專利名稱：一種具有抗菌功能的飼料添加劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飼料添加劑及應(yīng)用，尤其涉及一種用基因工程技術(shù)建立的動物抗菌 肽基因載體和通過酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的飼料添加劑及應(yīng)用。
技術(shù)背景隨著我國畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化養(yǎng)殖模式的迅猛發(fā)展和環(huán)境污染情況的不斷加劇， 高密度的養(yǎng)殖使得畜禽和水生生物感染疾病的幾率越來越高，病害頻繁發(fā)生，常造成比 較大的經(jīng)濟(jì)損失。病害問題已經(jīng)成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。傳統(tǒng)上對養(yǎng)殖病害采取的 主要對策是使用抗生素及其它類型的化學(xué)藥物，這樣不可避免地帶來了細(xì)菌抗藥性和藥 物殘留的問題。大量施用抗生素，不僅造成病原體對其產(chǎn)生抗藥性，使抗生素的使用濃 度越來越高和超級抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，同時(shí)也易造成抗生素在生物體內(nèi)累積。養(yǎng)殖業(yè)廣 泛和大量使用氯霉素等抗生素，造成抗生素在畜禽和水產(chǎn)品中超標(biāo)累積，對消費(fèi)者的健 康形成威脅以至造成損害。國際上，歐盟第70、 524號令已經(jīng)規(guī)定傳統(tǒng)抗生素在限定的 時(shí)間內(nèi)將被逐漸禁止飼用，同時(shí)禁止我國抗生素超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品出口歐盟國家。為維護(hù)廣 大消費(fèi)者的身體健康，保證動物源食品的安全，我國農(nóng)業(yè)部也頒發(fā)了 "食品動物禁用的 獸藥及其它化合物清單"，傳統(tǒng)的抗生素作為飼料添加劑已面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。開發(fā)無毒 無公害的新型抗菌劑代替抗生素作為詞料添加劑已成為國際上重要的發(fā)展趨勢。我國是 畜禽和水產(chǎn)品的生產(chǎn)大國，發(fā)展和應(yīng)用新型飼料添加劑將無疑是"后抗生素時(shí)代"的出 路和發(fā)展方向。對于用高技術(shù)帶動畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及養(yǎng)殖佴料工業(yè)的行業(yè)技術(shù)進(jìn) 步，促進(jìn)高科技產(chǎn)業(yè)的發(fā)展無疑將具有巨大的推動作用?？咕氖巧矬w自身產(chǎn)生的一種能夠抵抗外界微生物、病毒等病原體侵染，具有抗 菌活性的多肽，是機(jī)體非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛存在于自然界中。由于 抗菌肽直接作用于細(xì)菌細(xì)胞膜表面使其產(chǎn)生相變和形成孔道，從而造成病菌細(xì)胞膜的損 毀，因此其作用機(jī)理有別于抗生素，不需與病菌細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，避免了細(xì)菌變異 產(chǎn)生抗藥性。抗菌肽具有殺菌活力高、作用迅速、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，是免疫防御， 殺滅病原菌的有效手段。迄今為止，已經(jīng)有包括自較為低等的動物至高等哺乳動物和人 類來源的上千種抗菌肽被分離、純化。盡管抗菌肽抗菌功效顯著，應(yīng)用前景廣闊，但天然抗菌肽在生物體內(nèi)的含量很低， 無法大量獲??；而化學(xué)合成肽價(jià)格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。利用生物工程技術(shù)生產(chǎn) 基因工程重組的具有高效殺菌效果的抗菌肽并應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，取代日益受 到禁用的抗生素就成為必然選擇。H印cidin是重要的抗菌肽家族0-defensin蛋白家族中的一員(Verga F, et al， Gene. 2005， 364: 37_44 )。是一種富含半胱氨酸的抗菌蛋白，其抗菌活性己得到多方 的證實(shí)(Krause A， et al' FEBS Lett. 2000, 480: 147 - 150; Park C H, et al， J Biol Chem, 2001， 276: 7806 - 7810)。迄今為止已經(jīng)有多種h印cidin的同源異構(gòu)體基因得 到克隆。Magainin是源自兩棲動物的另一類重要的抗菌肽家族，最初是從蟾蜍的皮膚中 分離得到的，這類抗菌肽具有ci螺旋結(jié)構(gòu)，通常是由L型兩性氨基酸組成，對革蘭氏陰 性菌、陽性菌、都有殺傷作用(Zasloff M， Proc Natl Acad Sci USA, 1987， 84:5449-5453; Barrell PJ， et al, Protein Expr Purif， 2004， 33:153-159)。這兩種抗菌肽都有非常 明確的抗菌效果。上世紀(jì)末隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，具有遺傳操作簡便，兼?zhèn)湓松锷L迅 速及真核蛋白翻譯后加工修飾的特點(diǎn)，酵母己經(jīng)成為生產(chǎn)真核異源蛋白的重要工具之 一。近年來，隨著發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展和甲醇調(diào)節(jié)型及其它各類特異性啟動子的出現(xiàn)，畢赤 酵母以其獨(dú)特的優(yōu)勢和潛力在生物工程領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。它能夠以甲醇為碳源，生 長速度快，細(xì)胞濃度高，是基因工程中外源蛋白的理想表達(dá)載體，尤其適合真核生物蛋 白的表達(dá)。畢赤酵母可以以胞內(nèi)或胞外形式表達(dá)外源蛋白，且具有穩(wěn)定性高，適應(yīng)性強(qiáng)， 易于處理，可以在廉價(jià)的非選擇性培養(yǎng)基中生長的特點(diǎn)。由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多 優(yōu)點(diǎn)，人們越來越多地利用它作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)特殊功能的目的蛋白。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料配置上，由于魚粉的高蛋白含量和優(yōu)良的營養(yǎng)組成，常作 為高蛋白飼料的主要來源，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，魚粉供應(yīng)緊缺，價(jià)格年年上漲， 解決蛋白飼料尤其是魚粉飼料的不足，已經(jīng)成為世界各國關(guān)注的焦點(diǎn)之一。開發(fā)利用具 有優(yōu)良營養(yǎng)組成，蛋白質(zhì)含量高，適用于集約化生產(chǎn)和自動化管理的酵母類飼料添加劑， 開發(fā)以基因工程構(gòu)建的新型具有免疫、抗菌功能的飼料添加劑替代魚粉和抗生素將具有 重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用基因工程技術(shù)建立的動物抗菌肽基因載體和通過酵母 表達(dá)系統(tǒng)獲得的詞料添加劑及應(yīng)用，以期利用其高蛋白質(zhì)含量和免疫、抗菌功能替代魚 粉和抗生素。本發(fā)明所述的具有抗菌功能的飼料添加劑，其特征在于它是由經(jīng)過修飾的魚類抗菌肽h印cidin和兩棲動物抗菌肽magainin所組成的融合蛋白，所述融合蛋白含有SEQ ID NO: l所示氨基酸序列的短肽。或者，本發(fā)明的具有抗菌功能的詞料添加劑是基因組中包含有SEQ ID NO: 2所示 核苷酸序列的畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母之一或其任意比例的組合，其中所述酵 母菌數(shù)不少于5X104cfu/g，含水量《10%。優(yōu)選的，上述酵母為畢赤酵母GS115。上述融合蛋白的基因，即SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列由編碼魚類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列、編碼兩棲動物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限 制性內(nèi)切酶EcroR I位點(diǎn)的cDNA序列以及符合真核生物表達(dá)偏好性的基因序列組成。本發(fā)明所述飼料添加劑在制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料中的 應(yīng)用。其中所述詞料添加劑直接作為增強(qiáng)免疫、抗菌功能添加劑添加到水生生物或畜禽詞料中，添加比例量為基礎(chǔ)詞料重量的5% 25%。優(yōu)選的，所述飼料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)詞料重量的10% 20%。 本發(fā)明將魚類的抗菌肽和兩棲動物的抗菌肽組成新型的融合蛋白，使用基因工程的手段構(gòu)建含融合蛋白cDNA序列的表達(dá)載體并整合至酵母基因組進(jìn)行表達(dá)，獲得了具有抗菌功能更強(qiáng)的融合蛋白。其表達(dá)產(chǎn)物即為本發(fā)明的具有抗菌功能的飼料添加劑，可以應(yīng) 用于水生生物或畜禽動物養(yǎng)殖中；也可以通過純化或濃縮的方法，得到高純度的融合蛋
白，直接作為抗生素的替代品用于生物的病害防治，細(xì)菌性甚至病毒性疾病的治療。同時(shí)，本發(fā)明將酵母特別是畢赤酵母作為畜禽和水生生物的飼料添加劑，為飼養(yǎng)生 物提供了抗菌肽和豐富的蛋白質(zhì)、維生素、微量元素和其它生物活性物質(zhì)。酵母菌是單細(xì)胞真菌，表達(dá)抗菌肽的酵母由于其本身很高的營養(yǎng)價(jià)值可以直接作為 飼料添加劑的主要成分。其干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量可高達(dá)50%，其中賴氨酸的含量高于大 豆，接近動物蛋白；色氨酸的含量比大豆高7倍以上。此外，酵母還含有維生素A、 B、 C、 E、胡羅卜素、生物素、膽堿、葉酸、煙酸、視黃醇以及鈣、鎂、鉀、硒等微量元素 以及其它生理活性物質(zhì)，作為多維高蛋白活性飼料被廣泛使用。酵母作為飼料原料不僅 可以大幅提高飼料的蛋白質(zhì)水平，其本身還含有豐富的酶類，如蛋白酶、淀粉酶和纖維 素酶等，這些酶類可以通過胞外分泌或細(xì)胞壁裂解后產(chǎn)生。因此，作為飼料添加劑的酵 母還可以加強(qiáng)畜禽和水生生物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，提高消化率達(dá)80% 90%。促進(jìn)養(yǎng) 殖生物的生長，增進(jìn)其食欲，并增強(qiáng)抵抗疾病和抗應(yīng)激的能力。占整個(gè)細(xì)胞千重的20% 30%的酵母細(xì)胞壁還含有e-葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和幾丁質(zhì)等可作為免疫促進(jìn)劑的 活性成分，這些物質(zhì)在維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞與細(xì)胞間的識別中起重要作用。如甘露寡糖和e-葡聚糖可以發(fā)揮幼齡動物的生長潛力，改善動物健康，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體免疫力；甘露寡糖能吸附腸道病原菌及其細(xì)菌毒素，調(diào)節(jié)非特異性免疫防御機(jī)制，激活機(jī)體體液 和細(xì)胞免疫機(jī)制。此外，酵母的發(fā)酵生產(chǎn)工藝比較簡單， 一般接種] 3h后就可繁殖一 代，具有生產(chǎn)速度快，生產(chǎn)周期短的特點(diǎn)，很適合大規(guī)模地用于養(yǎng)殖飼料添加劑的生產(chǎn)。本發(fā)明中，由于酵母的基因組含基因工程構(gòu)建的抗菌肽融合蛋白cDNA序列，可以表 達(dá)具有良好抗菌活性的由魚類抗菌肽和兩棲動物抗菌肽組成的新型融合蛋白。因此其作 為畜禽和水生生物的詞料時(shí)，在提供蛋白質(zhì)和其它豐富的營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還具有良好 的抗菌效果，增加了飼養(yǎng)生物的免疫抗病機(jī)能，并且還可替代抗生素用于畜禽、水生生 物有耐藥性的細(xì)菌性疾病進(jìn)行防治。本發(fā)明所述融合蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于含有外源融合蛋白cDNA的酵 母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體PA0815或其它類型的酵母表達(dá)載體，以及利用載體使融合蛋O基因 在畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母或其它可食性酵母中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)。它的 步驟為…表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成的抗菌融合蛋白cDNA序列上設(shè)計(jì)有限制性內(nèi)切酶的酶 切位點(diǎn)，融合蛋白cDNA序列和Invitrogen公司的酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pA0815酶切后 鏈接在一起，通過PCR反應(yīng)檢測融合蛋白基因插入的方向，篩選出含有正向插入的融合 蛋白基因的克隆。酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒，使其線性化，通過電 擊轉(zhuǎn)化的方法，將融合蛋白cDNA序列整合到酵母的基肉組中。將轉(zhuǎn)化后的菌體懸液涂 布于MD平板上，3(TC培養(yǎng)，誘導(dǎo)篩選直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，將其作為模板， 通過PCR反應(yīng)確認(rèn)陽性克隆。具體的，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于外源融合蛋白cDNA的酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 載體pA0815 (Invitrogen， USA)，以及利用這種載體使融合蛋白基因在畢赤酵母GS115 中表達(dá)。表達(dá)載體通過設(shè)計(jì)有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，將融合蛋白cDNA序列和pA0815 質(zhì)粒酶切后鏈接在一起，經(jīng)篩選出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆，命名為pA0815-antibac質(zhì)粒。并通過電擊轉(zhuǎn)化的方法，將其整合到酵母GS115的基因組中。經(jīng) 挑選含pA0815-antibac的菌落，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外誘導(dǎo)表達(dá)及活性檢測。表達(dá)產(chǎn)物抗菌活性的檢測方法如下挑選陽性克隆菌落，于3(TC培養(yǎng)，收集菌體，用含有甲醇的培養(yǎng)基重懸菌體，使外 源基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá)。如使用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體，收集菌體，破碎細(xì)胞后取得蛋白粗提 液。如使用細(xì)胞外表達(dá)載體，收集細(xì)胞培養(yǎng)液后通過硫酸鉸沉淀、離子交換層析和凝膠 層析純化，通過聚丙烯酰銨凝膠電泳分離得到電泳純的融合蛋白。通過在培養(yǎng)皿上涂布融合蛋白粗提液并同時(shí)接種大腸桿菌DH5a 、鰻弧菌、溶藻弧 菌等種類致病菌，進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，或是通過在上述致病菌培養(yǎng)液中添加融合蛋白粗提 液，檢測八600吸光值來檢測其抗菌活性。本發(fā)明的有益效果是(1) 提供一種蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富、富含動物抗菌肽的酵母飼料添加劑。(2) 在養(yǎng)殖中用動物自身的抗菌肽取代抗生素，徹底角科夫禽畜7j^口口pft^mfitt示的問題。(3) 用高技術(shù)帶動養(yǎng)殖業(yè)以及養(yǎng)殖餌料工業(yè)的行業(yè)技術(shù)進(jìn)步。(4) 向社^fftfilll的Sfe7乂產(chǎn)品和禽S^品。


圖1.魚類h印cidinl precursor基因的克隆。圖2.表達(dá)融合蛋白cDNA的載體pA0815 — antibac質(zhì)粒。圖3. pA0815-antibac陽性克隆的檢測。圖4.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對大腸桿菌的抑菌效果。 圖5.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對鰻弧菌的抑菌效果。 圖6.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗菌融合蛋白對溶藻弧菌的抑菌效果。其中圖4 6中1X、2X、3X為不同濃度的抗菌融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液， O為對照(表達(dá)0-Gal的酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液)。
具體實(shí)施方式
下面以實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明內(nèi)容做進(jìn)一步說明1. 大菱鲆肝臟cDNA的制備大鯪鲆注射鰻弧菌感染24h后，取出肝臟，速速放于 液氮中，將硬的組織塊置于一8(TC冷凍保藏。參照TRIZOLS試劑操作說明，取大鯪鲆組 織約100mg，加入到lml TRIZ0L試劑中，置室溫下勻化5分鐘之后，加入200W氯仿劇 烈振蕩15秒，室溫下溫育3min。 4'C條件下以12, 600rpm轉(zhuǎn)速離心15 min。獲取界面 上層液體加入25(￥1以0. 8M乙酸鈉和1. 2M氯化鈉組成的高濃度鹽溶液，混勻后再加入 250W異丙醇混勻，丁室溫下沉淀10 nun，再在4。C以12, 600rpm轉(zhuǎn)速離心10 min。移 去上清后用lml 70%乙醇漂洗沉淀，以ll，OOOrpm轉(zhuǎn)速4。C離心5 min。以20WDEPC 處理過的雙蒸水(無RNase) 55'C溶解RNA沉淀10 min后，取2. Oug總RNA，加入 50pM的隨機(jī)引物，以DEPC水稀釋至17. lri。 70°C 5 min破壞RNA 二級結(jié)構(gòu)后置冰上驟 冷。依次加入5"1 M-MLV5X轉(zhuǎn)錄緩沖液，U10mMdNTP， 24U rRNA酶抑制劑和200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。于42'C反應(yīng)lh后在94'C維持5 min終止反應(yīng)，于4'C保藏。2. 大菱鲆h印cidinl precursor抗菌肽基因的克隆和序列分析以大菱鲆肝臟cDNA
為模板，使用引物 W朋sp ( 5—-CAAACCCTCCTAAGATGAAG-3 ) ， WBHap (5'-AATCCTCAGAACCTACAGCA-3~ )進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)退火溫度為52°C， 30個(gè)循環(huán)得 到大約300bp的PCR條帶(見圖l)。得到的PCR產(chǎn)物使用凝膠電泳試劑盒回收，經(jīng)測 序證實(shí)，該序列全長293bp，包括完整的編碼區(qū)，其中開放閱讀框長273bp，編碼90個(gè) 氨基酸，詳見GenBank序列號AM113708。。通過NCBI的Blastn服務(wù)器對核酸序列進(jìn) 行同源相似性比對。同源相似性較高的序列多為Il印cidin家族的基因序列，其中與牙鲆 的同源相似性為90%「尸5ewd0s"'se朋 crocea(DQ307050)]，與白鱸的同源相似性為 84% [y!/ora/ e c/wrs，s (AF394246)]，與黑鯛的同源相似性為83% [^朋t力o/^g77/s scA76^eh'i(AY669380)]。確定該序列為大菱軤h印cidinl precursor基因。使用signalP 月艮務(wù)器予頁測hepcid丄r]l precursor蛋白序列的4言號月太區(qū)域，hepcidinl precursor蛋白 序列中C端24個(gè)氨基酸為信號肽。使用軟件0miga2. 0預(yù)測h印cidinl precursor蛋白 序列的二級結(jié)構(gòu)，h印cidinl precursor的蛋白序列中N端21個(gè)氨基酸為{3 -折疊結(jié)構(gòu)， 而這部分序列包含八個(gè)半胱氨酸。H印cidin蛋白家族成熟肽的最顯著的特征就是由這八 個(gè)半胱氨酸形成的13-折疊結(jié)構(gòu)，這符合h印cidin蛋白家族的特征。比較鱸魚、斑馬魚 H印cidin成熟肽，從而得出大菱鲆h印cidinl precursor的成熟肽具有21個(gè)氨基酸。3. 融合蛋白cDNA的設(shè)計(jì)與制備融合蛋白cDNA序列由編碼魚類h印cidinl precursor成熟肽的基因序列、編碼兩棲動物抗菌肽Magainin成熟肽的基因序列、限制 性內(nèi)切酶EcroR I位點(diǎn)的序列以及符合真核生物表達(dá)偏好性，同時(shí)符合Kozak規(guī)則的基 因序列組成。進(jìn)行基因工程修飾的位點(diǎn)描述如下(l)第4位的偏好堿基為G; (2)ATG 的5'端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T; (3)在-3， -6和-9位置，G是偏好堿基 (4)除-3， -6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。所以融合蛋白基因序列編碼 的蛋白序列是由h印cidinl precursor和Magainin的兩段成熟肽序列經(jīng)基因工程方法 優(yōu)化設(shè)計(jì)修飾組成。使用固相亞磷酸酰胺法人工合成這段基因序列，序列長151bp (見 SEQIDN0: 2所示的核苷酸序列)，編碼39個(gè)氨基酸，后續(xù)構(gòu)建的酵母表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá) 的蛋白就是這個(gè)含有39個(gè)氨基酸的短肽(見SEQ ID NO: l所示氨基酸序列)。4. 酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及抗菌活性檢測人工合成的抗菌融合蛋白基因序列上設(shè) 計(jì)有限制性內(nèi)切酶EcroRI的酶切位點(diǎn)，酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒載體pA0815同樣具有 EcroR 1的單酶切位點(diǎn)，融合蛋白基因和pA0815質(zhì)粒酶切后具有同樣的粘性末端。使用 EcroR I分別酶切融合蛋白基因和PA0815質(zhì)粒，使用凝膠電泳回收試劑盒分別冋收酶切 后的產(chǎn)物。使用DNA Ligation Kit試劑盒進(jìn)行連接，取融合蛋白基因11W加入pA0815 載體2W連接緩沖液2.5ri、連接酶4.5Ml， 16。C連接過夜。使其鏈接在一起，并導(dǎo)入 到大腸桿菌DH5a巾。使用引物HMsp (5—-GGACAGCCACATCTCCCTTT-3、)和HMap (5'-GTGCGAATTCTCAGAACTTC-3')，以轉(zhuǎn)化后人腸桿菌DH5 a菌懸液為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)， 退火溫度53'C，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。連接產(chǎn)物檢測融合蛋白基因插入的方向。如果融合蛋 白基因正向插入到質(zhì)粒pA0815中則會出現(xiàn)大約130bp的PCR條帶，如果融合蛋白基因 反向插入則不會出現(xiàn)PCR條帶。篩選出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。將得到的 表達(dá)載體命名為pA0815-antibac質(zhì)粒(圖2)。將該質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，使其形成 多克隆。制備pA0815-antibac質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切質(zhì)粒，使其線性化。 將約20化的線性化pA0815-antibac質(zhì)粒溶液與8(M的GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至 0. 2ml冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min后使用電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化。條件為
電壓1. 5kV,電擊10msec，使外源基因整合到酵母GS115的基因組中。轉(zhuǎn)化后將菌體加 入lml冰預(yù)冷的lmol山梨醇溶液混勻，轉(zhuǎn)至1. 5ml的EP管中。轉(zhuǎn)化后的菌體懸液隨后 均勻涂布于MD平板上于3(TC培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。挑取單菌落，將其作為模板， 使 用 引 物 5、A0X (5、-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3、) 和 3'A0X (5—-GCAAATGGCCATTCTGACATCC-3')，通過PCR反應(yīng)篩選具有pA0815-antibac的陽性克 隆。整合融合蛋白cDNA序列的陽性克隆出現(xiàn)600bp左右的PCK條帶(圖3)。挑選含 pA0815-antibac的菌落，置于裝有25ml腦GY培養(yǎng)基的搖瓶中，于3(TC培養(yǎng)至菌液的 。D, = 2, 0。收集菌體，用B廳Y重懸菌休，使OD'")() =1. 0左右。所得的菌液置于1L的 搖瓶中，放置于30'C培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至終濃度為0. 5%培養(yǎng)至0Dfi。。 :3. 0。收集菌體，破碎細(xì)胞后取得蛋白粗提液，其中富含融合蛋白。也可以將蛋白粗提液 用梯度硫酸銨沉淀，然后將沉淀收集溶于磷酸緩沖液后，分別經(jīng)離子交換層析和凝膠層 析處理，得到電泳純的融合蛋白。同時(shí)，以同樣條件下培養(yǎng)的，可以表達(dá)P-Gal的酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白粗體液作為對照。5. 抑菌試驗(yàn)在涂布有大腸桿菌、鰻弧菌或溶藻弧菌的平板培養(yǎng)皿上滴加不同濃度 的酵母蛋白粗提液或經(jīng)過純化的融合蛋白。將培養(yǎng)皿至于37'C過夜培養(yǎng)，次日觀察并記 錄抑菌效果。上述富含融合蛋Cl的粗提液和經(jīng)過純化的融合蛋白，均表現(xiàn)有抗菌活性(結(jié)果見圖 4 6)。6. 飼料免疫添加劑的制備與應(yīng)用使用100L發(fā)酵罐，于30'C下擴(kuò)大培養(yǎng)基因組中 包含有SEQIDN0: 2所示核苷酸序列的畢赤酵母GS115，通過發(fā)酵液中添加0. 5 %甲醇 誘導(dǎo)抗菌融合蛋白基因的表達(dá)，經(jīng)3 — 5天培養(yǎng)，經(jīng)過濾后，得到大量具有表達(dá)抗菌活 性融合蛋白的GS115酵母，所述酵母菌數(shù)不少于5X10Vfu/g，含水量《10%。以常規(guī)方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚粉、骨粉為水生生物或養(yǎng)殖畜禽的基 礎(chǔ)飼料，將上述獲得的酵母菌作為詞料添加劑，直接添加于上述水生生物或養(yǎng)殖畜禽的 基礎(chǔ)飼料中混合，所述飼料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)飼料重量的20% (可相應(yīng)減少魚粉 或其它蛋白質(zhì)飼料的用量)，使混有添加劑的基礎(chǔ)伺料的最終營養(yǎng)成分中粗蛋白>35%、 粗脂肪5=3%、粗纖維5;3%、粗灰分》15%、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，制得 具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽詞料?；蛘撸曰A(chǔ)飼料重量5% 25%的添加比例量直接將上述所得發(fā)酵全液用于畜禽和 水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的喂養(yǎng)。7. 融合蛋白作為飼料添加劑的應(yīng)用以上述方法將含融合蛋白分泌型表達(dá)載體的 酵母，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，再經(jīng)常規(guī)沉淀、離心、脫鹽、層析等步驟得到獸藥級 的含有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的融合蛋白。以常規(guī)方式選擇玉米粉、糠、麩皮、豆餅、魚粉、骨粉為水生生物或養(yǎng)殖畜禽的基 礎(chǔ)飼料，將上述獲得的融合蛋白作為飼料添加劑，直接添加于上述水生生物或養(yǎng)殖畜禽 的基礎(chǔ)飼料中混合，所述飼料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)飼料重量的10%,使混有添加劑 的基礎(chǔ)飼料的最終營養(yǎng)成分中粗蛋白》35%、粗脂肪》3%、粗纖維》3%、粗灰分》15%、鈣》2%、磷》1%、賴氨酸》1.8%，制得具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽 伺料?；蛘?，將上述獲得的融合蛋白直接作為抗菌藥物，以常規(guī)用藥量應(yīng)用于水生生物或 其它養(yǎng)殖禽畜疾病的防治。
序列表〈110〉國家海洋局第一海洋研究所〈120〉一種具有抗菌功能的詞料添加劑及應(yīng)用〈141〉2007-9-11〈歸2〈210〉1〈211〉39<212〉PRT<213〉人工序列<400〉1Met Asp Ser His lie Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys 5 10 15Lys Ala Tyr Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe Gly lie Gly20 25 30Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe35〈210〉2<211>151〈212〉c腿〈213>魚類h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列&編碼兩棲動物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列<400>2ccctxgaatt cgccgccacc atggacagcc acatctccct ttgccgctgg tgctgcaact 60 gctgcaaggc ctacaagggc tgtggcttct gctgtaggtt cggcattggc aagttcctgc 120 actctgccaa gaagttctga gaattcgcac c 15權(quán)利要求
1.一種具有抗菌功能的飼料添加劑，其特征在于它是由經(jīng)過修飾的魚類抗菌肽hepcidin和兩棲動物抗菌肽magainin所組成的融合蛋白，所述融合蛋白含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的短肽。
2. —種具有抗菌功能的詞料添加劑，其特征在于它是基因組中包含有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母之一或其任意比例的組合，其中 所述酵母菌數(shù)不少于5X 104cfu/g，含水量《10%。
3. 如權(quán)利要求3所述具有抗菌功能的飼料添加劑，其特征在于所述酵母為畢赤酵 母GS115。
4. 權(quán)利要求1或2所述飼料添加劑在制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽 飼料中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述詞料添加劑直接作為增強(qiáng)免疫、抗 菌功能添加劑添加到水生生物或畜禽飼料中，添加比例量為基礎(chǔ)詞料重量的5% 25%。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述飼料添加劑添加比例量為基礎(chǔ)飼料 重量的10% 20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗菌功能的飼料添加劑及其應(yīng)用。所述飼料添加劑是由經(jīng)過修飾的魚類抗菌肽hepcidin和兩棲動物抗菌肽magainin所組成的融合蛋白，其中融合蛋白含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的短肽；或者所述飼料添加劑是基因組中包含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的畢赤酵母、釀酒酵母、假絲酵母之一或其任意比例的組合，其中所述酵母菌數(shù)不少于5×10⁴cfu/g，含水量≤10％。本發(fā)明所述飼料添加劑能替代抗生素廣泛用于制備具有病害防治功能的水生生物或養(yǎng)殖畜禽飼料。
文檔編號A23K1/17GK101164431SQ20071011386
公開日2008年4月23日 申請日期2007年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日
發(fā)明者叢柏林, 劉晨臨, 劉勝浩, 林學(xué)政, 黃曉航 申請人:國家海洋局第一海洋研究所