或腋芽在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗；所述初代培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和GA得到的培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度為0.1-2.0毫克/升，所述GA的終濃度為0.2-2.0毫克/升。其中，所述6-BA的終濃度優(yōu)選為0.5毫克/升；所述GA的終濃度優(yōu)選為1.0毫克/升。所述方法中還包括將所述無(wú)菌苗進(jìn)行繼代繁殖的步驟。所述繼代繁殖所用的培養(yǎng)基可為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA得到的培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度可為0.5-2.0毫克/升、優(yōu)選為1.5毫克/升，所述NAA的終濃度可為0.1-0.5毫克/升、優(yōu)選為0.2毫克/升。上述方法中還包括將所述無(wú)菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。所述生根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加IBA得到的培養(yǎng)基，所述IBA的終濃度為0.2-1.0毫克/升，優(yōu)選為0.5毫克/升。所述方法中的培養(yǎng)條件可為在22-30°C，優(yōu)選為25°C;每天14-16小時(shí)光照、8-10小時(shí)黑暗光照條件培養(yǎng)，優(yōu)選為16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗的光照條件培養(yǎng)，所述光照強(qiáng)度為1500-2500lx，優(yōu)選為2000lx。本發(fā)明以中藥青蒿頂芽和腋芽為外植體，利用其專用培養(yǎng)基，開辟了一種快速繁殖中藥青蒿并保持親本植物遺傳特性的新方法。本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)取材容易，極易獲得無(wú)菌材料，變異率低、增值系數(shù)高，4周增殖倍數(shù)能達(dá)到56倍，組培苗生根率達(dá)到93%以上，移栽成活率高達(dá)95%以上，具有很強(qiáng)的工廠化生產(chǎn)能力。利用本發(fā)明的方法繁殖高產(chǎn)中藥青蒿株系，可使后代的高青蒿素含量穩(wěn)定，從而提高青蒿素的產(chǎn)量。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為中藥青蒿組織培養(yǎng)繁殖的試管苗和對(duì)照實(shí)生苗在大田栽培條件下的形態(tài)比較圖2為中藥青蒿組織培養(yǎng)繁殖的試管苗和對(duì)照實(shí)生苗的青蒿素含量比較具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的MS培養(yǎng)基的組成如表1所示表lMS培養(yǎng)基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例l、組織培養(yǎng)快速繁殖中藥青蒿一、培養(yǎng)基的配制和滅菌初代培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+GA1.0mg/L。增殖培養(yǎng)基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L。生根培養(yǎng)基MS+IBA0.5mg/L。以上培養(yǎng)基121.3。C下,滅菌20分鐘。二、初代培養(yǎng)取中藥黃花蒿"rfe肌'w's3朋mL.)植株的頂芽或腋芽，用70%(體積百分含量)的酒精浸潤(rùn)l分鐘，再放入0.1%(質(zhì)量百分含量)的升汞溶液中滅菌5-10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后，將頂芽或腋芽轉(zhuǎn)入裝有初代培養(yǎng)基的三角瓶(容量250ml)中，每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為5個(gè)。在下述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)25°C，每天16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗的光照條件，光照強(qiáng)度為2000lx。頂芽接種10個(gè)，腋芽接種20個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，該30個(gè)芽均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，該30株無(wú)菌苗的高度為5.0-7.0cm，節(jié)間長(zhǎng)度為0.8-1.2cm。每一株無(wú)菌苗為一個(gè)株系。三、繼代培養(yǎng)取上述30個(gè)株系中的25個(gè)株系進(jìn)行繼代繁殖，具體方法如下將長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗剪成莖段，每個(gè)莖段帶有一個(gè)頂芽或一個(gè)腋芽，莖段長(zhǎng)0.8-1.2cm。將上述莖段接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟二。上述莖段中，每個(gè)株系帶頂芽的莖段各接種1個(gè)，帶腋芽的莖段各接種4個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗。該無(wú)菌苗再按照上述方法每4周繼代一次，共繼代5次。每次繼代中，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，無(wú)菌苗的高度為5-7cm，節(jié)間長(zhǎng)度為0.8-1.2cm。故繁殖系數(shù)為5-6。四、生根培養(yǎng)將上述25個(gè)株系繼代5次的中藥青蒿無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二。將壯苗后的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二，得到試管苗，每個(gè)株系試管苗的根長(zhǎng)3-5cm。其中，每個(gè)株系各取1000株進(jìn)行上述生根培養(yǎng)，結(jié)果這25個(gè)株系分別有982、991、983、987、999、989、988、989、999、996、980、978、987、992、985、988、990、982、988、992、990、991、987、993、999株生根。該25個(gè)株系的生根率為98.2-99.9%。五、試管苗移栽及管理將步驟四所有生根的試管苗先在培養(yǎng)室里開蓋鍛煉3天，然后從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到6x6厘米的營(yíng)養(yǎng)缽中。移栽用的土壤為地疏松，保水性好的土壤，裝缽前，用濃度為0.1%的多菌靈進(jìn)行拌土。移栽后的前3天，大棚的相對(duì)空氣濕度保持在90-100%。之后，進(jìn)行澆水、施肥和除草等正常管理。經(jīng)過(guò)3周，苗木高度達(dá)到8-10cm，移栽到大田。結(jié)果25個(gè)株系的移栽成活率(移栽成活率=營(yíng)養(yǎng)缽中成活的株數(shù)/生根的試管苗株數(shù))分別為950、956、976、967、958、973、978、953、968、971、966、962、958、954、970、960、965、959、955、956、963、958、955、965、966。該25個(gè)株系的移栽成活率為95.0-97.1%。六、組織培養(yǎng)繁殖的中藥青蒿株系的形態(tài)和青蒿素的含量測(cè)定將步驟五中移栽至大田的幼苗定期進(jìn)行澆水、施肥和除草等正常管理，培養(yǎng)至生殖生長(zhǎng)初期。觀察植株形態(tài)、測(cè)定青蒿素的含量。其中，該25個(gè)株系每個(gè)株系各測(cè)定20株的青蒿素含量。將步驟二中取完外植體的那株母株進(jìn)行正常培養(yǎng)至種子成熟，收獲種子，將該種子作為F,代。每粒種子一個(gè)株系，將其中的24個(gè)株系在與上述組培苗相同的條件下培養(yǎng)至生殖生長(zhǎng)初期。觀察植株形態(tài)、測(cè)定青蒿素的含量。其中，青蒿素含量的測(cè)定方法如下取中藥青蒿葉片，在50。C下烘干致恒重，研成均勻粉末。準(zhǔn)確稱量l克干粉，用30ml石油醚(30-60°C)提取2次，減壓回收溶劑后，用lml甲醇溶解提取物，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定青蒿素含量。青蒿素含量(％)=(樣品中青蒿素重量/樣品重量)xioo。組培苗的田間生長(zhǎng)狀況如圖1A所示，實(shí)生苗的田間生長(zhǎng)狀況如圖1B所示，結(jié)果表明，中藥青蒿組織培養(yǎng)繁殖的試管苗，在大田栽培條件下，表現(xiàn)出形態(tài)均勻一致的特性；而中藥青蒿實(shí)生苗形態(tài)上有明顯的差異。組培苗的青蒿素測(cè)定結(jié)果如圖2A所示，實(shí)生苗的青蒿素測(cè)定結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，中藥青蒿試管苗不同株系的青蒿素含量比較一致，為1.12%±0.23%;中藥青蒿實(shí)生苗不同株系的青蒿素含量差異很大，為0.84%±0.45%。實(shí)施例2、組織培養(yǎng)快速繁殖中藥青蒿一、培養(yǎng)基的配制和滅菌初代培養(yǎng)基MS+6-BA0.1mg/L+GA0.2mg/L。增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。生根培養(yǎng)基MS+IBA0.2mg/L。以上培養(yǎng)基121.3。C下，滅菌20分鐘。二、初代培養(yǎng)取中藥黃花蒿朋/7ML.)的頂芽或腋芽,用70%(體積百分含量)的酒精浸潤(rùn)l分鐘，再放入0.1%(質(zhì)量百分含量)的升汞溶液中滅菌5-10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后，將頂芽或腋芽轉(zhuǎn)入裝有初代培養(yǎng)基的三角瓶(容量250ml)中，每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為5個(gè)。在下述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)22°C，每天14小時(shí)光照、IO小時(shí)黑暗的光照條件，光照強(qiáng)度為15001x。頂芽接種10個(gè)，腋芽接種20個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，該30個(gè)芽均長(zhǎng)出4-5個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，該30株無(wú)菌苗的高度為4.0-6.0cm，節(jié)間長(zhǎng)度為1.0-1.4cm。每一株無(wú)菌苗為一個(gè)株系。三、繼代培養(yǎng)取上述30個(gè)株系中的25個(gè)株系進(jìn)行繼代繁殖，具體方法如下將長(zhǎng)出4-5個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗剪成莖段，每個(gè)莖段帶有一個(gè)頂芽或一個(gè)腋芽，莖段長(zhǎng)1.0-1.4cm。將上述莖段接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟二。上述莖段中，每個(gè)株系帶頂芽的莖段各接種1個(gè)，帶腋芽的莖段各接種3個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出4-5個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗。該無(wú)菌苗再按照上述方法每4周繼代一次，共繼代5次。每次繼代中，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出4-5個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，無(wú)菌苗的高度為4.0-6.0cm，節(jié)間長(zhǎng)度為1.0-1.4cm。故繁殖系數(shù)為4-5。四、生根培養(yǎng)將上述25個(gè)株系繼代5次的中藥青蒿無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二。將壯苗后的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二，得到試管苗，每個(gè)株系試管苗的根長(zhǎng)2-4cm。其中，每個(gè)株系各取1000株進(jìn)行上述生根培養(yǎng)，結(jié)果這25個(gè)株系分別有934、945、958、943、965、958、932、948、955、967、953、941、935、959、943、955、938、934、953、966、952、939、937、955、945株生根。該25個(gè)株系的生根率為93.2-96.6%。五、試管苗移栽及管理以及青蒿素的含量測(cè)定方法同實(shí)施例1，結(jié)果與實(shí)施例1基本相同。實(shí)施例3、組織培養(yǎng)快速繁殖中藥青蒿一、培養(yǎng)基的配制和滅菌初代培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+GA2.0mg/L。增殖培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L。生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L。以上培養(yǎng)基121.3t:下，滅菌20分鐘。二、初代培養(yǎng)取中藥黃花蒿"rte肌'w'a朋/7朋L.)的頂芽或腋芽,用70%(體積百分含量)的酒精浸潤(rùn)l分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后，再放入0.1%(質(zhì)量百分含量)的升汞溶液中滅菌5-10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后，將頂芽或腋芽轉(zhuǎn)入裝有初代培養(yǎng)基的三角瓶(容量250ml)中，每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為5個(gè)。在下述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)30°C，每天16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗的光照條件，光照強(qiáng)度為25001x。頂芽接種10個(gè)，腋芽接種20個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，該30個(gè)芽均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，該30株無(wú)菌苗的高度為6.0-8.0cm，節(jié)間長(zhǎng)度為1.0-1.2cm。每一株無(wú)菌苗為一個(gè)株系。三、繼代培養(yǎng)取上述30個(gè)株系中的25個(gè)株系進(jìn)行繼代繁殖，具體方法如下將長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗剪成莖段，每個(gè)莖段帶有一個(gè)頂芽或一個(gè)腋芽，莖段長(zhǎng)1.0-1.2cm。將上述莖段接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟二。上述莖段中，每個(gè)株系帶頂芽的莖段各接種1個(gè)，帶腋芽的莖段各接種4個(gè)。培養(yǎng)4周時(shí)，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗。該無(wú)菌苗再按照上述方法每4周繼代一次，共繼代5次。每次繼代中，每個(gè)莖段均長(zhǎng)出5-6個(gè)節(jié)的無(wú)菌苗，無(wú)菌苗的高度為5.0-7.0cm，節(jié)間長(zhǎng)度為0.8-1.2cm。故繁殖系數(shù)為5-6。四、生根培養(yǎng)將上述25個(gè)株系繼代5次的中藥青蒿無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二。將壯苗后的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件同步驟二，得到試管苗，每個(gè)株系試管苗的根長(zhǎng)3-5cm。其中，每個(gè)株系各取1000株進(jìn)行上述生根培養(yǎng)，結(jié)果這25個(gè)株系分別有958、965、959、979、982、965、976、961、978、981、968、973、962、958、965、966、967、976、980、970、965、959、978、972、974株生根。該25個(gè)株系的生根率為98.8-98.2%。五、試管苗移栽及管理以及青蒿素的含量測(cè)定方法同實(shí)施例1，結(jié)果與實(shí)施例1基本相同。權(quán)利要求1、青蒿的組織培養(yǎng)繁殖方法，是將中藥青蒿的頂芽或腋芽在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗；所述初代培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和GA得到的培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度為0.1-2.0毫克/升，所述GA的終濃度為0.2-2.0毫克/升。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述6-BA的終濃度為0.5毫克/升；所述GA的終濃度為1.0毫克/升。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述無(wú)菌苗在增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代繁殖的步驟。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述增殖培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA得到的培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度為0.5-2.0毫克/升，所述NAA的終濃度為0.1-0.5毫克/升。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述6-BA的終濃度為1.5毫克/升；所述NAA的終濃度為0.2毫克/升。6、根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述無(wú)菌苗在生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加IBA得到的培養(yǎng)基，所述IBA的終濃度為0.2-1.0毫克/升。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述IBA的終濃度為0.5毫克/升。9、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中的培養(yǎng)條件為在22-3(TC，每天14-16小時(shí)光照、8-10小時(shí)黑暗光照條件培養(yǎng)，所述光照強(qiáng)度為1500-2500k。10、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任-所述的方法，其特征在于所述方法中的垮養(yǎng)條件為在25'C，每天16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗的光照條件培養(yǎng)，所述光照強(qiáng)度為2000k。全文摘要本發(fā)明公開了中藥青蒿的一種組織培養(yǎng)快速繁殖方法。該中藥青蒿的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，是將中藥青蒿的頂芽或腋芽在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗；所述初代培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和GA得到的培養(yǎng)基，所述6-BA的終濃度為0.1-2.0毫克/升，所述GA的終濃度為0.2-2.0毫克/升。本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)取材容易，極易獲得無(wú)菌材料，變異率低、增值系數(shù)高，4周增殖倍數(shù)能達(dá)到5～6倍，組培苗生根率達(dá)到93％以上，移栽成活率高達(dá)95％，具有很強(qiáng)的工廠化生產(chǎn)能力。利用本發(fā)明的方法繁殖高產(chǎn)中藥青蒿株系，可使后代的高青蒿素含量穩(wěn)定下來(lái)，從而提高青蒿素的產(chǎn)量。文檔編號(hào)A01H4/00GK101180952SQ20071017943公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日發(fā)明者劉本葉,葉和春,李國(guó)鳳,紅王,芳顏申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所